Miedo estrés mayor aprendizaje, un modelo de roedor robusto del trastorno por estrés postraumático

Resumen

Aquí describimos la metodología detallada necesaria para llevar a cabo experimentos de aprendizaje (SEFL) miedo estrés mejorada, un modelo preclínico de trastorno de estrés postraumático, en ratas y ratones. El modelo utiliza aspectos del miedo pavloviana acondicionado y congelar como un índice de mayor miedo en los roedores.

Resumen

Comportamientos de miedo son importantes para la supervivencia, pero desproporcionadamente altos niveles de temor pueden aumentar la vulnerabilidad para desarrollar trastornos psiquiátricos como el trastorno de estrés postraumático (TEPT). Para entender los mecanismos biológicos del dysregulation de miedo en el TEPT, es importante comenzar con un modelo animal válido del desorden. Este protocolo describe la metodología necesaria para llevar a cabo experimentos de aprendizaje (SEFL) miedo estrés mejorada, un modelo preclínico de TEPT, en ratas y ratones. SEFL fue desarrollado para recapitular los aspectos más importantes del TEPT, incluyendo sensibilización a largo plazo de aprendizaje de miedo causada por un estresor agudo. SEFL utiliza aspectos de pavloviano miedo acondicionado pero produce una respuesta distinta y fuerte miedo sensibilizado mucho mayor que las respuestas de miedo condicionadas normales. El procedimiento de trauma implica colocar un roedor en una cámara de acondicionamiento y la administración de 15 choques no señalizados al azar distribuidos más de 90 minutos (para los experimentos de la rata, para experimentos de ratón, 10 no señalizado se utilizan choques aleatoriamente distribuidas más de 60 minutos) . En el día 2, roedores se colocan en un contexto de condicionamiento nuevo donde reciben un choque único; Luego, el día 3 son colocados en el mismo contexto como en el día 2 y probados para los cambios en los niveles de congelación. Roedores que recibieron previamente la pantalla trauma mayor niveles de congelación en el día de la prueba en comparación con aquellos que no recibieron descargas el primer día. Así, con este modelo, una sola experiencia altamente estresante (el trauma) produce miedo extremo de los estímulos asociados con el evento traumático.

Introducción

El miedo es un comportamiento crítico para la supervivencia, que permite al usuario reconocer y responder a las amenazas. Sin embargo, las respuestas de temor exagerado pueden contribuir al desarrollo de trastornos psiquiátricos como el trastorno de estrés postraumático (TEPT). Una característica del TEPT es una respuesta exagerada al estrés leve, particularmente aquellos que recuerdan el trauma original y una tendencia a desarrollar nuevos temores^1,2. En el laboratorio, miedo a menudo se mide a través del comportamiento, que es un índice fiable y válido etológico del temor en los seres humanos y roedores^3,4de congelación. Aunque se conoce que el PTSD implica dysregulation de miedo y temor a mayor expresión, hay una falta de modelos animales robustos del TEPT que capturar este miedo aumentada ante un estímulo relativamente inofensivo.

Este protocolo proporciona la metodología detallada necesaria para llevar a cabo experimentos de aprendizaje (SEFL) miedo estrés mejorada, un fiable y robusto modelo preclínico del TEPT, en ratas y ratones. SEFL utiliza aspectos de pavloviana de condicionamiento de miedo, pero produce distintas respuestas de miedo normal acondicionado y recapitula el miedo mayor siguiente estrés observado en pacientes de PTSD^5,6. En este modelo, una sola experiencia altamente estresante (referida aquí como trauma) conduce a cambios de comportamiento de duración, incluyendo temor excesivo a estímulos asociado con el evento traumático, mayor ansiedad, mayor reactividad del susto y alterada glucocorticoide señalización^7,8. La característica importante de SEFL es que la siguiente exposición a un estresor traumático (una serie de choques no señalizados) en un contexto distinto, animales mostrar un temor exagerado ante un estresor suave (por ej., un solo choque) en un contexto diferente. Lo importante es el efecto SEFL no es debido a la generalización en el contexto de trauma para el contexto novedoso o choque mayor sensibilidad⁵. En nuestro modelo, útil utilizamos procedimientos que reducen cualquier generalización a un contexto nuevo como patrón distinto de la planta del transporte, el olor y la red. Por lo tanto, a diferencia de miedo normal acondicionado, SEFL es un proceso no asociativo que lleva a un nuevo aprendizaje de miedo desproporcionada relacionada con señales ambientales asociados no no directamente con la experiencia traumática. Trabajo extenso muestra que una sola sesión de 90 minutos que contiene 15 choques imprevisibles en ratas (o una sola sesión de 60 minutos que contiene 10 choques imprevisibles en ratones) induce una sensibilización duradera de condicionamiento de miedo junto con mayor ansiedad y desregulación en el ritmo circadiano de corticosterona basal. Por el contrario, antes de la exposición a un solo asociar no produce SEFL⁹. Además, SEFL puede ser utilizado confiablemente en ratas y ratones.

Por lo tanto, el modelo SEFL del TEPT es una poderosa herramienta para sondear los mecanismos biológicos implicados en la patofisiología de PTSD. Uso SEFL, los investigadores pueden examinar cómo la exposición a un trauma puede afectar el temor futuro aprendizaje. Además, este modelo puede ser útil para la investigación de los mecanismos celulares y moleculares específicos que pueden estar involucrados en la regulación de la expresión de mayor miedo como se observa en el TEPT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. los sujetos

1. Ratas
   1. Ordenar las ratas para llegar cuando son aproximadamente 90 días viejo y solo alojados en jaulas de la rata estándar.
      Nota: Se recomienda solo vivienda, como el alojamiento en grupo produce variabilidad debido a las interacciones entre los animales en la jaula de casa, particularmente después de la exposición de estrés. SEFL ha demostrado en ratas machos y hembras, en Long-Evans y ratas Sprague Dawley y en tan sólo 19 días de edad^7,10ratas.
   2. Asignar al azar los animales a por lo menos dos condiciones: trauma (n = 8) y no hay trauma (n = 8) (ver Rau et al. ⁵ para las condiciones adicionales de control).
2. Ratones
   1. Ratones para llegar cuando son aproximadamente 60 días viejo y único ubicado en jaulas de ratón estándar de la orden. Casa sola los ratones durante al menos 4 semanas antes del trauma, así como a lo largo de la duración del experimento.
   2. Asignar al azar los animales a por lo menos dos condiciones: trauma (n = 8) y no hay trauma (n = 8).

2. equipo instalación

1. Establecer un sistema de cámaras de miedo-acondicionado para servir como contexto A y un segundo conjunto de cámaras de miedo-acondicionado para servir como contexto B (véase Tabla de materiales). Coloque cada cámara miedo acondicionado dentro de un cubículo de atenuación de sonido para evitar la entrada de ruido exterior (véase Tabla de materiales).
   1. Asegurar que un método de iluminar las cámaras con luz visible (como una luz de la casa blanca de arriba) está presente en las cámaras que sirve como contexto una (ver la Tabla de materiales).
   2. Asegurarse de que existen soluciones diferentes limpiar las cámaras entre cada animal y proporcionar diferentes olores para cada cámara (e.g., limpieza solución y 1% ácido acético diluido).
      Nota: Es crítico que los olores generados por animales ser eliminado¹¹.
   3. Colocar insertos de plástico en el contexto B para diferenciar la disposición interna de los dos contextos. Se recomienda un inserto triangular negro de plexiglás. También, usar una lámina de plástico blanco para crear un muro trasero curvo (véase Tabla de materiales).
   4. Colocar suelos de rejilla en cada miedo acondicionado cámara para asociar la entrega, utilizando una cuadrícula diferentes para cada contexto para distinguir la textura del suelo entre los contextos (véase Tabla de materiales).
      Nota: Grid suficientemente distintos patrones incluyen rejillas planas (todas las barras dispuestas en un solo plano horizontal), escalonados rejillas (barras dispuestas en dos planos horizontales de desplazamiento) y alternando las rejillas (barras dispuestas en un solo plano horizontal pero de diferentes diámetros).
   5. Coloque cacerolas de metal limpia debajo de cada piso de rejilla para recoger los excrementos. Cacerolas del olor con la solución de limpieza (véase Tabla de materiales).
2. Proporcionar sincronización exacta y la amplitud de la entrega de asociar para cada contexto.
   1. Conectar un generador de descargas y codificador capaz de 1 mA o perturbaciones de amplitud inferiores a cada piso de rejilla para asociar entrega (véase Tabla de materiales).
      Nota: Los generadores de choque y codificadores deben ser situados fuera el sonido atenuando la cámara, con cables que conectan los generadores y el codificador a los pisos de rejilla por aberturas en el sonido atenuando la cámara. Esto evitará daños debido a la masticación, de la limpieza solución, etcetera.
   2. Use un multímetro para comprobar la corriente siendo entregada por el generador de descarga colocando cada sonda en un bar diferente del piso de rejilla y confirmando que la amplitud de descarga deseada se produce (véase la Tabla de materiales).
   3. Asegúrese de que un método para controlar la sincronización y la amplitud de la entrega del choque (por ejemplo, software de computadora) está disponible (ver la Tabla de materiales).
3. Asegúrese de que un método de grabación de vídeo cada animal durante cada sesión experimental está disponible (ver la Tabla de materiales).
   Nota: Será necesario grabar 1) cuando las cámaras están iluminadas por la luz visible tanto 2) cuando las salas son oscuras. Este último puede lograrse ya sea usando una cámara de visión nocturna o iluminar y grabar las cámaras oscuras con luz infrarroja o infrarrojo cercano.
4. Garantizar que un método distintivo de transporte de animales de vivero b contexto diferenciar aún más los dos contextos.
   Nota: Mientras que los métodos tales como una bañera de plástico negro (38 x 30 x 24 cm) dividieron en cuatro compartimentos o jaulas limpio vacíos se han utilizado con éxito, puede utilizarse cualquier otra caja de transporte que es claramente diferente de la jaula del hogar.

3. SEFL procedimiento para ratas y ratones

1. Manejar roedores todos todos los días suavemente sacarlos de la homecage y sosteniendo cada una por 60-90 segundos durante al menos 7 días antes de iniciar el procedimiento SEFL.
2. El día 1 del procedimiento SEFL, colocar a temas en el contexto A, donde recibirán el estresor traumático.
   1. Establecer contexto A un conjunto de suelos de rejilla (e.g., rejillas de piso) e iluminar las cámaras con luz visible.
   2. Use un multímetro para comprobar la corriente siendo entregada por el generador de descarga colocando cada sonda en un bar diferente del piso de rejilla y confirmando que la amplitud de descarga deseado se produce.
      Nota: Daños o corrosión de las barras puede resultar en la entrega del choque débil o irregular. Líquidos como la orina toca la rejilla a lo largo de la pared pueden también afectar entrega del choque.
   3. Limpie las paredes de la cámara y las puertas y rociar los recipientes por debajo de los pisos de rejilla con una solución (por ej., diluido en solución de limpieza).
      Nota: Esto es necesario para eliminar los olores de los animales anteriores.
   4. Animales de transporte desde el vivero a la sala experimental en sus jaulas hogar colocan en un carro y lugar individualmente en las cámaras de acondicionamiento de miedo. Sólo traigo uno redondo de pena de animales (determinados por el número de miedo acondicionado cámaras) a la sala de experimento a la vez.
      Nota: Para evitar que se confunde debido a orden o sincronización, cada ronda debe contener animales en el trauma y sin condiciones de trauma.
   5. Para los experimentos de la rata, utilice el generador de la descarga y codificadores para entregar 15 footshocks 1-s, 1-mA presentados aleatoriamente durante 90 minutos (promedio de ISI = 6 min) a través de las barras de la rejilla de los compartimientos que contienen temas de condición de trauma. No exponer a los controles de trauma en el mismo contexto durante 90 minutos sin entrega del choque.
   6. Para los experimentos de ratón, utilice el generador de la descarga y codificadores para entregar 10 footshocks 1-s, 1-mA al azar presentadas más de 60 minutos (promedio de ISI = 6 min) a través de los pisos de rejilla de los compartimientos que contienen temas de condición de trauma. No exponer a los controles de trauma en el mismo contexto durante 60 minutos sin entrega del choque.
   7. Después de 90 minutos (experimentos de la rata) o 60 minutos (experimentos de ratón), retomar todos los animales de sus homecages y volver rápidamente al vivero.
3. El día 2 del procedimiento SEFL, evaluar el miedo en el contexto de trauma si lo desea.
   1. Establecer contexto A como hizo el día 1.
   2. Transporte de animales a la sala de experimento en sus jaulas hogar como en el día 1.
   3. Animales del lugar en el contexto A durante 8 minutos sin entrega del choque y video grabación el comportamiento durante toda la sesión.
   4. Después de 8 minutos, retomar todos los animales de sus homecages y volver rápidamente al vivero.
4. El día 3 del procedimiento SEFL, exponer a todos los temas que el factor estresante leve en el contexto B.
   Nota: Este procedimiento puede ocurrir en cualquier lugar por 24 horas a 90 días después de la de estresor traumático⁹.
   1. Creado con un conjunto de pisos de rejilla diferente de los utilizados en el contexto A contexto B (por ejemplo, alternados o escalonados pisos de rejilla) y negro triangular o blanco rellenos de plexiglás. No se iluminan las cámaras con luz visible; Aunque luz infrarroja o infrarroja se puede utilizar según sea necesario.
   2. Use un multímetro para comprobar la corriente siendo entregada por el generador de descarga colocando cada sonda en un bar diferente del piso de rejilla y confirmando que la amplitud de descarga deseado se produce. Use un multímetro para comprobar la corriente siendo entregada por el generador de descarga colocando cada sonda en un bar diferente del piso de rejilla y confirmando que la amplitud de descarga deseado se produce.
      Nota: Daños o corrosión de las barras puede resultar en la entrega del choque débil o irregular. Líquidos como la orina toca la rejilla a lo largo de la pared pueden también afectar entrega del choque.
   3. Limpie las cámaras y rociar los recipientes por debajo de los pisos de rejilla con la solución no utilizada en el contexto A (por ej., ácido acético al 1%).
   4. Animales de transporte desde el vivero a la sala experimental en un método distinto al método utilizan para contexto una (por ejemplo, una bañera de plástico negro) y colocarlos individualmente en miedo acondicionado cámaras. Sólo traigo uno digno de la ronda de los animales a la sala de experimento a la vez (determinada por el número de miedo acondicionado cámaras).
   5. Exponer a todos los animales al estresor suave (se describe a continuación) y grabación de vídeo de congelación y actividad durante la sesión.
      1. Después de un período inicial de 180-s, entregar un solo asociar 1-s, 1-mA (ratas) o un solo asociar 2-s, 1-mA (ratones) a todos los animales.
         Nota: Asegúrese de que durante el período inicial de 180-s congelación no debe exceder 5%¹².
      2. Quite todos los animales 30 segundos después de la entrega del choque y rápidamente volver al vivero.
5. En el día 4 del procedimiento SEFL, prueba de miedo al contexto estresante suave.
   1. Establecer contexto B como hecho en el día 3.
   2. Transporte de animales de vivero a la sala experimental en el mismo transporte como hecho en el día 3.
   3. Colocar animales en el contexto B durante 8 minutos sin descarga entrega y video registro de congelación durante toda la sesión.
   4. Quite todos los animales después de 8 minutos y volver rápidamente al vivero.

4. Análisis de datos

1. Medida de miedo durante las sesiones experimentales grabadas con congelación, definido como la falta de todos los movimientos excepto el que es necesario para la respiración.
   Nota: Congelación se anotó más exactamente por un goleador humano ciego, pero hay varios programas automatizados que funcionan bien. Sin embargo, todos los sistemas automatizados deben ser calibrados a un observador humano que precisa¹³.
   1. Puntuación de congelación con la mano, tener un experimentador ciego a las condiciones experimentales se observa al tema cada 4 segundos durante todo el período de tiempo de interés³. En cada observación, clasificar al asunto como "congelación" o "no congelar". Comparar el número de observaciones de congelación para el número total de observaciones para determinar la congelación del tiempo por ciento.
   2. Para utilizar el análisis automatizado de video para congelación, primero verificar que los resultados de análisis automatizado de video coinciden con los resultados obtenidos de anotar a mano, como una puntuación de congelación substancialmente diferente de análisis automatizado puede producir resultados inexactos.
      Nota: Debe mostrar una rata o un ratón que nunca ha sido chocado de congelación entre 0 y 5%, mientras que valores mayores sugieren mala calibración del equipo
2. Utilice los métodos descritos anteriormente para medir el miedo durante los períodos de interés (se describe a continuación).
   1. Medir el miedo en el contexto de trauma como el porcentaje tiempo de congelación a través de la sesión entera de 8 min de prueba el día 2.
   2. Medir la generalización del miedo en el contexto de trauma al contexto estresante suave como el porcentaje tiempo de congelación durante el período inicial de 3-min en el contexto B en día 3 antes de la entrega del choque.
      Nota: Para SEFL, es importante diferenciar los contextos lo suficientemente bien como para que no haya generalización sustancial.
   3. Medir el miedo inmediatamente después del choque el día 3 como el porcentaje tiempo de congelación durante el período del 30-s que sigue el choque.
   4. Medida de miedo al contexto estresante suave como el tiempo gastado por ciento en la sesión entera de 8 min de prueba en el día 4.
3. Reactividad de descarga medida por la cantidad o velocidad de movimiento durante el período de 3 s durante e inmediatamente tras el choque el día 3.
   Nota: ANOVAs se recomiendan para todos los análisis de datos, como grupos adicionales (por ej., tratamiento contra las drogas) pueden añadirse cuando sea necesario.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Resultados de la prueba de contexto de trauma el día 2 se muestran en la figura 1. Los animales en la condición de trauma mostraron niveles significativamente más altos de la congelación en el contexto A que en comparación con los no controles de trauma, que indica adquisición de miedo en el contexto de trauma [ratas: F(1.17) = 23.58, p < 0.01; ratones: F(1,14) = 666.50, p < 0.0001]. Congelación durante el período de base antes de qu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

SEFL es un robusto modelo conductual del TEPT puede ser recapitulado en ratas y ratones y se puede utilizar para estudiar las respuestas de miedo sensibilizadas que caracterizan el PTSD. Después de estrés traumático, roedores muestran una respuesta de temor mayor en un contexto claramente diferente sólo después de ese contexto se empareja con un factor estresante suave que sirve como un recordatorio de una experiencia traumática anterior. Tras el estrés postraumático roedores Mostrar niveles altos de temor cuando...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fear Conditioning Chamber for Low Profile Floors	Med Associates Inc.	VFC-008-LP	Fear conditioning chamber
Sound Attenuating Cubicle	Med Associates Inc.	NIR-022SD	Sound-attentuaing cubicle to prevent intrusion of outside noise
NIR/White Light Control Box	Med Associates Inc.	NIR-100VR	Light control box capable of delivering white and near-infrared light
NIR VFC Light Box	Med Associates Inc.	NIR-100L2	White overhead houselight
Windex Original Glass Cleaner	Windex		Solution for cleaning and scenting fear conditioning chambers between animals
Acetic acid	Fisher Scientific	A38-212	Solution for cleaning and scenting fear conditioning chambers between animals
A-Frame Chamber Insert	Med Associates Inc.	ENV-008-IRT	Black Plexiglas triangular insert to differentiate internal layout of Contexts A and B
Curved Wall Insert	Med Associates Inc.	VFC-008-CWI	White plastic sheet to differentiate internal layout of Contexts A and B
Low Profile Contextual Grid Floor with 1/8" Grid Rods for Mouse	Med Associates Inc.	VFC-005A	Flat grid floor for mice
Low Profile Contextual Grid Floor with Alternating 1/8" & 3/16" Grid Rods Mouse	Med Associates Inc.	VFC-005-S	Staggered grid floor for mice
Low Profile Contextual Grid Floor with 1/8" Staggered Grid Rods for Mouse	Med Associates Inc.	VFC-005A-L	Alternating grid floor for mice
Low Profile Contextual Grid Floor with 3/16" Grid Rods for Rat	Med Associates Inc.	VFC-005	Flat grid floor for rats
Low Profile Contextual Grid Floor with Alternating 3/16" & 3/8" Grid Rods	Med Associates Inc.	VFC-005-L	Alternating grid floor for rats
Low Profile Contextual Grid Floor with 3/16" Staggered Grid Rods for Rat	Med Associates Inc.	VFC-005-S	Staggered grid floor for rats
Metal pans	Med Associates Inc.		Metal pans to catch droppings underneath grid floors
Standalone Aversive Stimulator/Scrambler	Med Associates Inc.	ENV-414S	Shock generator and scrambler for footshock delivery
Multimeter	Fluke	87-5	Tool for measuring footshock amplitude
VideoFreeze Software	Med Associates Inc.	SOF-843	VideoFreeze software for controlling shock delivery
High Speed Firewire Monochrome Video Camera	Med Associates Inc.	VID-CAM-MONO-4	Video camera capable of recording in near-infrared light