体外培养肺泡上皮细胞中卤代气体浓度的控制方法

摘要

我们描述了一个简单的协议, 专门设计, 以达到精确和控制的浓度七氟醚或异氟醚在体外, 以提高我们对介入的机制在上皮性肺损伤的理解和测试小说急性呼吸窘迫综合征的治疗。

摘要

急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 是一种弥漫性肺泡损伤, 肺泡液清除和严重炎症的综合征。使用卤代剂, 如七氟醚或异氟醚, 用于重症监护病房 (ICU) 的镇静, 可以改善气体交换, 减少肺泡水肿, 并在 ARDS 期间减弱炎症。然而, 在 ICU 中使用吸入剂进行持续镇静治疗或预防肺部损伤的数据缺乏。为了研究卤代剂在 "生理" 条件下对肺泡上皮细胞的影响, 我们描述了一种在气液界面培养细胞的简单系统, 并将其暴露在卤化剂中, 以提供精确控制的 "空气" 组分和这些制剂的 "中等" 浓度。我们开发了一个密封的气密室, 其中, 人肺泡上皮永生化细胞的板块可以通过麻醉机电路提供的连续气体流暴露于七氟醚或异氟醚的精确、控制的部分。细胞被暴露在4% 七氟醚和1% 的异氟醚24小时。采用气传质谱法测定了溶于培养基中的卤代剂浓度。在第一个小时后, 在培养基中的七氟醚和异氟醚的浓度分别为251毫克/升和25毫克/升。在培养基中溶解的七氟醚和异氟醚的浓度曲线显示了类似的课程随着时间的推移, 一个高原达到在一个小时后暴露。

本协议是专为达到精确和控制的七氟醚或异氟醚在体外的浓度, 以提高我们对在 ARDS 期间上皮性肺损伤的机制的理解, 并测试新的治疗综合 征。

引言

急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 是一种以弥漫性肺泡损伤、肺水肿、低氧性呼吸衰竭为特征的临床综合征。虽然 ARDS 代表10% 以上的重症监护病房 (icu) 招生和近25% 的 ICU 患者需要机械通气, 但它仍然是一个未被认可的挑战, 临床医生, 医院死亡率为 35-45%¹。尽管进行了大量的研究, 但目前还没有发现有效的 ARDS 药物治疗或预防的方法。两个主要特征导致 ARDS 死亡率: 肺泡液清除 (AFC) 受损 (即肺泡水肿液从远端肺空域的改变吸收) 和严重炎症²。由于 ARDS 死亡率仍然很高, 目前的倡议还应包括初级预防;然而, 一个关键的挑战是找出高危患者, 其中 ards 可能发展和谁将受益, 如果 ards 被阻止。

挥发性卤化麻醉剂, 如七氟醚和异氟醚, 广泛用于在手术室内提供全身麻醉。在全球范围内, 每年有超过2.3亿名患者进行大手术, 需要全身麻醉和机械通气³, 术后肺部并发症对临床结果和医疗保健使用产生不利影响⁴.使用七氟醚代替异丙酚与改善胸部手术患者的肺部炎症有关, 并显著减少不良事件, 如 ARDS 和术后肺部并发症⁵。同样地, 异氟醚预处理对 ARDS^6、7实验动物模型的呼吸力学、氧合和血流动力学有保护作用。虽然进一步的研究有必要解决吸入剂对非心脏手术结果的影响, 但最近在 meta 分析中观察到肺部并发症的类似减少, 表明吸入麻醉剂-作为反对静脉麻醉-与心脏手术死亡率的降低显著相关⁸。

关于使用挥发性药物用于 ICU 患者镇静预防或治疗肺部损伤的具体未来数据缺乏。然而, 现在有几个试验支持吸入七氟醚治疗 ICU 患者镇静剂的功效和安全性, 临床前研究表明, 吸入七氟醚和异氟醚^7,9改善气体交换, 减少肺泡水肿, 并减弱炎症在 ARDS 的实验模型。此外, 七氟醚减轻 II. 型上皮细胞损伤¹⁰, 而异氟醚通过对紧密结蛋白¹¹的调制维持肺泡毛细血管屏障的完整性。然而, 需要进行进一步的研究, 以验证吸入七氟醚和异氟醚的器官保护的实验证据在多大程度上可以转化为人类。本组第一个单中心随机对照试验 (RCT) 发现, 在 ARDS 患者早期使用吸入七氟醚与改善氧合、降低某些亲炎标志物水平和减少肺上皮有关由血浆和肺泡液中晚期糖基化终产物 (sRAGE) 受体可溶性形式的水平评定的损伤¹²。

综合考虑, 七氟醚和异氟醚对肺损伤的有益作用可能指向依赖于愤怒通路的多种生物通路或功能过程, 即肺泡流体清除 (AFC)、上皮损伤、核因子 (NF)-nf-κb 和巨噬细胞活化的易位。此外, 七氟醚可能影响愤怒蛋白本身的表达。自从我们的研究团队和其他人以前的研究支持在 ARDS 的肺泡炎症和肺上皮损伤/修复的关键作用, 我们设计了一个实验模型, 以提供对机制的翻译理解七氟醚在肺损伤和修复^13,14,15。本文研究了一种新型的人肺泡上皮原代细胞系中七氟醚和异氟醚的体外作用, 目的是探讨外周肺 hAELVi (人肺泡上皮慢病毒) 的气-血屏障。永生化), 具有肺泡型 I 类特征, 包括功能性紧结¹⁶。

在准备我们的体外调查的设计 (例如,在空气-液体界面与暴露于 "吸入" 七氟醚或异氟醚的肺泡上皮细胞的文化, 我们理解从以前发表的研究,七氟醚的馏分仅在 "空气" 界面^17、18、19使用标准监测器 (类似于临床设置中使用的) 进行评估。卤化剂浓度通常根据最低肺泡浓度 (MAC) 值 (例如,在人类中, 对于七氟醚, 0.5, 1.1 和 2.2 vol%, 分别代表0.25、0.5 和 1 MAC) 进行选择; 对于异氟醚、0.6、0.8 和1.3 vol% 分别代表0.25、0.5 和 1 MAC)²⁰。事实上, 七氟醚和异氟醚浓度从未在培养基本身中进行过研究, 因此限制了以往实验模型/仪器的有效性。此外, 大多数实验都使用了在含有七氟醚的空气混合物被冲洗进去后密封的厌氧罐。由于我们的目标是研究肺泡上皮细胞在 "生理" 条件下, 我们认为这种厌氧状态可能不是最佳的, 不会与长期的实验时间相容。因此, 我们开发了自己的系统, 在空气-液体界面培养细胞, 并将它们暴露给卤代剂 (七氟醚和异氟醚), 目的是为这些制剂提供精确控制的 "空气" 组分和 "培养基" 浓度。在我们看来, 这一实验步骤, 这是尚未报告迄今在文献中, 是强制性之前, 任何进一步的体外调查七氟醚和异氟醚。

研究方案

1. 肺泡上皮细胞培养 (hAELVi)

1. 解冻
   1. 移液器4毫升的培养现成使用的人肺泡上皮 (huAEC) 培养基在一个15毫升塑料管和快速解冻的小瓶在预热水浴 (37 摄氏度)。
   2. 将解冻后的细胞悬浮液转移到含有4毫升培养基的15毫升塑料管上, 然后离心管在 200 x g 处进行5分钟。
   3. 吸出上清液, 用5毫升培养培养基重悬细胞颗粒。然后, 将细胞转移到 T25 烧瓶中。
   4. 在标准条件下培养细胞 (5% CO₂, 95% 加湿空气, 37 摄氏度)
2. 分裂
   1. 在显微镜下检查细胞的状态。当细胞是80-90% 汇合, 分裂细胞, 按照步骤1.2.2 通过1.2.10。
   2. 用无菌移液器吸出细胞的培养培养基。
   3. 用4毫升的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 洗涤细胞一次, 吸 DPBS。
   4. 在孵育37摄氏度之前, 将1毫升胰蛋白酶/EDTA 溶液 (TE) 添加到细胞中, 直到细胞开始分离;检查在显微镜下的支队。
   5. 用2毫升培养基重悬细胞, 在 200 x g 离心细胞5分钟。然后, 吸出上清液, 再用3毫升培养培养基重悬细胞颗粒。
   6. 使用台盼蓝染料排除法测定细胞的活性。采取30µl 的细胞悬浮液, 并增加30µl 的0.4% 溶液的台盼蓝在管。之后, 使用100µl 移液器有效地混合溶液3-5 次。取10µl 溶液, 放在血细胞计数器的盖玻片下。
   7. 计算血细胞计数器区域中可行细胞的总数和死细胞 (蓝色) 的数量。然后, 使用等式计算细胞活力 [%]: 细胞活力 = 100-(100/细胞总数 x 死细胞数)
   8. 将等分与重悬细胞颗粒转移到一个新的细胞培养 T25 烧瓶或6孔板。将培养培养基添加到细胞中, 在 T25 烧瓶中共达到5毫升培养培养基, 或在6孔板的每孔中加入1毫升。
   9. 在标准条件下培养孵化器中的细胞 (5% CO₂, 95% 加湿空气, 37 摄氏度)
   10. 一旦细胞完全汇合, 他们就可以进行实验了。

2. 气密室的制备

注: 气密室的施工计划如图 1所示.

1. 使用容量为 6.5 L 的密封聚丙烯盒。长度、宽度和高度分别为 30 x 20 x 15.5 厘米。请注意, 由于圆角, 盒的体积低于理论体积。
2. 在侧壁的底部钻一个直径为2.5 厘米的孔。
3. 插入一个带有绿色标记的波纹管, 它将作为气体-空气混合物输入管道, 并用硅密封。
4. 在对面侧壁的顶部钻孔第二个2.5 厘米直径的孔。
5. 插入另一个带有红色标记的波纹管, 并将其与木炭过滤器连接起来, 它将作为气体-空气混合物输出管道, 并用硅密封。
6. 在盒子的平均壁的中心钻一个紧的4毫米直径的孔。
7. 插入连接在一个歧管与旋转的男性鲁尔锁的短输液管, 将插入气体分析仪, 并与硅密封。
8. 将数字温度计/湿度计放在气密室内。

3. 将肺泡上皮细胞暴露于卤代剂 (七氟醚和异氟醚)

注:图 2描述了器件的原理图.

注意: 虽然动物研究没有发现胎儿伤害或生育能力受损的证据, 而且剖宫产期间的一项非常小的研究没有显示对母亲或胎儿的任何不良影响, 使用卤代剂的安全性 (例如,在分娩和分娩期间, 七氟醚或异氟醚) 迄今尚未证明。此外, 在人类怀孕期间没有收集到控制的数据。因此, 应强烈劝阻在怀孕期间使用七氟醚或异氟醚进行实验。

1. 在实验室的抽油烟机下工作。
2. 自定义麻醉机电路, 通过二氧化碳 (CO₂) 切换氧化亚氮的气体管路。
3. 将带绿色标记波纹管的气密室插入定制的麻醉机电路中。将加热的加湿器 (如在 ICU 通风机上使用的) 插入麻醉设备和气密室之间的管道, 将气体流量混合物加热至约37摄氏度。
4. 将气密室安装在热板上, 提供37°c 的加热板温度。
5. 将含有 hAELVI 细胞的6孔板放入气密室, 并密封盖子。
6. 调节气体流速 (即空气和 CO₂的混合物) 以快速获得标准条件, 定义为 5% CO₂和95% 的加湿空气。
7. 打开卤代剂蒸发器并选择所需百分比 (在本研究中, 七氟醚和异氟醚的测试浓度分别为4% 和 1%)。
8. 请注意气体混合物的组成和七氟醚或异氟醚浓度, 由外部气体分析仪测量并显示在屏幕上。
9. 一旦达到目标值, 将新鲜气体流量降低到1升/分钟。
10. 气密室可以保持与这种气体流量, 只要有必要为实验。

4. 用色谱法测量七氟醚或异氟醚

1. 样品制备
   1. 在不同的时间点, 非常简单地打开腔室取出所研究的样品 (在本研究中, 我们使用了6孔板) 并关闭盖子。把其他样品留在盒子里。然后, 用多卷可调微量吸管在每个样品中吸出1毫升的培养基。
   2. 将培养基放入10毫升顶空色谱小瓶, 这应该拧紧与聚四氟乙烯密封帽。如果不立即使用, 请将色谱瓶冷冻-20 摄氏度。
   3. 在甲醇中制备七氟醚的股票溶液和异氟醚的另一股溶液, 均为50克/升。同时, 在甲醇中准备2克/升的氯仿 (内部标准) 的库存溶液。将所有标准解决方案存储在-20 摄氏度。
   4. 在超纯水/二甲基 sulfoxyde (50/50; v/v) 中, 准备50、500和5000毫克/升的七氟醚和异氟醚的工作溶液。对于内部标准化, 工作溶液在甲醇中固定为100毫克/升。
2. 细胞样本分析
   注: 提取过程是基于以前验证的方法, 从布尔多等气相色谱和质谱。¹ 、使用相同的灵敏度和特异性参数。本协议采用七氟醚和氯仿 (is), 异氟醚与多参数分析法相关联。简要地介绍了在纯溶液注入后的质谱采集方法。然后, 用参考标准和文献资料确认了 m/z。为每个分析物 (除 is) 选择了三米/z: 一个 m/z 用于量化 (最丰富和更高), 通过将曲线下的区域集成到量化中来计算丰度, 两个 m/z 进行确认。使用三米/z, 可以特别确定分析物, 因为所有的 m/z 都有相同的保留时间, 以及所有的 m/z 量 (离子确认与定量的相对) 在纯标准和所有样品中都是相同的。通过这种采集模式, 可以识别和量化具有良好特异性的分析物。
   1. 构造校准8点曲线, 其浓度范围为 0.5-400 毫克/升和多个质量控制 (0.5、1、5、10、20、75、200和400毫克/升)。
      注: 要验证每个校准, 使用了四质量控制: 量化的下限 (C1 = 0.5 毫克/升), 两个中间水平 (C2 = 20 毫克/升和 C3 = 75 毫克/升) 和最终水平 (C4 在400毫克/升; 上一级的定量)。在培养细胞基质中对所有标准和控制进行了分析, 以避免基质效应。对于每个校准曲线, 对空白矩阵进行了分析, 以验证没有对培养的细胞和内部标准的干扰。
   2. 在甲醇中制备七氟醚的股票溶液和异氟醚的另一股溶液, 均为50克/升。同时, 在甲醇中准备2克/升的氯仿 (内部标准) 的库存溶液。将所有标准解决方案存储在-20 摄氏度。然后, 在超纯水/二甲基 sulfoxyde (50/50; v/v) 中, 准备混合七氟醚/异氟烷50、500和5000毫克/升的工作溶液。在甲醇中, 工作溶液稀释为100毫克/升。
   3. 对于校准曲线和控制, 准备样品的峰值50µL 的是 (100 毫克/升) 成1毫升的细胞样本矩阵。
   4. 用200µL 饱和氯化钠水溶液制备样品溶液, 在10毫升顶部管, 拧紧与聚四氟乙烯密封帽。
3. 气相色谱与质谱法
   1. 对于样品分析, 在气相色谱中使用顶空注射, 再加上质量检测方法。
   2. 用加热器摇床在80摄氏度下搬运顶空管10分钟。然后, 取出并将1.5 毫升的气体样品注入气相色谱仪中。将喷油器的参数设置为260摄氏度, 在色谱运行开始时以100毫升/分钟为2分钟的分流流。
   3. 使用带有载波模式-编程压力的拆分/不分流喷油器。首先, 将气体压力保持在40帕0.15 分钟。然后, 将速率程序压力提高到 150 kpa 在125帕/分钟之前设置16帕/分钟到300帕的压力5分钟。
   4. 同时注入, 从60摄氏度的烘箱温度开始1分钟, 并增加到140摄氏度的温度达到20摄氏度/分钟。然后, 再次增加温度, 直到达到250摄氏度。运行的总时间为7分钟。
   5. 使用熔融二氧化硅毛细管柱 (30 m x 1.4 µm, 0.25 mm ID) 进行色谱分离。通过单离子监测 (SIM) 条件进行质量实验, 并在七氟醚、米/z 149 (离子定量)、米/z 和 115 (离子)、m/87 和51的保留时间 (RT) 中同时监测离子定量的 m/z 181 和离子条件的 m/z 151 和2.30资格) 为异氟醚在 rt 2.8 分钟, 和 m/z 83 (离子定量) 氯仿在 rt 3.70 分钟。
   6. 用重量二次拟合测定细胞培养中七氟醚和异氟醚的浓度。七氟醚和异氟醚的定量 (LLOQ) 下限为0.5 毫克/升, 定量 (ULOQ) 的上限为400毫克/升。

结果

表 1和表 2分别报告了七氟醚和异氟醚在介质中随时间溶解的浓度。

在培养基中, 七氟醚和异氟醚浓度的变化与时间相似。在所需的卤代剂浓度设定后, 在第一个小时内浓度上升。然后到达一个高原, 一直持续到卤化剂的管理停止。在管理中断后, 浓度在一小时内减少 (图 3)。

讨论

我们的协议描述了一种简单的方法, 将细胞暴露在卤代麻醉剂的精确部分, 如七氟醚或异氟醚。此外, 我们在这里首次报告-在培养基本身中, 气体馏分与七氟醚和异氟醚浓度之间存在严格的相关性。这一基本步骤现在允许我们安全地使用我们的气密室来研究这些卤代剂在培养的人肺泡上皮细胞中的作用。

目前, 研究七氟醚在肺泡细胞中的作用的大多数科研小组使用的是先用卤化...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sevoflurane	Baxter		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane	Virbac		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells	InScreenex	INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use)	InScreenex	INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit	Drager	Fabius
Gas analyzer	Drageer	Vamos Plus
Anesthetic gas filter	SedanaMedical	FlurAbsord
Heated Humifier	Fisher&Paykel	MR850
Chamber	Curver	00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection	Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA	Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID)	Restek, Lisses, France	Rxi-624Sil MS