体外流动下单核细胞亚群的同时研究

摘要

在这里, 我们提出了一个综合协议, 测量单核细胞亚群贩运在流在体外使用特定的表面标记和共聚焦荧光显微镜。该协议可用于探索顺序招募步骤, 以及使用其他特定的表面标记来描述其他白细胞亚型。

摘要

在组织损伤、肿瘤发育和自身免疫性疾病的过程中, 从血液中招募单核细胞到靶向外周组织对炎症过程至关重要。这是通过捕获过程从自由流动到腔表面的激活内皮细胞, 其次是他们的粘附和内皮迁移 (转移) 到底层受影响的组织。然而, 支持优先和与上下文相关的单核细胞亚群招募的机制仍未得到充分理解。因此, 我们开发了一种方法, 允许在流量下同时对不同单核细胞亚群的招募进行可视化和测量。这种基于延时共聚焦成像的方法允许在粘附体和迁移单核细胞之间进行明确的区分。在这里, 我们描述了如何使用这种方法可以同时研究招募的亲血管生成和非血管生成单核细胞在体外。此外, 这种方法还可以推广到研究最多三个单核细胞种群的不同招募步骤。

引言

单核细胞是先天免疫的吞噬成分, 对于对抗病原体、清理受损组织、血管生成以及包括癌症^在内的许多疾病的病理生理学至关重要..单核细胞是由异质亚群组成的骨髓细胞, 在血液中循环, 但可以通过特定的分子机制被招募到外周组织的炎症部位。与一般白细胞一样, 单核细胞的招募级联涉及不同的步骤, 包括捕获、滚动、爬行、逮捕、内皮迁移 (转移) 和通过血管壁 (基底膜和壁画) 的迁移单元格)⁴。这些步骤主要涉及炎症引起的内皮腔表面的分子, 如选择、糖蛋白配体、趋化因子、细胞间和结合粘附分子, 以及它们对白细胞的受体, 如选择性配体和整合。通过内皮细胞连接 (脱细胞后) 或通过内皮细胞体 (跨细胞) 的贩运途径可被白细胞用于跨越内皮屏障⁵。虽然历史上有记录表明单核细胞通过跨细胞途径迁移, 但由于单核细胞不再被视为同质细胞群, 它们迁移途径中的潜在差异已被提出。现在越来越清楚的是, 单核细胞多样性可以通过它们的每一个差异和共性来定义, 就它们独特的外渗级联 3^,6。因此, 为了明确区分单核细胞亚群, 在招募过程中, 将这些不同亚群的行为形象化和表型是至关重要的。

将人、猪、大鼠和小鼠的单核细胞细分为表型亚群, 具有一定的归因功能和特定的迁移行为^7,8,⁹。例如, 在人类中, 单核细胞可以根据其表面表达的 cd14 (细菌脂多糖的核心受体) 和 cd16 (fc-γ受体 iii) 分为三个子集。人类单核细胞亚群包括经典 cd14⁺cd16^-、中间 cd14⁺cd16⁺和非经典 cd14 暗淡 cd16⁺细胞^6,9。经典 cd14⁺cd16^-单核细胞主要具有炎症性, 而 cd16 + 单核细胞池被共同发现为 tie2^表达和血管生成功能¹⁰。持续, 内皮细胞刺激与炎症细胞因子, 如人类肿瘤坏死因子 (tnf) α或白细胞介素 (il-1)beta (常规炎症) 足以引发经典 cd14⁺cd16 的完全招募^-单核细胞然而, 血管内皮生长因子 (vegf) a 和 tnfα (血管生成因子引起的炎症) 同时作用, 是引发 cd16 + 单核细胞血管生成池 3^的迁移.从历史上看, 传统的跨井系统在静态条件下, 平行板流动室和μ-滑动流室已被用来定量分析在体外一次招募一个白细胞群 11 ^,12,13。虽然这些方案已经得到验证, 一个更强大的方法, 允许同时分析多个单核细胞亚群将被认为更有见地。这种方法必须考虑到多个相互作用和每个群体的不同频率, 并提供机械地理解定义每个单核细胞的招募级联的相似性和特殊性子集。

本文提出了一种基于流动过程中单核细胞招募延时成像的方法, 该方法可以利用共聚焦显微镜同时研究不同单核细胞亚群的迁移级联。该方法结合了某些关键特征, 模仿内皮细胞炎症, 以及在毛细血管后静脉循环单核细胞的血流动力学, 白细胞在体内招募的主要位置。该方法使用人脐静脉内皮细胞 (huvec), 这是通过与人脐带分离的既定协议产生的。这种临床资源的优点是很容易作为生物副产品获得, 同时也提供了一个合理的内皮细胞产量, 可以从脐静脉分离。我们还使用荧光染料和免疫荧光来区分不同的细胞成分, 并使用共聚焦显微镜明确定义单核细胞定位 (腔内与烧黑细胞) 随着时间的推移。本文所介绍的协议是为了同时测量单核细胞亚群的迁移水平而制定的。此外, 应当指出, 这种方法可以通过使用不同的生物标志物和标签, 扩大到研究其他白细胞亚群和招募过程。

研究方案

人类材料是在自愿捐助者知情同意的情况下, 根据瑞士临床研究道德委员会使用的。

1. 人脐静脉内皮细胞的分离和冷冻 (huvec)

1. 在 ph 为7.4 的情况下, 在 ph 为7.4 的情况下, 在 ph 值7.4 下, 在 t75 瓶中加入5毫升的涂层溶液, 在37°c 下进行30分钟的涂装液。
2. 用 pbs 清洁绳子, 用无菌压缩器擦拭, 并将其放入20厘米的无菌培养皿中。用无菌剪刀剪断绳子的两端。
3. 识别单个大静脉和两条小动脉。轻轻地将带有三通的插管插入脐带末端的静脉四肢。
4. 用一定的电线将电源线和插管连接牢固地拧紧。
5. 用含有 100 u\ ml 青霉素、100 umml 链霉素和 250 ng/mL 两性霉素 b 的 rpmi 介质的 20 ml 完美地使用两种电源线来清洗脐带的静脉。这个过程使绳子的外观更白, 更清晰。在胶原酶添加之前, 用注射器在一端收集 rpmi, 将静脉清空。
6. 用 i 型 1 mgml 胶原酶 (0.22μm 过滤) 的 12 ml 完美利用静脉。
7. 关闭电源线末端的塞子, 在37°c 下孵育电源线12分钟。
8. 轻轻按摩脐带, 将内皮细胞从静脉腔中分离。
9. 取30毫升的 rpmi 含有10% 的胎儿小牛血清与50毫升注射器, 并将其连接到脐带的一端。
10. 将一个空的50毫升注射器连接到脐带的另一端
11. 打开塞子, 从一端灌注静脉, 同时从另一端相互收集。
    请注意:收集到的悬浮液中含有内皮细胞。
12. 将此细胞悬浮液以 200 x g离心5分钟。
13. 丢弃上清液, 用10毫升的完整 mL 培养基重新悬浮细胞颗粒 (mL 含有 20% fcs, 15μgml 内皮细胞生长补充剂, 100μgml 肝素钠, 0.5μm 氢化可的松, 10μgml l-抗坏血酸, 100 u/ml 青霉素, 100 u/ml链霉素和 250 ngml 两性霉素 b)。
14. 从 t75 烧瓶中取出涂层溶液, 并用 pbs 冲洗一次。
15. 将从步骤1.13 中收集的细胞放入 t75 烧瓶中, 并将其放入37°c 的孵化器中, 其中5% 的co 2。
16. 第二天, 用完整的 m199 培养基冲洗烧瓶 3次, 去除残留的红血球, 然后每2天更换一次, 直到融合。
17. 在80–90% 的融合时, 用5毫升的 pbs 冲洗 huvec 单层一次, 并在13°c 的 1 mm edta 中用5毫升的500% 胰蛋白酶分离细胞 5分钟, 加入4毫升的 mL 和1毫升的 fcs, 以阻止胰蛋白酶的作用。冲洗烧瓶, 将所有 huvec 分离。
18. 收集50μl 的脂肪, 用于 ve-cadherin、pecam-1 和 gp38 的染色, 并通过流式细胞仪分析, 以检查 huvec 的纯度。
19. 在 200 x g 的15毫升管和离心机中收集1.18 步中的 huvec 剩余部分, 在室温下5分钟。
20. 从步骤1.19 中丢弃上清液, 以 5 x 10 5 细胞/冷冻槽中的密度重新悬浮冷冻溶液中的细胞颗粒 (fcs 中含有 10% dmso), 并在-80°c 或液氮中冷冻, 直至使用.
21. 要检查 huvec 的纯度:
    1. 在步骤1.18 中采集的 50μl huvec 抗体中加入1μl 的抗人 ve-cadherin-fitc 抗体, 将1μl 的抗人 pecam1-pe 抗体和1μl 的抗人类 Podoplanin-APC 抗体添加到该抗体中。
    2. 在室温下孵化10分钟。
    3. 在 400 x g 的情况下添加100μl 的 pbs 和离心机, 为 30秒.
    4. 丢弃上清液, 在100μl 的 pbs 中重新悬浮。现在可以通过流式细胞仪技术获取数据。
       请注意:huvec 对 ve-cadherin 和 pecam-1 呈阳性, 对 podoplanin 呈阴性。

2. huvec 除霜

请注意:在低通道下使用 huvec 进行实验 (最多5个通道)。

1. 在37°c 下, 用1毫升的涂层溶液涂上 t75 烧瓶30分钟。
2. 在37°c 下快速解冻 huvec 2分钟, 并在完整 mL 的10毫升中重新悬浮细胞。
3. 在室温下以 200 x克离心细胞 5分钟, 并丢弃上清液。
4. 在完整的 mL 的10毫升中重新使用细胞颗粒。
5. 将电池悬浮液转移到预涂布瓶中。将烧瓶放入37°c 的孵化器中, 采用5% 的 co2.每2天改变一次细胞培养培养基。

3. 0.4 μ-sut 室中的 huvec 培养

1. 在开始流动实验前 5天, 在37°c 下, 用30μl 的 pbs 预涂上0.4μl 的室, 其中含有 0.1 mg/ml 胶原蛋白 g, 0.2% 明胶在37°c 下, 时间为30分钟。
2. 用100μl 的 pbs 清洗腔。
3. 从 t75 烧瓶的80–90% 的融合 huvec 中分离细胞。
4. 用5毫升的 pbs 冲洗 huvec, 用5毫升的0.05% 胰蛋白酶在37°c 下分离5分钟。
5. 在完整的 m199 中冲洗和收集细胞悬浮液, 并用最方便的方法计数细胞。在室温下以 200 x g 离心5分钟。
6. 将细胞颗粒在 10^{6 细胞}中重新移植, 每个腔内分配 30μl (30, 000 细胞)。
7. 在37°c 的孵化器中孵育细胞, 用5% 的 co2 孵育 1小时。
8. 在每个腔中加入150μl 的完整 m199, 并在37°c 和 5% co 2 的孵化器中培养细胞 5天.每2天更换一次介质。

4. huvec 染色用于流动下单核细胞的招募检测

1. 准备由 m199 和1μm 的 cmfda (5-氯甲基荧光素二乙酸酯) 制成的标记介质, 并在37°c 加热5分钟后再贴上标签。
2. 用在37°c 加热的 m199 介质清洗 huvec 两次。
3. 将该培养基更换为含有 1μm cmfda 的30μl 的加热标记介质, 并在37°c 和 5% co 2 处放入孵化器中10分钟。
4. 用完整的 m199 清洗一次, 并在37°c 和 5% co 2 的孵化器中用完整的 m199 孵育细胞 30分钟。
   请注意:重要的是要在添加标签溶液之前去除血清的所有痕迹, 否则可能会改变 huvec 染色。
5. 将介质替换为含有人类 tnfα (500 uml) 或人 tnfα (500 u/ml) 与人 vegfa (1μgml) 混合在37°c 和 5% co2 的孵化器中6小时的完整 m199.

5. 人的泛单核细胞的分离和亚群的染色

1. 使用在 edta 真空管中收集的浓缩人体血液的蓬松涂层, 或20毫升新分离的人体血液。
2. 稀释 pbs-1 mm edta (1:1) 中的血液, 并在密度梯度介质的20毫升顶部轻轻输送20毫升稀释的血液。在室温下, 以 400 x g离心 30分钟, 加速缓慢, 无需刹车。
3. 将外周血单个核细胞 (pbmc)-血小板层 (密度梯度介质与等离子体层之间) 收集到含有 40ml pbs-1 mm edta 的 50 ml 管中。使用 pbs-1 mL edta 顶部高达50毫升。
4. 在室温下离心 5分钟, 丢弃上清液。
5. 用10毫升染色缓冲液 (pbs-1 mm edta 含有0.5% 的牛血清白蛋白 bsa) 对细胞颗粒进行再利用。
6. 在室温下离心 5分钟, 丢弃上清液。
7. 重复步骤5.5 和5.6。
8. 用10毫升染色缓冲液重新弹性细胞颗粒。取10μl 的 aliquot 进行细胞计数。
9. 用流式细胞仪快速检查 pbmc 的数量和细胞计数。
   请注意:可以观察到典型的淋巴细胞和单核细胞群 (图 1 a)。从50毫升的新鲜人类血液预计约 50-100 x^{10 6} pbmc。
10. 对于招聘 cd14+ 与 cd14-pbmcmc 的招聘, 流量如下:
    1. 用流动缓冲液 (mL 含有 0.5% bsa) 清洗三次颗粒, 并在流动缓冲液中重新悬浮单个核细胞, 每毫升 6 x^{10 6}细胞。
    2. 为每种检测制作200μl 的等价物。在37°c 下进行培养, 直到检测前20分钟。
    3. 在每个浓度为2微米的最终浓度为2μm 的情况下, 加入5μl 的抗 cd14-pe 和 hoechst 33342。在37°c 下混合孵育10分钟。
    4. 以 400 x g 离心 30分钟.
    5. 丢弃上清液, 用200μl 的流动缓冲液重新悬浮颗粒。
11. 对于在流动的单核细胞亚群的招募:
    1. 根据制造商的指示, 用平底锅单核细胞隔离试剂盒隔离单核细胞。
       请注意:下面的隔离协议适用于 50 x 10^6个单元。只要是在制造商的建议范围内, 就可以放大或缩小它。
    2. 在室温下以 200 x克离心 pbmc 悬浮液5分钟。
    3. 丢弃上清液, 用400μl 染色缓冲液重新悬浮颗粒。
    4. 加入50μl 的 fc 受体阻滞剂和50μl 的潘单核细胞抗体鸡尾酒。
    5. 在室温下孵化10分钟。
    6. 加入400μl 染色缓冲液和100μl 磁珠共轭抗生物素抗体。在室温下孵化15分钟。
    7. 添加2毫升染色缓冲液, 并使用与磁铁耦合的 mL ls 柱。
    8. 将 ls 列放在磁铁上, 加入1毫升的染色缓冲液。放弃流通。
    9. 通过柱内 pbmc 悬浮液, 通过在一个新的 15 ml 管中含有盘单核细胞, 收集清晰的流量。
    10. 添加染色缓冲液, 最多可达5毫升。
    11. 取一个脂肪, 并检查单核细胞分离的质量与流式细胞仪。
    12. 确定平底锅单核细胞计数。
        请注意:只能观察到单核细胞群(图 1b)。
    13. 将步骤5.11.11 的其余单核细胞以 200 x g离心5分钟。
    14. 放弃上清液。
    15. 在5毫升的流动缓冲液 (mL 含有 0.5% bsa) 中重新选择细胞颗粒。
    16. 重复 5.11.13 5.11.14 两次, 以消除 edta 的任何痕迹。
12. 在流动缓冲液 (m199 与 0.5% bsa) 中, 在 6 x^{10 6 细胞}/ml 中进行单核细胞悬浮液。
13. 每次招募时, 可制作200μl 单核细胞。
14. 将脂肪保持在37°c 的孵化器中, 直到注射前20分钟。
15. 在每个算法上加入5μl 的抗 cd16-pe 抗体和 hoechst 33342 (2μm 最终抗体)。
16. 在37°c 下混合孵育10分钟。
17. 以 400 x g 离心 30分钟.
18. 丢弃上清液, 用250μl 的流动缓冲液重新悬浮颗粒。
19. 在滑块的一个腔中加入30μl 的单核细胞悬浮液, 用于在共聚焦显微镜上设置采集参数。
20. 在37°c 下保持步骤5.18 中的单核细胞悬浮液等价物。
    请注意:此悬架已准备好在流系统中注入。

6. 流体系统的制备

1. 确保用于成像的细胞孵化器设置为37°c。
   请注意:流系统的示意图如图 2所示。
2. 组装管材部分 i: 将 luer 连接器男插入一块硅胶管的一端 (8 厘米长, 3 毫米厚), 并将另一端连接到在线 luer 注塑装置。将后一个 luer 连接器连接到一端的硅胶管 (40 厘米和3毫米厚)。
   请注意:(可选) 可在在线 luer 注塑装置和硅胶管之间插入连接到5毫升注射器的三通水龙头, 以便最终去除气泡。
3. 组装管材第二部分: 将20毫升注射器连接到硅胶管长度 (1 米长和3毫米厚) 的一端。将 luer 连接器与管材的另一端插入。
4. 通过将 luer 连接器男性插入女性 luer 锁耦合器连接第一部分和第二部分管 (图 2a)。
5. 将硅胶管的自由端放入含有流动缓冲液 (m199 + 0.5% bsa) 的储罐中, 在37°c 加热。
6. 拉上20毫升注射器的柱塞, 将油管填充流动缓冲器。
7. 将注射器放在泵上并固定。
8. 将泵设置为抽取模式 (而不是注入), 并指定流速。
9. 使用以下公式, 根据使用的 bidi 幻灯片确定流量:
   
   注意: 幻灯片因子取决于用于实验的 bidi 幻灯片。对于本例中使用的μ-幻灯片 i 0.4 luer^锁, 幻灯片因子为131.6。有关特定幻灯片因素, 请参阅公司网站¹⁴。流动缓冲粘度为 0.0072 dyn.n. s/cm²。后毛细血管静脉的剪切应力约为 0.5 dyncm2.
10. 连接幻灯片 (图 2b):
    1. 夹紧硅胶管周围的女性卢尔锁耦合器, 并断开两个卢尔连接器男性从耦合器。
    2. 将它们连接到含有受激 huvec 的滑块的储层, 并用培养基填充。在此步骤中避免气泡。
    3. 取下夹子, 确保连接没有泄漏。
11. 将幻灯片置于显微镜下, 进行延时成像, 然后启动泵。

7. 共聚焦显微镜下单核细胞在流动中的延时成像

1. 使用40x 的目标 (参见材料表) 进行成像。
2. 激活 405 nm (蓝色单核核)、405 nm (绿色内皮细胞) 和 561 nm (红色 cd16 + 子集) 激光。
3. 使用包含单核细胞的腔来设置采集参数。
   请注意:为了检测非迁移和迁移的单核细胞, 激光 405 nm 的针孔和强度都被设置得很高。因此, 非迁移单核细胞在基础计划中略显可见。然而, 只有迁移的单核细胞呈现一个未染色的区域周围的细胞核对应的新的空间占去的内皮细胞之下。
4. 将要获得的腔置于显微镜下。
5. 选择1厘米半径范围内的3个视场, 进行多位置共聚焦成像。
6. 定义内皮细胞的基部和顶端侧
7. 将 z 堆栈设置为10–12微米范围 (0.5μm 步骤)。每1分钟运行一次延时采集。
8. 成像3分钟后, 通过在线卢尔注射液口注入200μl 单核细胞悬浮液 (6x10^{6 细胞}/毫升)。
   请注意:快速单核细胞出现在顶端的焦点平面上, 粘附并开始迁移 (从顶端过渡到基底计划)。
9. 图像至少30分钟。完成后, 停止成像并停止流动。夹紧管道, 使其与滑梯断开。
10. 在4°c 下, 用4% 的甲醛固定幻灯片10分钟。
11. 使用 pbs 清洗幻灯片, 并将幻灯片存放在 4°c, 以便在需要时进行进一步分析。

8. 使用映像分析数据 j

1. 数一数每个领域的总粘附单核细胞的数量。确定每毫米2的细胞计数。
2. 计数迁移的单核细胞存在于内皮细胞下面的基础计划中, 并通过细胞核周围存在一个黑洞 (在绿色通道中) 来识别。
3. 将迁移的白细胞计数除以粘附白细胞的总数。迁移率表现为粘附单核细胞的百分比。
4. 为了说明, 顶端和基部的两侧可以同时显示, 以说明发生在每个内皮隔间的事件。

结果

tnfα诱导 huvec 活化状态的测定

炎症细胞因子 tnfα的生物活性可根据冻融循环的批次和重复而变化。tnfα治疗对 huvec 的活化状态进行检查是非常重要的。这可以通过平行染色的一些融合 huvec 样品进行炎症诱导选择, icam-1 和 vcam-1^15,16,17。一种更简便的方法来检查...

讨论

在这里, 我们报告了一个方法详细介绍了单核细胞亚群如何通过发炎的内皮单层迁移的研究。讨论的方法采用共聚焦显微镜代替相对比显微镜, 也用于研究流^{3、11、19 下}单核细胞的招募。使用共聚焦显微镜进行延时成像的一个主要优点是能够明确区分单核细胞的迁移和强粘附。虽然基于相对比显微镜的方法也很稳健, 但它需要专...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Culture Flasks 75 cm2	TPP	90076	Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4	IBIDI	80606
Centrifuge Tubes 15 mL	TPP	191015
Centrifuge Tubes 50 mL	TPP	191050
Collagen G	Biochrom	L 7213	For coating of cell culture flasks
Gelatin	Sigma-Aldrich	1393	For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8662
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich	R8758
3-Way Stopcocks	BIO-RAD	7328103
penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL	AMIMED	4-02F00-H
Collagenase type 1	Worthington	LS004216
Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes	GIBCO	22340020
Bovine Albumin Fraction V	ThermoFisher	15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg	Millipore	02-102
Heparin Sodium	Sigma-Aldrich	H3149RT
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H6909
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O	APPLICHEM	A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC	Miltenyi Biotech	130-100-713	AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE	Miltenyi Biotech	130-110-807	AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC	Miltenyi Biotech	130-107-016	AB_2653263
BD Accuri C6 Plus	BD Bioscience
µ-Slide I Luer	IBIDI	80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)	ThermoFisher	C2925
Recombinant human TNFα	Peprotech	300-01A
Recombinant human VEGFA	Peprotech	100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump	KF Technology	NE-1000
Ficoll Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE	Miltenyi Biotech	130-110-519	AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human	Miltenyi Biotech	130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE	Miltenyi Biotech	130-106-762	AB_2655403
LS columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	ThermoFisher	H1399
Silicone tubing	IBIDI	10841
Elbow Luer Connector	IBIDI	10802
Female Luer Lock Coupler	IBIDI	10823
Luer Lock Connector Female	IBIDI	10825
In-line Luer Injection Port	IBIDI	10820
Ar1 confocal microscope	Nikon
40x objective	Nikon	40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software	NIH