Страх, стресс расширение обучения, надежную модель грызунов посттравматического стрессового расстройства

Резюме

Здесь мы описываем подробная методология, необходимые для проведения стресс расширение страх обучения (Самореактивных) эксперименты, доклинические модель посттравматического стрессового расстройства, у крыс и мышей. Модель использует аспекты Pavlovian страх кондиционирования и замораживания как индекс расширения страх в грызунов.

Аннотация

Страх расширения функциональности имеют важное значение для выживания, но непропорционально высокий уровень страха может увеличить уязвимость для развития психических расстройств, таких как посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР). Чтобы понять биологические механизмы регуляции страха в ПТСР, важно начать с действительным животной модели расстройства. Этот протокол описывает методологии, необходимые для проведения стресс расширение страх обучения (Самореактивных) эксперименты, доклинические модель ПТСР, у крыс и мышей. Самореактивных была разработана для пилки критических аспектов ПТСР, включая долгосрочные просветительские обучения страха, вызванного острого стресса. Самореактивных использует аспекты Pavlovian страх принадлежности, но производит четкие и надежные сенсибилизированных страх ответ гораздо больше, чем нормальный условного страх ответы. Травма процедура включает в себя размещение грызунов в камере принадлежности и управляющие 15 несигнальное потрясений, случайным образом распределены более 90 минут (для крыса экспериментов; для мыши экспериментов, 10 несигнальное используются потрясений, случайным образом распределены более чем 60 минут) . На 2 день грызуны помещаются в романе кондиционирования контексте где они получают один шок; затем на день 3 они помещаются обратно в том же контексте на 2 день и испытаны для изменения в замораживание уровней. Грызуны, которые ранее получали травмы дисплей повысить уровень замораживания на день тестирования по сравнению с теми, которые получили без потрясений в первый день. Таким образом с этой моделью, один очень стрессовые опыт (травма) производит крайних страх стимулов, связанных с травматическим событием.

Введение

Страх — это критический поведение для выживания, позволяя людям распознавать и реагировать на угрозы. Однако преувеличенные опасения ответы могут способствовать развитию психических расстройств, таких как посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР). ПТСР характерно преувеличенные ответ на мягкий стресс, особенно те из них, которые напоминают оригинальной травмы и тенденция к развитию новых страхи^1,2. В лаборатории страх часто измеряется путем замораживания поведение, которое является надежной и этологических допустимый индекс страх в людей и грызуны^3,4. В то время, как известно, ПТСР включает dysregulation страха и выражение расширенной страх, отсутствует надежный животных моделей ПТСР, которые надежно захватить этот дополненной страх ответ относительно безобидных раздражитель.

Этот протокол обеспечивает подробной методики, необходимые для проведения стресс расширение страх обучения (Самореактивных) эксперименты, надежные и достоверные доклинических модель ПТСР, у крыс и мышей. Самореактивных использует аспекты Pavlovian страх кондиционирования, но он производит различные ответы от нормальной страх кондиционирования и резюмирует расширенной страх, следующие травматического стресса наблюдается в ПТСР пациентов^5,6. В этой модели один очень стрессовые опыт (упоминаемый здесь как травма) приводит к прочному поведенческие изменения, включая экстремальные страх раздражителей связанных с травматическим событием, повышенная возбудимость, увеличение реактивности старт-рефлекс и изменены глюкокортикоидный сигнализации^7,8. Главной особенностью Самореактивных это что следующее воздействие травматического стресса (серия несигнальное потрясений) в различных условиях, животных показывают преувеличенные страх ответ на мягкий стресс (например., один удар) в другом контексте. Важно отметить, что эффект Самореактивных не обусловлен обобщения из контекста травма Роман контекста или увеличение шок чувствительности⁵. В нашей модели мы целенаправленно использовать процедуры, способствующие сокращению какие-либо обобщения Роман контекст таких как собственный транспорт, запах и сетки слово шаблон. Таким образом в отличие от обычных страх кондиционирования, Самореактивных является не Ассоциативный процесс, который приводит к новым обучения страх, что непропорционально связано с экологические сигналы, непосредственно не связанных с травматическим опытом. Обширная работа показывает, что одного 90-минутной сессии, содержащий 15 непредсказуемых потрясений в крыс (или один 60-минутной сессии, содержащий 10 непредсказуемых потрясений в мышах) индуцирует сенсибилизация длительный страх кондиционирования, а также повышенная возбудимость и регуляции в суточный ритм базальной кортикостерона. В отличие от предварительного воздействия на один footshock не производят Самореактивных⁹. Кроме того Самореактивных может использоваться надежно крыс и мышей.

Следовательно модель Самореактивных ПТСР является мощным инструментом для исследования биологических механизмов, участвующих в патофизиологии ПТСР. С помощью Самореактивных, исследователи можно изучить как воздействия травмы может повлиять на обучение будущих страх. Кроме того эта модель может быть полезна для расследования конкретных клеточном и молекулярном механизмов, которые могут быть вовлечены в регулировании выражение расширенной страх, как отмечено в ПТСР.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. субъекты

1. Крысы
   1. Заказать крыс приехать, когда они приблизительно 90 дней старых и сингл размещается в клетках стандартных крыс.
      Примечание: Рекомендуется один корпус, как группа жилье производит изменчивость из-за взаимодействия между животных в клетке, домой, особенно после воздействия стресса. Самореактивных была продемонстрирована в самцов и самок крыс, в Лонг-Эванс и крысах Sprague-Dawley и у крыс в возрасте 19 дней^7,10.
   2. Случайным образом назначить по крайней мере два условия животных: травма (n = 8) и не травма (n = 8) (см. Рау и др. ⁵ для дополнительного контроля условий).
2. Мыши
   1. Заказать мышей, чтобы прибыть, когда они являются приблизительно 60 дней старых и сингл размещается в клетках стандартной мыши. Одноместный дом мышей для по крайней мере 4 недель до травмы, а также на протяжении эксперимента.
   2. Случайным образом назначить животных по крайней мере два условия: травма (n = 8) и не травма (n = 8).

2. Оборудование для установки

1. Настроить один набор страха кондиционирования палат в качестве контекста A и второй набор камер страха кондиционирования в качестве контекста B (см. Таблицу материалов). Место каждой страх принадлежности камеры внутри звук смягчающие кабина для предотвращения вторжений внешних шумов (см. Таблицу материалов).
   1. Убедитесь, что метод освещения камер с видимого света (например, свет Белый дом накладных) присутствует в камерах, выступающей в качестве контекста (см. Таблицу материалов).
   2. Убедитесь, что различные решения доступны для очистки камер между каждое животное и предоставления различных запахов для каждой камеры (например., разбавленным очистки раствора и 1% уксусной кислоты).
      Примечание: Очень важно, что генерируемые животных запахов быть ликвидированы¹¹.
   3. Место пластиковых вставок в контексте B дифференцировать внутреннюю структуру двух контекстах. Рекомендуется черного оргстекла треугольная Вставка. Альтернативно, используйте Белый пластиковый лист для создания изогнутой задней стены (см. Таблицу материалов).
   4. Место сетки этажей в каждом страх кондиционирования палаты для footshock доставки, с помощью шаблона сетки для каждого контекста для различения текстуры этаже между контекстами (см. Таблицу материалов).
      Примечание: Достаточно собственный сетки модели включают плоских сеток (все бары расположены в одной горизонтальной плоскости), решетки (баров, расположенных в двух офсетных горизонтальных плоскостей) в шахматном порядке и чередующихся сетки (баров, расположенных в одной горизонтальной плоскости, но различной диаметры).
   5. Место чистой Металлические лотки под каждый этаж сетки для сбора помета. Запах кастрюли с чистящим раствором (см. Таблицу материалов).
2. Предоставлять точные сроки и амплитуда footshock доставки для каждого контекста.
   1. Подключить генератор шок и скремблер способных доставлять 1 мА или меньше амплитуда потрясения на каждом этаже сетки для доставки footshock (см. Таблицу материалов).
      Примечание: Ударные генераторы и скремблеры должны находиться за пределами звук, смягчающих камеры, с кабели, соединяющие генераторов и скремблер этажей сетки через отверстия в звук, смягчающих камеры. Это предотвратит повреждение вследствие жевания, очистки раствора и т.д.
   2. Используйте мультиметр для проверки текущего доставляются генератором шок, поместив каждый зонд на другой панели сетки пола и подтверждающий, что амплитуда желаемого шок производится (см. Таблицу материалов).
   3. Убедитесь, что метод для контроля времени и амплитуды ударной доставки (например, компьютерное программное обеспечение) (см. Таблицу материалов).
3. Убедитесь, что метод для видео запись каждого животного во время каждой экспериментальной сессии (см. Таблицу материалов).
   Примечание: Это будет необходимо записать 1) когда светятся камеры видимого света и 2) когда темные камеры. Последний может быть достигнуто путем с помощью камеры ночного видения или светящиеся и записи потемнела камеры, с помощью инфракрасных или инфракрасный свет.
4. Убедитесь, что отличительной метод транспортировки животных от виварий для контекста B доступен для дальнейшей дифференциации двух контекстах.
   Примечание: Хотя методы, такие как черный пластиковое корыто (38 x 30 x 24 см) разделен на четыре отделения или очистить пустые клетки были успешно использованы, может использоваться любой транспортный ящик, которая заметно отличается от дома клетке.

3. Самореактивных процедура для крыс и мышей

1. Обработка всех грызунов ежедневно, мягко удаляя их из homecage и удерживая каждый 60-90 секунд для по крайней мере за 7 дней до начала процедуры Самореактивных.
2. На 1 день Самореактивных процедуры место темы в контексте A, где они будут получать травматического стресса.
   1. Настройка контекста A с одним набором сетки этажей (например., плоских сеток) и освещения камер с видимого света.
   2. Для проверки текущей доставляются генератором шок, поместив каждый зонд на другой панели сетки пола и подтверждающий, что амплитуда желаемого шок производится используйте мультиметр.
      Примечание: Повреждения или коррозия баров может привести к слабым или неравномерным шок доставки. Жидкостей, включая мочи, касаясь сетки вдоль стены может также негативно сказаться на шок доставки.
   3. Протрите камеры стены и двери и распылить лотки под полы сетки с одним из решений (например., разбавленным моющий раствор).
      Примечание: Это необходимо для устранения запахов от предыдущих животных.
   4. Транспорт животных от виварий экспериментальной комнату в их клетках дома размещены на корзину и место индивидуально в страх принадлежности камеры. Только Принесите один раунд в стоит животных (определяется количество страха принадлежности камеры) номер эксперимент одновременно.
      Примечание: Чтобы избежать путает силу порядка или сроков, каждый раунд должен содержать животных в травма и травма каких-либо условий.
   5. Для крыса экспериментов, используйте генератор шок и скремблеры доставить 15 1-s, 1-мА footshocks, случайно представлено более 90 минут (средняя МСИ = 6 мин) сквозь прутья сетки камер, содержащих травмы состояния субъектов. Разоблачить травмы элементы управления не в том же контексте 90 минут без доставки шок.
   6. Для экспериментов мыши, используйте генератор шок и скремблеры доставить 10 1-s, 1-мА footshocks, случайно представлены более 60 минут (средняя МСИ = 6 мин) через сетку этажей камер, содержащих травмы состояния субъектов. Разоблачить травмы элементы управления не в том же контексте на 60 минут без доставки шок.
   7. После 90 минут (Крыса экспериментов) или 60 минут (мыши экспериментов) возвращение всех животных в их homecages и быстро вернуться к виварий.
3. На 2 день Самореактивных процедуры оцените страх к контексту травмы, при желании.
   1. Настройка контекста как сделано на 1 день.
   2. Транспорт животных в номер эксперимент в их дома клетки на 1 день.
   3. Место животных в контексте A 8 минут без доставки шок и видео запись поведение в течение всей сессии.
   4. После 8 минут возвращение всех животных в их homecages и быстро вернуться к виварий.
4. На 3 день Самореактивных процедуры разоблачить все предметы на мягкий стресс в контексте.
   Примечание: Эта процедура может произойти где угодно от 24 часов до 90 дней после травматического стресса⁹.
   1. Настройка контекста B с другим набором сетки этажей от тех, которые используются в контексте A (например, чередуя или шахматном сетки полы) и черные треугольные или белым изогнутым оргстекло вставок. Не освещают камер с видимого света; Хотя, инфракрасный или инфракрасный свет может использоваться при необходимости.
   2. Для проверки текущей доставляются генератором шок, поместив каждый зонд на другой панели сетки пола и подтверждающий, что амплитуда желаемого шок производится используйте мультиметр. Для проверки текущей доставляются генератором шок, поместив каждый зонд на другой панели сетки пола и подтверждающий, что амплитуда желаемого шок производится используйте мультиметр.
      Примечание: Повреждения или коррозия баров может привести к слабым или неравномерным шок доставки. Жидкостей, включая мочи, касаясь сетки вдоль стены может также негативно сказаться на шок доставки.
   3. Протрите камер и спрей посуду под полы сетки с раствором, не используется в контексте A (например., 1% уксусной кислоты).
   4. Транспорт животных от виварий экспериментальной комнату в метод отличается от метода используется для контекста (например, черный пластиковое корыто) и поместите их индивидуально в страх кондиционирования камер. Привести только один раунд стоит животных в эксперимент номер в то время (определяется количество страха принадлежности камеры).
   5. Разоблачить всех животных на мягкий стресс (описано ниже) и запись видео замораживания и активности во время сессии.
      1. После 180-s базового периода доставить всех животных одного 1-s, 1-мА footshock (крысы) или одного 2-s, 1-мА footshock (мышь).
         Примечание: Убедитесь, что в течение 180-s базового периода замораживания не должен превышать 5%¹².
      2. Удалите все животные 30 секунд после удара доставки и быстро вернуться к виварий.
5. На 4 день Самореактивных процедуры тест страх к контексту мягкий стресс.
   1. Настройка контексте B, как это сделано на 3 день.
   2. Транспорт животных от виварий экспериментальной комнату в тот же транспорт, как сделано на 3 день.
   3. Место животных в контексте B 8 минут без шок видео и доставки запись замораживания на протяжении всей сессии.
   4. Удалите все животные после 8 минут и быстро вернуться к виварий.

4. анализ данных

1. Мера страх на записанные экспериментальных сессиях с использованием замораживания, определяется как отсутствие все движения, за исключением, что необходимый для дыхания.
   Примечание: Замораживание наиболее точно забил слепого человека бомбардиром, но есть несколько автоматических программ, которые выполняют хорошо. Однако всех автоматизированных систем должны быть откалиброван для человеческого наблюдателя быть точной¹³.
   1. Оценка замораживания вручную, у слепых в экспериментальных условиях экспериментатора отмечает вопросу каждые 4 секунды на протяжении периода времени интерес³. На каждое замечание Классифицируйте темы, как «замораживания» или «не замораживать». Сравните число замораживания наблюдений на общее количество наблюдений определить процент времени, затраченного замораживания.
   2. Чтобы использовать автоматизированные видео анализ забить замораживания, сначала убедитесь, что результаты от автоматизированного анализа видео соответствуют результаты, полученные от стороны скоринга, как существенн по-разному замораживания Оценка от автоматизированного анализа может выдавать неточные результаты.
      Примечание: Крыса или мышь, которая никогда не были шокированы должен показать замораживания между 0 и 5%, в то время как более высокие значения предложить бедным калибровка оборудования
2. Используйте методы, описанные выше для измерения страха во время периодов времени интерес (описано ниже).
   1. Мера страх к контексту травма как процент времени замораживания через весь 8-мин тест сессии в день 2.
   2. Мера обобщение страха от травмы контекста к контексту мягкий стресс как процент времени замораживания в период базовой 3-мин в контексте B на 3 день до родов шок.
      Примечание: Для Самореактивных, важно различать контексты достаточно хорошо, так что есть не значительные обобщение.
   3. Мера страх сразу же после шока на 3 день как процент времени замораживания в период 30-х, который следует шок.
   4. Мера страх к контексту мягкий стресс как процент отработанное время через весь 8-мин тест сессии на 4 день.
3. Мера шок реактивности суммы, или скорости движения в период 3-s, во время и сразу же после удара на 3 день.
   Примечание: ANOVAs рекомендуются для анализа всех данных, как дополнительные группы (например., лечение наркозависимости) могут быть добавлены при необходимости.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Результаты теста контексте травмы на день 2 показаны на рисунке 1. Животных в состоянии травмы показали значительно более высокий уровень замораживания в контексте A по сравнению с не травма управления, указывающее приобретение страха к контексту трав?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Самореактивных является надежная модель поведения ПТСР, которые могут быть сведены воедино в крыс и мышей и могут быть использованы для изучения сенсибилизированных страх ответы, которые характеризуют ПТСР. После травматического стресса грызуны показывают увеличение страх ответ в с?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fear Conditioning Chamber for Low Profile Floors	Med Associates Inc.	VFC-008-LP	Fear conditioning chamber
Sound Attenuating Cubicle	Med Associates Inc.	NIR-022SD	Sound-attentuaing cubicle to prevent intrusion of outside noise
NIR/White Light Control Box	Med Associates Inc.	NIR-100VR	Light control box capable of delivering white and near-infrared light
NIR VFC Light Box	Med Associates Inc.	NIR-100L2	White overhead houselight
Windex Original Glass Cleaner	Windex		Solution for cleaning and scenting fear conditioning chambers between animals
Acetic acid	Fisher Scientific	A38-212	Solution for cleaning and scenting fear conditioning chambers between animals
A-Frame Chamber Insert	Med Associates Inc.	ENV-008-IRT	Black Plexiglas triangular insert to differentiate internal layout of Contexts A and B
Curved Wall Insert	Med Associates Inc.	VFC-008-CWI	White plastic sheet to differentiate internal layout of Contexts A and B
Low Profile Contextual Grid Floor with 1/8" Grid Rods for Mouse	Med Associates Inc.	VFC-005A	Flat grid floor for mice
Low Profile Contextual Grid Floor with Alternating 1/8" & 3/16" Grid Rods Mouse	Med Associates Inc.	VFC-005-S	Staggered grid floor for mice
Low Profile Contextual Grid Floor with 1/8" Staggered Grid Rods for Mouse	Med Associates Inc.	VFC-005A-L	Alternating grid floor for mice
Low Profile Contextual Grid Floor with 3/16" Grid Rods for Rat	Med Associates Inc.	VFC-005	Flat grid floor for rats
Low Profile Contextual Grid Floor with Alternating 3/16" & 3/8" Grid Rods	Med Associates Inc.	VFC-005-L	Alternating grid floor for rats
Low Profile Contextual Grid Floor with 3/16" Staggered Grid Rods for Rat	Med Associates Inc.	VFC-005-S	Staggered grid floor for rats
Metal pans	Med Associates Inc.		Metal pans to catch droppings underneath grid floors
Standalone Aversive Stimulator/Scrambler	Med Associates Inc.	ENV-414S	Shock generator and scrambler for footshock delivery
Multimeter	Fluke	87-5	Tool for measuring footshock amplitude
VideoFreeze Software	Med Associates Inc.	SOF-843	VideoFreeze software for controlling shock delivery
High Speed Firewire Monochrome Video Camera	Med Associates Inc.	VID-CAM-MONO-4	Video camera capable of recording in near-infrared light