생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

요약

여기, 우리가 특정 표면 마커 및 공초점 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 흐름 체 외에서 매매 하는 monocyte 부분 모집단을 측정 하는 통합된 프로토콜 제시. 이 프로토콜은 다른 특정 표면 마커를 사용 하 여 다른 백혈구 하위 프로로 뿐만 아니라 순차 모집 단계를 탐험 하 사용할 수 있습니다.

초록

타겟된 주변 조직에 혈액에서 monocytes의 모집 조직 부상, 종양 개발 및 자가 면역 질환 염증 과정에 중대 하다. 이것은 그들의 접착 및 transendothelial 마이그레이션 (환생) 뒤에 기본 영향을 받는 조직으로 활성화 된 내 피 세포의 표면에 luminal 무료 흐름에서 캡처의 과정을 통해 촉진 된다. 그러나, monocyte 모집단의 특혜와 맞는 채용을 지 원하는 메커니즘은 아직 완전히 이해. 따라서, 다른 monocyte 모집단 동시에 시각화 하 고 흐름에서 측정의 채용을 허용 하는 방법을 개발 했습니다. 시간 경과 confocal 영상에 따라이 메서드는 부착 및 transmigrated monocytes 사이 명확한 구별에 대 한 수 있습니다. 여기, 우리는이 메서드를 사용 하 수 있습니다 프로 신생 및 비 신생 monocytes 체 외의 모집 캐스케이드를 동시에 공부 하는 방법을 설명 합니다. 또한,이 메서드는 최대 3 개의 monocyte 인구의 신규 모집의 다른 단계를 공부 하 확장할 수 있습니다.

서문

Monocytes의 병원 체, 손상 된 조직, 신생, 고 암^{1,2,3 포함 하 여 많은 질병의 병 태 생리학 정리 싸움을 위해 필수적 이다 타고 난 면역 phagocytic 구성 요소 구성} . Monocytes는 골 수 유래 세포 혈액에 순환 하지만 특정 분자 메커니즘을 통해 주변 조직에 염증의 사이트에 채용 될 수 있는 다른 유형의 모집단의 구성 이다. Monocytes, 백혈구에 관해서는 모집 캐스케이드 일반적으로 다른 단계 캡처, 압 연, 크롤링, 체포, transendothelial 마이그레이션 (환생) 및 혈관 벽 (지하실 멤브레인와 벽화를 통해 마이그레이션 등 연루 셀)⁴. 다음이 단계는 주로 ligands selectin 같은 백혈구에 풀, 당단백질 ligands, 발산, 세포 및 접합 접착 분자, 그리고 그들의 수용 체와 같은 내 피 luminal 표면에 염증 유발 분자를 포함 그리고 integrins입니다. 밀매 경로 중 하나는 내 피 세포 접합 (paracellular) 나 내 피 세포 체 (transcellular)를 통해 백혈구에 의해 내 피 장벽⁵를 사용할 수 있습니다. Monocytes transcellular 경로 통해 transmigrate를 역사적으로 문서화 되어, 하는 동안 그들의 철새 통로의 잠재적인 차이점 monocytes 균질 세포 인구 이라고 여겨진다 이상으로 제안 되었습니다. 그것은 이제 분명 monocyte 다양성 각 그들의 차이 공통점에 의해 정의 될 수 있습니다, 그들의 독특한 넘쳐 흐름에 관하여^3,6폭포 되고있다. 따라서, monocyte 모집단 사이 차별 명확 하 게 하기 위해 시각화 하는 중요 한 고 형 채용 중이 다른 모집단의 각 동작을 처리.

인간 monocytes, 돼지, 쥐, 마우스 특정 관찰 기능 및 특정 철새 동작^7,,89phenotypic 모집단으로 세분화 했다. 예를 들어 인간 monocytes는 CD16, Fc 감마 수용 체 III CD14, 세균성 lipopolysaccharide에 대 한 coreceptor의 그들의 표면 식에 따라 3 개의 하위 집합으로 나눌 수 있습니다. 인간 monocyte 모집단 클래식 CD14 포함⁺CD16^-, CD14 중간⁺CD16⁺ 및 비 고전 CD14^어둡게CD16⁺ 세포^6,9. 클래식 CD14⁺CD16^- monocytes는 주로 염증 성 표시 했다 반면 CD16 수영장⁺ monocytes 총칭 TIE2 표현과 proangiogenic 함수¹⁰선물을 발견 했다. 일관 되 게, 인간의 종양 괴 사 등 염증 성 cytokines와 내 피 성장 세포 자극 인자 (TNF) α 또는 인터 루 킨 (일리노이-1) 베타 (기존의 염증)은 고전 CD14의 완전 한 신규 모집을 실행 하는 충분 한⁺CD16 ^- monocytes입니다. 그러나, 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)와 TNFα (신생 요소 기반 염증)의 동시 작업은는 CD16의 환생을 자극 하는 데 필요한⁺ monocytes³의 proangiogenic 풀. 역사적으로, 정적 조건, 병렬 플레이트 흐름 챔버 및 µ-슬라이드 흐름 챔버 전통적인 Transwell 시스템 양적 분석 한 시간에서 시험관에^{11에 한 백혈구 인구의 모집 하는 데 사용 되었습니다. ,,1213}. 이러한 프로토콜을 검증 하는 동안 여러 monocyte 모집단의 동시 분석을 허용 하는 더 강력한 방법 여겨질 것입니다 더 많은 통찰력. 이러한 방법론 여러 상호 작용 및 각 각각의 서로 다른 주파수를 담당 하 고 또한 각 monocyte 정의 하는 모집 계곡에 대 한 유사성과 특이성의 기계적 이해를 제공 해야 합니다. 하위 집합입니다.

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 동시에 공부 될 다른 monocyte 모집단의 철새 계곡 수 있는 흐름 아래 monocyte 모집의 시간 경과 영상에 따라 방법 제시. 이 방법은 hemodynamics 순환 후 모 세관 venules에 monocytes의 vivo에서 백혈구 신규 모집의 주요 위치 뿐 아니라 내 피 세포 염증, 모방 하는 특정 중요 한 기능을 통합 합니다. 제안 된 방법은 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC), 인간의 탯에서 고립의 잘 설립 된 프로토콜을 통해 생성 되는 사용 합니다. 이 임상 자원 또한 탯 줄 정 맥 으로부터 격리 될 수 있는 내 피 세포의 적당 한 수익률을 제공 하는 반면 생물 학적 부산물로 쉽게 사용할 수 있는 이점이 있다. 우리는 또한 사용 형광 염료와 면역 형광 monocyte 위치 (abluminal 대 luminal) 명확 하 게 정의에 confocal 현미경 검사 법 및 다른 세포질 구성 요소 구분을 시간이 지남에. 여기에 제시 된 프로토콜을 동시에 측정 monocyte 모집단의 환생 레벨 개발 되었습니다. 또한, 그것은 다른 biomarkers 및 라벨의 사용 하 여이 방법론 공부 다른 백혈구 모집단 및 채용 프로세스를 확장할 수 있습니다 주목 해야한다.

프로토콜

인간의 재료 자원 봉사 기증자의 및 임상 연구에 스위스 윤리 위원회에 통지 해준 동의 함께 사용 되었다.

1. 격리와 인간의 탯 줄의 정 맥 내 피 세포 (HUVEC)

1. HUVEC 절연을 시작 하기 전에 코팅 솔루션의 5 mL는 T75 플라스 크 (0.1 mg/mL 콜라겐 G 및 인산 버퍼 pH 7.4에서 염 분 PBS에 0.2% 젤라틴) 37 ° C에서 30 분을 추가 합니다.
2. PBS 가진 코드를 청소, 살 균 압축으로 닦 고 살 균 20 cm 배양 접시에. 살 균가 위 코드의 끝을 잘라.
3. 하나의 큰 정 맥과 두 개의 작은 동맥을 식별 합니다. 부드럽게 코드 끝에 정 맥 사지에 그것에 연결 된 3 방향 자 지와 함께 한 캐 뉼 러를 삽입 합니다.
4. 코드 및 정 맥 연결 와이어의 길이와 단단히 조입니다.
5. 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스 250 ng/mL 코드의 혈관을 씻어 암포 B 포함 된 RPMI 매체의 20 mL로 두 번 코드 perfuse 이 프로세스 하얀 하 고 명확 하 게 코드의 모양을 만든다. 한쪽 끝에 주사기는 RPMI 수집 하 여 콜라 추가 하기 전에 정 맥을 비어 있습니다.
6. 1 mg/mL 콜라 형식의 12 mL와 함께 정 맥 perfuse 나 (0.22 μ m 필터).
7. 닫기 코드에서 자 지 그리고 12 분 동안 37 ° C에서 코드를 품 어.
8. 부드럽게 마사지 정 맥 루멘에서 내 피 세포를 분리 하려면 코드.
9. 받아 30 mL 50 mL 주사기 10% 태아 종 아리 혈 청에 포함 된 RPMI의 고 탯의 한쪽 끝을 연결 합니다.
10. 탯의 다른 쪽 끝에는 빈 50 mL 주사기를 연결
11. 자 지를 열고 상호로 다른 쪽 끝에서 수집 하는 동안 한쪽에서 정 맥을 perfuse.
    참고: 수집 된 서 스 펜 션 내 피 세포를 포함 되어 있습니다.
12. 5 분 동안 200 x g 에 세포 현 탁 액이 원심
13. 삭제는 상쾌한 고 완전 한 M199 매체 (M199 포함 20 %FCS, 15 µ g/mL 내 피 세포 성장 보조 제, 100 µ g/mL 헤 파 린 나트륨, 0.5 µ M 날린, 10 µ g/m l L-아 스 코르 빈 산, 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 스 고 250 ng/mL 암포 B).
14. T75 플라스 크에서 코팅 솔루션을 제거 하 고 PBS로 한 번 씻어.
15. 씨 셀 T75 플라스 크에 1.13 단계에서 수집 하 고 5% CO₂와 37 ° C에서 인큐베이터에 배치.
16. 다음 날, 린스 3 번 잔여 적혈구를 제거 하 여 다음 변경할 매체 합류까지 2 일 마다 완전 한 M199 매체와 플라스 크.
17. 80-90% 합류 HUVEC 단층 PBS의 5 mL로 한 번 헹 구 고 M199의 5 분 추가 4 mL과 트립 신 작업을 중지 하는 FCS의 1 mL에 대 한 37 ° C에서 1 mM EDTA에에서 0.05 %trypsin 5 mL로 세포를 분리. 모든 HUVEC를 분리 하려면 플라스 크를 플러시.
18. VE cadherin, PECAM-1 및 gp38, 얼룩에 사용할 cytometry HUVEC 순도 확인 하 여 분석을 50 µ L의 약 수를 수집 합니다.
19. 실 온에서 5 분 동안 200 x g에서 15 mL 튜브와 원심 분리기에서 1.18 단계에서 HUVEC의 나머지를 수집 합니다.
20. 단계 1.19에서에서 상쾌한 삭제 하 고, resuspend cryotubes에서 5 x 10⁵ 셀/mL의 조밀도에 솔루션 (10 %DMSO 포함 하는 FCS)에 셀 펠 릿 사용까지-80 ° C에 또는 액체 질소에서를 고정.
21. HUVEC 순수성을 확인:
    1. HUVEC 1.18 단계에서 수집 된의 50 µ L의 약 수를 반대로 인간 VE cadherin FITC 항 체의 1 µ L, 1 µ L의 반대로 인간 PECAM1 PE 항 체, 및 반대로 인간 Podoplanin APC 항 체의 1 µ L를 추가 합니다.
    2. 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
    3. 400 x g 30에서 100 µ L의 PBS와 원심 분리기를 추가 s.
    4. 삭제는 상쾌한 고 PBS의 100 µ L에서 resuspend. 데이터 흐름 cytometry 기술로 이제 인수 수 있습니다.
       참고: HUVEC VE cadherin 및 PECAM-1에 대 한 긍정적이 고 부정적인 Podoplanin에 대 한 있습니다.

2. HUVEC 녹 이기

참고: 낮은 통로에 HUVEC를 사용 하 여 실험 (최대 5 구절).

1. 30 분 동안 37 ° C에서 코팅 솔루션의 1 mL와 T75 플라스 크 코트.
2. 급속 하 게 2 분 동안 37 ° C에서 HUVEC defreeze 하 고 완전 한 M199 10 mL에 셀 resuspend.
3. 5 분 동안 실 온에서 200 x g 에서 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한.
4. 완전 한 M199 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.
5. 미리 코팅된 플라스 크에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 5% CO₂와 37 ° C에서 인큐베이터에 플라스 크를 배치 합니다. 세포 배양 매체 매 2 일 변경.

3. HUVEC 문화 0.4 µ 슬라이드 챔버에

1. 흐름 실험을 시작 하기 전에 5 일 미리 0.1 mg/mL 콜라겐 G, 30 분 동안 37 ° C에 0.2% 젤라틴을 포함 하는 PBS의 30 µ L로 0.4 µ-슬라이드의 실 코트.
2. 100 µ L의 PBS와 챔버 세척.
3. T75 플라스 크의 80-90% confluent HUVEC에서 세포를 분리 합니다.
4. PBS의 5 mL와 함께 HUVEC를 헹 구 고 5 분 동안 37 ° C에서 0.05 %trypsin 5 mL와 함께 그들을 분리.
5. 플러시 및 완전 한 M199에 세포 현 탁 액을 수집 하 고 가장 편리한 방법으로는 셀의 개수. 실 온에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심.
6. 10⁶ 셀/mL에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 챔버 당 30 µ L (30000 셀) 배포.
7. 1 시간에 5% CO₂ 와 37 ° C에서 인큐베이터에 셀을 품 어.
8. 각 약 실에 완전 한 M199의 150 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO₂배양 기에서 5 일 동안 셀 문화. 매체 매 2 일 변경.

4. HUVEC 흐름 아래 Monocyte 모집 분석 결과 대 한 얼룩

1. M199 및 CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)의 1 개의 µ M 라벨 매체를 준비 하 고 셀 라벨 전에 5 분 동안 37 ° C에서 그것을 따뜻하게.
2. 37 ° c.에 M199 매체와 두 번 씻어 HUVEC 따뜻하게
3. 따뜻하게 라벨 매체를 포함 하는 CMFDA의 1 개의 µ M의 30 µ L 매체를 바꿉니다 고 10 분 동안 37 ° C, 5% CO₂ 배양 기 합니다.
4. 완전 한 M199로 한번 세척 하 고 30 분 동안 37 ° C, 5% CO₂ 배양 기에서 완전 한 M199 셀을 품 어.
   참고: 라벨 솔루션을 추가 하기 전에 혈 청의 모든 흔적을 제거 하는 것이 중요 하다, 그렇지 않으면 그것은 HUVEC 얼룩을 변경할 수 있습니다.
5. 대체 어느 인간의 TNFα를 포함 완전 한 M199와 매체 (500 U/mL) 또는 인간 TNFα의 혼합 (500 U/mL) 인간의 VEGFA와 (1 µ g/mL) 37 ° C, 5% CO₂배양 기에서 6 h에 대 한.

5. 인간의 팬 Monocytes 그리고 모집단의 얼룩의 격리

1. 사용 하 여 집중 인간의 피 버 피 코트 또는 EDTA vacutainer 튜브에 실험 당일 수집 갓 고립 된 인간의 혈액의 20 mL.
2. PBS-1 mM EDTA (1:1)에 혈액을 희석 하 고 부드럽게 밀도 그라데이션 미디어의 20 mL 위에 희석된 혈액의 20 mL를 플라스틱. 천천히 가속 및 브레이크 없이 실 온에서 30 분 400 x g 에서 원심.
3. 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 수집-PBS-1 mM EDTA의 40 mL를 포함 하는 새로운 50 mL 튜브에 혈소판 레이어 (밀도 그라데이션 미디어 플라즈마 레이어 사이). 최대 50 mL PBS-1 mM EDTA와 함께 톱.
4. 5 분에 대 한 실 온에서 200 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.
5. 얼룩 버퍼 (PBS-1 mM EDTA 0.5% 소 혈 청 알 부 민 BSA를 포함)의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend
6. 5 분에 대 한 실 온에서 200 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.
7. 5.5-5.6 단계 반복 합니다.
8. 버퍼를 얼룩이 지기의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 셀 개수에 대 한 10 µ L의 약 수를 가져가 라.
9. PBMC 인구를 확인 하 고 빠르게 교류 cytometer와 셀.
   참고: 특성 림프 구 및 monocyte 인구 (그림 1A) 관찰 될 수 있다. 에 대해 기대 하는 신선한 인간의 혈액 50 mL에서 50-100 x 10⁶ PBMC.
10. CD14 + 대 CD14-PBMC 흐름에서의 채용에 대 한:
    1. 세 번 흐름 버퍼와 펠 릿을 세척 (M199 0.5 %BSA 포함)와 resuspend mL 당 6 x 10⁶ 세포에 흐름 버퍼에서 단 세포.
    2. 각 분석 결과 대 한 200 µ L의 aliquots를 확인 합니다. 분석 결과 전에 20 분까지 37 ° C에서 품 어.
    3. 각 약 수를 안티-CD14-PE와 2 µ M의 최종 농도에 Hoechst 33342 5 µ L를 추가 합니다. 혼합 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    4. 30에 대 한 400 x g 에서 약 수를 원심 s.
    5. 삭제는 상쾌한 고 흐름 버퍼의 200 µ L와 펠 릿을 resuspend.
11. 흐름에서 monocyte 모집단의 채용에 대 한:
    1. 제조업체 지침에 따라 팬 monocyte 격리 키트 monocytes를 격리 합니다.
       참고: 다음 격리 프로토콜 50 x 10⁶ 세포입니다. 그것은 확장할 수 있습니다 위 또는 아래로 그것은 제조 업체의 권장 사항을 내로.
    2. 5 분 동안 실 온에서 200 x g 에서 PBMC 정지 원심
    3. 상쾌한 무시 하 고 버퍼를 얼룩이 지기의 400 µ L와 펠 릿 resuspend.
    4. Fc 수용 체 차단 약의 50 µ L 팬 Monocyte 항 체 칵테일의 50 µ L를 추가 합니다.
    5. 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
    6. 버퍼 및 자석 구슬 활용된 반 비오 항 체의 100 µ L를 얼룩이 지기의 400 µ L를 추가 합니다. 15 분 동안 실 온에서 품 어.
    7. 얼룩 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 고 자석으로 결합 맥 LS 열을 사용 하 여.
    8. 자석에 LS 열을 놓고 버퍼를 얼룩이 지기의 1 mL를 추가 합니다. 흐름을 통해 삭제 합니다.
    9. 열에서 PBMC 정지를 통과 하 고 새로운 15 mL 튜브에서 팬 monocytes를 포함 하지만 분명 흐름을 수집.
    10. 5 mL까지 가기로 얼룩 버퍼를 추가 합니다.
    11. 약 수를가지고 고 교류 cytometer는 monocyte 격리의 품질을 확인 하십시오.
    12. 팬 monocyte 개수를 결정 합니다.
        참고: 만 monocyte 인구 (그림 1B)관찰 될 수 있다.
    13. 5 분 동안 200 x g 에서 5.11.11 단계에서 monocytes의 나머지 원심
    14. 폐기는 상쾌한.
    15. 흐름 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend (M199 0.5 %BSA 포함).
    16. 5.11.13에 5.11.14 EDTA의 흔적을 제거 하는 두 번 반복 합니다.
12. 흐름에 monocyte 정지를 만들기 6 x 10⁶ 셀/mL에 (0.5 %BSA M199) 버퍼.
13. 각 모집 분석 결과 대 한 monocytes의 200 µ L의 aliquots를 확인 합니다.
14. 주입 하기 전에 20 분까지 인큐베이터에서 37 ° C에는 약 수를 유지.
15. 각 약 수를 안티-CD16-PE 항 체와 Hoechst 33342 (최종 2 µ M)의 5 µ L를 추가 합니다.
16. 혼합 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
17. 30에 대 한 400 x g 에서 약 수를 원심 s.
18. 삭제는 상쾌한 고 흐름 버퍼의 250 µ L와 펠 릿을 resuspend.
19. Confocal 현미경에 인수 매개 변수 설정에 대 한 봉사를 슬라이드의 한 챔버에 monocyte 정지 30 µ L를 추가 합니다.
20. 37 ° c.에 단계 5.18에서에서 monocyte 서 스 펜 션의 aliquots를 유지
    참고: 이 현 탁이 액 흐름 시스템에 주입 될 준비가 되어 있습니다.

6입니다. 유체 시스템의 준비

1. 37 ° c.에 설정 하는 영상에 대 한 셀 인큐베이터 확인
   참고: 흐름 시스템의 다이어그램은 그림 2에 표시 됩니다.
2. 1 배관 부 조립 실리콘 튜브 (8 cm 길고 3 밀리미터 두꺼운)의 한쪽 끝에 Luer 커넥터 남성 삽입 하 고 다른 쪽 끝에 선 루어 주입 세트에 연결. 커넥터 연결 합니다 후자 Luer 실리콘 튜브 (40 cm 및 3 밀리미터 두꺼운)의 한쪽 끝에.
   참고: 선택적으로, 3-방향 탭 5 mL 주사기에 연결 된 인라인 Luer 주입 세트와 실리콘 최종 공기 거품 제거를 위한 튜브 사이의 삽입할 수 있습니다.
3. 배관 부 II의 조립: 실리콘 튜브 (1 m 및 두께 3 m m)의 길이의 한쪽 끝에 20 mL 주사기를 연결. 삽입 튜브의 다른 쪽 끝에 Luer 커넥터 남성.
4. 연결 부 I와 II 튜브 Luer 커넥터 남성 여성 Luer 잠금 커플러 (그림 2A)을 삽입 하 여 부.
5. 포함 하는 37 ° c.에 예 열 흐름 버퍼 (M199 + 0.5 %BSA) 저수지에서 끝낼 실리콘 튜브의 무료
6. 흐름 버퍼 튜브를 채우기 위해 20 mL 주사기의 플런저를 당겨.
7. 펌프에 주사기를 놓고 그것을 확보 합니다.
8. 펌프를 설정에서 철회 모드 (에 반대)으로 하 고 유량을 지정.
9. 다음 수식을 사용 하 여 사용 하는 IBIDI 슬라이드에 따르면 흐름 율을 결정 합니다.
   
   참고: 슬라이드 요소는 실험에 사용 되는 IBIDI 슬라이드에 의존 합니다. Μ-슬라이드 나^0.4 Luer 잠금이이 예제에서는 슬라이드 요소에에서 사용 되는 131.6. 특정 슬라이드 요소에 대 한 회사 웹사이트¹⁴를 참조 하십시오. 흐름 버퍼 점도 0.0072 dyn.s/cm². 후 모 세관 venules에 전단 응력은 0.5 dyn/cm²에 대해.
10. 슬라이드 (그림 2B) 연결:
    1. 여성 Luer 잠금 커플러 주위 실리콘 튜브 클램프 및 커플러에서 두 Luer 커넥터 남성을 분리 합니다.
    2. 자극의 HUVEC 및 매체와 채우기 포함 된 슬라이드의 저수지에 그들을 연결 합니다. 이 단계 동안 공기 방울을 피하십시오.
    3. 클램프 해제 하 고 연결 유출 되지 않습니다 확인 하십시오.
11. 시간 경과 영상에 대 한 현미경 슬라이드 놓고 펌프를 시작 합니다.

7. Confocal 현미경 검사 법에 의해 흐름 아래 Monocyte 모집 시간 경과 영상

1. 40 x 목표를 사용 하 여 참조 테이블의 자료영상에 대 한.
2. 활성화는 405 nm (블루 monocyte 핵), 488 nm (녹색 내 피 세포) 및 561 nm (빨간 CD16 + 하위 집합) 레이저.
3. 인수 매개 변수를 설정 하는 monocytes를 포함 하는 챔버를 사용 합니다.
   참고: 비 transmigrated와 transmigrated monocytes, 감지 하 고 핀 홀 레이저 405 nm의 강도 높은 설정 됩니다. 따라서, 비 transmigrated monocytes 기저 계획에 약간 볼 수 있습니다. 그러나 단지 transmigrated monocytes는 흠 없는 주변 핵 내 피 세포 아래 점유 하는 새로운 공간에 해당 제시.
4. 현미경 획득 챔버를 놓습니다.
5. 다중 위치 confocal 영상에 대 한 1 cm 반지름 안에서 뷰의 3 필드를 선택 합니다.
6. 정의 기저와 내 피 세포의 꼭대기 측면
7. 10-12 µ m 범위 (0.5 µ m 단계) z-스택을 설정 합니다. 모든 1 분 시간 경과 수집을 실행 합니다.
8. 영상의 3 분 후에 선 루어 주입 포트를 통해 monocyte 정지 (6 x 10⁶ 셀/mL)의 200 µ L를 주사.
   참고: Monocytes 꼭대기 초점면에 표시 하는 급속 하 게 준수 하 고 환생 (기저 계획에는 꼭대기에서 환승)을 시작 합니다.
9. 적어도 30 분에 대 한 이미지입니다. 완료 되 면, 이미지를 중지 하 고 중단. 슬라이드에서 그들을 분리 튜브 클램프.
10. 10 분 동안 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde 슬라이드를 수정 합니다.
11. PBS와 슬라이드를 세척 하 고 필요한 경우 추가 분석을 위해 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.

8. ImageJ와 데이터 분석

1. 각 분야에 총 부착 monocytes의 수를 계산 합니다. M m²당 셀 수를 결정 합니다.
2. 내 피 세포 아래 기초 계획에 존재 하 고 핵 주위 (녹색 채널)에서 블랙홀의 존재에 의해 확인 된 transmigrated monocytes를 계산 합니다.
3. 부착 백혈구의 총 수로 transmigrated 백혈구의 수를 나눕니다. 환생 속도 부착 monocytes의 비율으로 제공 됩니다.
4. 이해를 돕기 위해는 꼭대기와 기저 면 수 표시 동시에 내 피이 구획의 각각에서 발생 하는 이벤트를 설명 하기 위해.

결과

HUVEC 활성화 TNFα에 의해 유도 된의 상태 확인

염증 성 cytokine TNFα의 생물 활동 일괄 처리 및 냉동 녹고 사이클의 반복에 따라 달라질 수 있습니다. 그것은 TNFα 치료와 HUVEC의 활성화 상태를 확인 하는 것이 중요입니다. 이 풀, ICAM-1 및 VCAM-1^15,16,17의 염증 유도 con...

토론

여기, 우리가 어떻게 monocyte 모집단 염증이 내 피 단층을 통해 transmigrate의 연구를 자세히 설명 하는 방법 보고. 토론된 방법 단계 대조 현미경 검사 법, 또한 흐름^3,,1119monocyte 모집을 공부 하는 데 사용 되는 대신 confocal 현미경 검사 법을 사용 합니다. 시간 경과 영상에 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여의 주요 장점 중 하나는 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Culture Flasks 75 cm2	TPP	90076	Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4	IBIDI	80606
Centrifuge Tubes 15 mL	TPP	191015
Centrifuge Tubes 50 mL	TPP	191050
Collagen G	Biochrom	L 7213	For coating of cell culture flasks
Gelatin	Sigma-Aldrich	1393	For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8662
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich	R8758
3-Way Stopcocks	BIO-RAD	7328103
penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL	AMIMED	4-02F00-H
Collagenase type 1	Worthington	LS004216
Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes	GIBCO	22340020
Bovine Albumin Fraction V	ThermoFisher	15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg	Millipore	02-102
Heparin Sodium	Sigma-Aldrich	H3149RT
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H6909
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O	APPLICHEM	A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC	Miltenyi Biotech	130-100-713	AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE	Miltenyi Biotech	130-110-807	AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC	Miltenyi Biotech	130-107-016	AB_2653263
BD Accuri C6 Plus	BD Bioscience
µ-Slide I Luer	IBIDI	80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)	ThermoFisher	C2925
Recombinant human TNFα	Peprotech	300-01A
Recombinant human VEGFA	Peprotech	100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump	KF Technology	NE-1000
Ficoll Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE	Miltenyi Biotech	130-110-519	AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human	Miltenyi Biotech	130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE	Miltenyi Biotech	130-106-762	AB_2655403
LS columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	ThermoFisher	H1399
Silicone tubing	IBIDI	10841
Elbow Luer Connector	IBIDI	10802
Female Luer Lock Coupler	IBIDI	10823
Luer Lock Connector Female	IBIDI	10825
In-line Luer Injection Port	IBIDI	10820
Ar1 confocal microscope	Nikon
40x objective	Nikon	40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software	NIH