Aprendizagem avançada stress medo, um modelo robusto de roedor do transtorno de estresse pós-traumático

Resumo

Aqui descrevemos a metodologia detalhada necessária para realizar experiências de aprendizagem (Autoprodutores) medo stress avançado, um modelo pré-clínicos de transtorno de estresse pós-traumático, em ratos e camundongos. O modelo utiliza aspectos do pavloviano medo condicionado e congelar-se como um índice do medo reforçado em roedores.

Resumo

Comportamentos de medo são importantes para a sobrevivência, mas desproporcionalmente altos níveis de medo podem aumentar a vulnerabilidade para o desenvolvimento de distúrbios psiquiátricos como transtorno de estresse pós-traumático (TEPT). Para entender os mecanismos biológicos da desregulação de medo no TEPT, é importante começar com um válido modelo animal da doença. Este protocolo descreve a metodologia necessária para realizar experiências de aprendizagem (Autoprodutores) medo stress avançado, um modelo pré-clínicos de PTSD, em ratos e camundongos. Autoprodutores foi desenvolvido para recapitular aspectos críticos de stress pós-traumático, incluindo a sensibilização a longo prazo da aprendizagem de medo causada por um estressor agudo. Aspectos de usos de Autoprodutores pavloviano medo condicionado mas produz uma resposta de medo sensibilizadas distintas e robusta muito maior do que o normal medo condicional respostas. O procedimento de trauma envolve a colocação de um roedor em uma câmara de condicionamento e administrar 15 choques sinalizados aleatoriamente distribuídos mais de 90 minutos (para experimentos de rato; para experimentos de rato, 10 sinalizado são utilizados choques aleatoriamente distribuídos mais de 60 minutos) . No dia 2, roedores são colocados em um romance de condicionamento contexto onde recebem um único choque; Então, no dia 3 são colocados no mesmo contexto como no dia 2 e testados para alterações em níveis de congelamento. Roedores que anteriormente receberam a exibição de trauma maior níveis de congelamento no teste dia comparado àqueles que receberam sem choques, no primeiro dia. Assim, com este modelo, uma experiência altamente estressante (trauma) produz medo extremo dos estímulos associados com o evento traumático.

Introdução

O medo é um comportamento crítico para a sobrevivência, permitindo que os indivíduos a reconhecer e responder às ameaças. No entanto, respostas de medo exagerado podem contribuir para o desenvolvimento de distúrbios psiquiátricos como transtorno de estresse pós-traumático (TEPT). Uma característica de stress pós-traumático é uma resposta exagerada a estressores suaves, particularmente aqueles que relembram o trauma original e uma tendência a desenvolver novos medos^1,2. No laboratório, o medo é medido frequentemente através de congelamento de comportamento, que é um índice confiável e ethologically válido do medo em humanos e roedores de^3,4. Enquanto é sabido que a PTSD envolve dysregulation do medo e o medo maior expressão, há uma falta de modelos animais robustos de PTSD que confiantemente capturar este medo aumentada resposta a um estímulo relativamente inócuo.

Este protocolo fornece a metodologia detalhada necessária para realizar experiências de aprendizagem (Autoprodutores) medo stress avançado, um robusto e confiável modelo pré-clínicos de PTSD, em ratos e camundongos. Autoprodutores utiliza aspectos da pavloviano medo condicionado, ainda produz respostas distintas de condicionamento do medo normal e recapitula o medo reforçado seguir stress traumático observada em PTSD pacientes^5,6. Neste modelo, uma experiência altamente estressante (aqui referida como trauma) leva à duração de mudanças comportamentais, incluindo medo extremo de estímulos associados com o evento traumático, aumentou a ansiedade, aumentou a reatividade de alarme e alterado glicocorticoide sinalização^7,8. A principal característica dos Autoprodutores é que seguir a exposição a um estressor traumático (uma série de choques sinalizados) num contexto distinto, animais mostram uma resposta de medo exagerado a um estressor suave (ex., um único choque) em um contexto diferente. Importante, o efeito de Autoprodutores não é devido a generalização do contexto de trauma para o contexto de novela ou choque maior sensibilidade⁵. Em nosso modelo, utilizamos propositadamente procedimentos que reduzam a qualquer generalização para um contexto de novela como padrão distinto dos transportes, o odor e grade de piso. Portanto, ao contrário do normal medo condicionado, Autoprodutores é um processo não-associativa que leva a uma nova aprendizagem de medo que é desproporcionalmente relacionada com pistas ambientais não diretamente associadas com a experiência traumática. Extenso trabalho mostra que uma única sessão de 90 minutos contendo 15 choques imprevisíveis em ratos (ou uma única sessão de 60 minutos, contendo 10 choques imprevisíveis em camundongos) induz uma sensibilização de longa duração de medo condicionado junto com ansiedade aumentada e desregulagem no ritmo circadiano do corticosterona basal. Em contraste, pré-exposição a um único footshock não produz Autoprodutores⁹. Além disso, Autoprodutores podem ser utilizado com fiabilidade em ratos e camundongos.

Portanto, o modelo de Autoprodutores de stress pós-traumático é uma ferramenta poderosa para sondar os mecanismos biológicos envolvidos na fisiopatologia de PTSD. Usando Autoprodutores, pesquisadores podem examinar como a exposição a um trauma pode afetar a aprendizagem de medo do futuro. Além disso, este modelo pode ser útil para investigar os mecanismos celulares e moleculares específicos que podem estar envolvidos na regulação da expressão de medo reforçada como observado no TEPT.

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Protocolo

1. temas

1. Ratos
   1. Ordem de ratos a chegar quando eles são aproximadamente 90 dias velhos e single-alojados em gaiolas de rato padrão.
      Nota: É aconselhável alojamento simples, como o alojamento em grupo produz variabilidade devido a interações entre os animais na jaula para casa, particularmente após a exposição de estresse. Autoprodutores foi demonstrada em ratos machos e fêmeas, em Long-Evans e ratos Sprague Dawley e em ratos com 19 dias de idade^7,10.
   2. Atribuir aleatoriamente animais pelo menos duas condições: trauma (n = 8) e nenhum trauma (n = 8) (ver Rao et al. ⁵ para as condições de controle adicionais).
2. Ratos
   1. Ordem de ratos a chegar quando eles são aproximadamente 60 dias velhos e single-alojados em gaiolas de mouse padrão. Single-casa os ratos durante pelo menos 4 semanas antes do trauma, bem como durante toda a duração do experimento.
   2. Atribuir aleatoriamente animais pelo menos duas condições: trauma (n = 8) e nenhum trauma (n = 8).

2. equipamento instalação

1. Configurar um conjunto de câmaras de medo condicionado para servir de contexto A e um segundo conjunto de medo condicionado câmaras para servir como contexto B (veja a Tabela de materiais). Coloque cada câmara de medo-condicionado dentro de um cubículo de som-atenuantes para evitar a intromissão de ruído exterior (veja a Tabela de materiais).
   1. Certifique-se de que um método de iluminando as câmaras com luz visível (por exemplo, uma luz de casa branca sobrecarga) está presente nas câmaras servindo como contexto uma (veja a Tabela dos materiais).
   2. Certifique-se de que diferentes soluções estão disponíveis para limpar as câmaras entre cada animal e fornecer odores diferentes para cada câmara (EG., diluído em solução e 1% de ácido acético de limpeza).
      Nota: É fundamental que os odores gerados pelo animal ser eliminada¹¹.
   3. Coloca inserções de plástico no contexto B para diferenciar o layout interno dos dois contextos. Recomenda-se uma inserção triangular de acrílico preta. Como alternativa, usar uma folha de plástico branca para criar uma parede de fundo curvada (veja a Tabela de materiais).
   4. Coloque pisos de grade em cada medo condicionado câmara para entrega de footshock, usando um padrão de grade diferente para cada contexto para diferenciar textura de piso entre contextos (ver Tabela de materiais).
      Nota: Grade suficientemente distintos padrões incluem grades planas (todas as barras dispostas em um único plano horizontal), cambaleou grades (barras dispostas em dois planos horizontais offset) e alternando grades (barras dispostas em um único plano horizontal, mas de diferentes diâmetros).
   5. Coloque panelas de metal limpa debaixo de cada piso de grade para recolher fezes. Perfume panelas com solução de limpeza (ver Tabela de materiais).
2. Fornece o sincronismo exato e a amplitude da entrega de footshock para cada contexto.
   1. Conecte um gerador de choque e codificador capaz de entregar 1 mA ou choques de amplitude mais baixos para cada piso de grade para a entrega de footshock (ver Tabela de materiais).
      Nota: Os geradores de choque e misturadores devem ser posicionadas fora o som atenuando a câmara, com cabos que ligam os geradores e o codificador aos andares através de aberturas no som atenuantes câmara grade. Isto evitará danos devido à mastigação, limpeza, solução, etc.
   2. Use um multímetro para testar a corrente sendo entregue pelo gerador de choque colocando cada sonda em um bar diferente do piso de grade e confirmando que a amplitude desejada de choque é produzida (veja a Tabela de materiais).
   3. Certifique-se de que um método para controlar o tempo e a amplitude da entrega de choque (por exemplo, software de computador) está disponível (veja a Tabela dos materiais).
3. Certifique-se de que um método de gravação de vídeo cada animal durante cada sessão experimental está disponível (veja a Tabela dos materiais).
   Nota: Será necessário gravar 1) quando as câmaras são iluminadas por luz visível e 2) quando as câmaras são escuras. Este último pode ser realizado ou usando uma câmera de visão noturna ou iluminando e gravação das câmaras escuras usando luz infravermelha ou infravermelho.
4. Certifique-se de que um método distinto de transportar animais provenientes do viveiro para o contexto B está disponível para diferenciar ainda mais os dois contextos.
   Nota: Enquanto métodos como uma banheira de plástico preta (38 x 30 x 24 cm) dividido em quatro compartimentos ou gaiolas limpas vazias tem sido utilizadas com sucesso, pode ser usada qualquer outra caixa de transporte que é distintamente diferente da gaiola em casa.

3. Autoprodutores procedimento para ratos e camundongos

1. Lidar com todos os roedores diariamente delicadamente removendo-os da homecage e mantendo cada um por 60-90 segundos pelo menos 7 dias antes de iniciar o procedimento de Autoprodutores.
2. No dia 1 do procedimento de Autoprodutores, coloque temas no contexto A, onde receberão o estressor traumático.
   1. Configurar o contexto A com um único conjunto de pisos de grade (EG., plano de grades) e iluminar as câmaras com luz visível.
   2. Use um multímetro para testar a corrente sendo entregue pelo gerador de choque colocando cada sonda em um bar diferente do piso de grade e confirmando que a amplitude desejada de choque é produzida.
      Nota: Danos ou corrosão das barras pode resultar na entrega de choque fraco ou irregular. Líquidos, incluindo urina tocando a grade ao longo da parede também podem afetar entrega de choque.
   3. Limpar as paredes da câmara e as portas e pulverizar as panelas debaixo do piso de grade com uma solução (EG., diluída em solução de limpeza).
      Nota: É necessário eliminar odores de animais anteriores.
   4. Animais de transporte desde o viveiro à sala experimental nas jaulas em casa colocada em um carrinho e lugar individualmente nas medo condicionado câmaras. Só trazer uma rodada de animais (determinado pelo número de medo condicionado câmaras) para a sala de experiência de cada vez.
      Nota: Para evitar confunde devido a ordem ou o tempo, cada rodada deve conter animais em trauma e sem condições de trauma.
   5. Para experimentos de rato, use o gerador de choque e misturadores para entregar 15 1-s, 1-mA footshocks aleatoriamente apresentadas mais de 90 minutos (média ISI = 6 min) através das barras da grade das câmaras contendo temas de condição de trauma. Expor as controles sem trauma para o mesmo contexto por 90 minutos sem entrega de choque.
   6. Para experimentos de rato, use o gerador de choque e misturadores para entregar 10 1-s, 1-mA footshocks aleatoriamente, apresentadas mais de 60 minutos (média ISI = 6 min) através o chão de grade das câmaras contendo temas de condição de trauma. Expor as controles sem trauma para o mesmo contexto por 60 minutos sem entrega de choque.
   7. Após 90 minutos (experimentos de rato) ou 60 minutos (experimentos de rato), retornar todos os animais para seus homecages e devolver imediatamente para o viveiro.
3. No dia 2 do processo de Autoprodutores, avalie o medo para o contexto de trauma, se desejado.
   1. Configure o contexto A como feito em 1 dia.
   2. Transporte de animais para a sala de experiências nas jaulas em casa como no dia 1.
   3. Lugar de animais no contexto A 8 minutos sem entrega de choque e vídeo gravar o comportamento durante toda a sessão.
   4. Após 8 minutos, retornar todos os animais para seus homecages e devolver imediatamente para o viveiro.
4. No dia 3 do procedimento de Autoprodutores, expor todas as disciplinas para o estressor suave no contexto B.
   Nota: Este procedimento pode ocorrer em qualquer lugar de 24 horas a 90 dias após o estressor traumático⁹.
   1. Configurar o contexto B com um conjunto diferente de pisos de grade dos usados no contexto A (por exemplo, alternadas ou escalonada pisos de grade) e preto, branco ou triangular curvada inserções de Plexiglas. Não iluminar as câmaras com luz visível; embora, luz infravermelha ou infravermelho pode ser usado, se necessário.
   2. Use um multímetro para testar a corrente sendo entregue pelo gerador de choque colocando cada sonda em um bar diferente do piso de grade e confirmando que a amplitude desejada de choque é produzida. Use um multímetro para testar a corrente sendo entregue pelo gerador de choque colocando cada sonda em um bar diferente do piso de grade e confirmando que a amplitude desejada de choque é produzida.
      Nota: Danos ou corrosão das barras pode resultar na entrega de choque fraco ou irregular. Líquidos, incluindo urina tocando a grade ao longo da parede também podem afetar entrega de choque.
   3. Limpar as câmaras e pulverizar as panelas debaixo do piso de grade com a solução não é usada no contexto A (ex., 1% de ácido acético).
   4. Transporte de animais do viveiro para a sala experimental em um método distinto do método de usado para o contexto de uma (por exemplo, uma banheira de plástico preta) e colocá-los individualmente em medo condicionado câmaras. Apenas trazer um valor do rodada de animais para a sala de experiências em um tempo (determinado pelo número de medo condicionado câmaras).
   5. Expor todos os animais ao estressor suave (descrito abaixo) e congelação de gravar vídeo e atividade durante a sessão.
      1. Após um período de 180-s da linha de base, entrega um único 1-s, 1-mA footshock (ratos) ou um único 2-s, 1-mA footshock (ratos) para todos os animais.
         Nota: Certifique-se que, durante o período de base de 180-s congelamento não deve exceder 5%¹².
      2. Remover todos os animais 30 segundos após a entrega de choque e prontamente retornar ao viveiro.
5. No dia 4 do procedimento de Autoprodutores, teste de medo ao contexto estressor suave.
   1. Configura o contexto B como feito no dia 3.
   2. Transporte de animais do viveiro para a sala experimental no mesmo transporte como feito no dia 3.
   3. Coloque os animais em contexto B por 8 minutos sem registro de entrega e vídeo de choque frio ao longo da sessão.
   4. Remover todos os animais depois de 8 minutos e devolver imediatamente para o viveiro.

4. análise de dados

1. Medo de medida durante as sessões experimentais gravados usando congelando, definido como a falta de movimento todos, exceto pelo fato que é necessário para a respiração.
   Nota: Congelamento é marcado com mais precisão por um artilheiro humano cego, mas existem vários programas automatizados que executam bem. No entanto, todos os sistemas automatizados devem ser calibrados para um observador humano ser precisos¹³.
   1. Para marcar um gelo à mão, tem um experimentador cego para condições experimentais observa o assunto durante todo o período de tempo de interesse³de cada 4 segundos. Em cada observação, classifica o assunto como "congelamento" ou "não congelamento". Compare o número de observações de congelação para o número total de observações para determinar o congelamento por cento tempo gasto.
   2. Para usar a análise automatizada de vídeo para marcar o congelamento, primeiro verifique se os resultados de análise automatizado de vídeo correspondem os resultados obtidos com a mão de pontuação, como uma pontuação substancialmente diferente de congelamento de análise automatizada pode produzir resultados imprecisos.
      Nota: Um rato ou um mouse que tem sido chocado nunca deve mostrar congelamento entre 0 e 5%, enquanto valores mais altos indicam pobre calibração do equipamento
2. Use os métodos descritos acima para medir o medo durante os períodos de tempo de interesse (descrito abaixo).
   1. Medo de medida para o contexto de trauma como o porcentagem tempo congelando em toda a sessão inteira-8min de teste no dia 2.
   2. Generalização da medida do medo do contexto de trauma ao contexto estressor suave como a porcentagem tempo gasto congelamento durante o período de 3-min de base no contexto B no dia 3, antes da entrega de choque.
      Nota: Por Autoprodutores, é importante diferenciar os contextos bem o suficiente para que não haja generalização substancial.
   3. Medo de medida imediatamente após o choque no dia 3, como o tempo percentual gasto congelamento durante o período de 30-s que segue o choque.
   4. Medida de medo ao contexto estressor suave como o tempo gasto por cento entre a sessão inteira-8min de teste no dia 4.
3. Reatividade de choque medida pela quantidade ou velocidade, de movimento durante o período de 3-s durante e imediatamente após o choque no dia 3.
   Nota: ANOVA é recomendada para todas as análises de dados, como grupos adicionais (ex., tratamento de drogas) podem ser adicionados conforme necessário.

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Resultados

Resultados do teste de contexto de trauma no dia 2 são mostrados na Figura 1. Animais na condição de trauma apresentaram níveis significativamente mais elevados de congelamento no contexto A em comparação com os controles sem trauma, indicando a aquisição do medo para o contexto de trauma [ratos: F(1,17) = 23.58, p < 0,01; ratos: F(1,14) = 666.50, p < 0,0001]. Congelamento durante o período de base antes que o único choque no conte...

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Discussão

Autoprodutores é um robusto modelo comportamental de PTSD, o que pode ser instaurada em ratos e camundongos e pode ser usado para estudar as respostas de medo sensibilizadas que caracterizam PTSD. Após estresse pós-traumático, roedores mostram uma resposta de medo aumento num contexto distintamente diferente somente após esse contexto é emparelhado com um estressor suave que serve como um lembrete de uma experiência traumática anterior. Após o estresse pós-traumático roedores sem surpresa apresentam altos nív...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fear Conditioning Chamber for Low Profile Floors	Med Associates Inc.	VFC-008-LP	Fear conditioning chamber
Sound Attenuating Cubicle	Med Associates Inc.	NIR-022SD	Sound-attentuaing cubicle to prevent intrusion of outside noise
NIR/White Light Control Box	Med Associates Inc.	NIR-100VR	Light control box capable of delivering white and near-infrared light
NIR VFC Light Box	Med Associates Inc.	NIR-100L2	White overhead houselight
Windex Original Glass Cleaner	Windex		Solution for cleaning and scenting fear conditioning chambers between animals
Acetic acid	Fisher Scientific	A38-212	Solution for cleaning and scenting fear conditioning chambers between animals
A-Frame Chamber Insert	Med Associates Inc.	ENV-008-IRT	Black Plexiglas triangular insert to differentiate internal layout of Contexts A and B
Curved Wall Insert	Med Associates Inc.	VFC-008-CWI	White plastic sheet to differentiate internal layout of Contexts A and B
Low Profile Contextual Grid Floor with 1/8" Grid Rods for Mouse	Med Associates Inc.	VFC-005A	Flat grid floor for mice
Low Profile Contextual Grid Floor with Alternating 1/8" & 3/16" Grid Rods Mouse	Med Associates Inc.	VFC-005-S	Staggered grid floor for mice
Low Profile Contextual Grid Floor with 1/8" Staggered Grid Rods for Mouse	Med Associates Inc.	VFC-005A-L	Alternating grid floor for mice
Low Profile Contextual Grid Floor with 3/16" Grid Rods for Rat	Med Associates Inc.	VFC-005	Flat grid floor for rats
Low Profile Contextual Grid Floor with Alternating 3/16" & 3/8" Grid Rods	Med Associates Inc.	VFC-005-L	Alternating grid floor for rats
Low Profile Contextual Grid Floor with 3/16" Staggered Grid Rods for Rat	Med Associates Inc.	VFC-005-S	Staggered grid floor for rats
Metal pans	Med Associates Inc.		Metal pans to catch droppings underneath grid floors
Standalone Aversive Stimulator/Scrambler	Med Associates Inc.	ENV-414S	Shock generator and scrambler for footshock delivery
Multimeter	Fluke	87-5	Tool for measuring footshock amplitude
VideoFreeze Software	Med Associates Inc.	SOF-843	VideoFreeze software for controlling shock delivery
High Speed Firewire Monochrome Video Camera	Med Associates Inc.	VID-CAM-MONO-4	Video camera capable of recording in near-infrared light