В пробирке Метод для контроля концентрации галогенированные газов в культивированный альвеолярных клеток эпителия

Резюме

Мы опишем простой протокол, специально разработан для достижения точный и контролируемый концентраций севофлурана или изофлюрановая в пробирке для того, чтобы улучшить наше понимание механизмов, участвующих в повреждения эпителия легких и проверить Роман лечение острого респираторного дистресс-синдрома.

Аннотация

Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) является синдром диффузного альвеолярного повреждения с нарушением альвеолярной жидкости Специальные акции и тяжелые воспаления. Использование галогенизированных агентов, таких как севофлюран или изофлюрановая, для седации в отделении интенсивной терапии (ОРИТ) больных может улучшить обмен газа, снизить альвеолярный отек и ослабить воспаление при ОРДС. Однако отсутствуют данные об использовании ингаляционных агентов для непрерывного седации в отделении интенсивной терапии для лечения или предотвращения повреждения легких. Для изучения воздействия галогенированные агентов на альвеолярные клетки эпителия «физиологические» условиях, мы опишем простой системы в культуре клеток в интерфейсе воздуха жидкость и подвергать их галогенированные агентов, чтобы обеспечить точный контролируемым «воздух» фракций и «Средний» концентрации для этих агентов. Мы разработали запечатанных герметичный палаты, в котором пластины с человека альвеолярных клеток эпителия увековечен могут подвергаться, точные, контролируемых часть севофлюран или изофлюрановая, с помощью непрерывного газа, предоставляемый обезболивающий машина цепи. Клетки были подвержены 4% севофлюран и 1% изофлюрановая за 24 часа. Газовых масс-спектрометрии была проведена для определения концентрации галогенированные агентов, растворенные в среде. После первого часа, концентраций севофлурана и изофлюрановая в среде были 251 мг/Л и 25 мг/Л, соответственно. Кривые, представляющие концентраций севофлурана и изофлюрановая растворенные в среде, показали аналогичные курсы со временем, с плато, на один час после воздействия.

Этот протокол был специально разработан для достижения точный и контролируемый концентраций севофлурана или изофлюрановая в пробирке для улучшения нашего понимания механизмов, участвующих в повреждения эпителия легких при ОРДС и тестирования Роман терапии для синдром.

Введение

Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС)-это клинический синдром, характеризующийся диффузного альвеолярного повреждения, отек легких и гипоксемии дыхательной недостаточности. Хотя ОРДС представляет более чем на 10% госпитализации в отделение интенсивной терапии (ОРИТ) и почти 25% пациентов ОРИТ, требующим искусственной вентиляции легких, это по-прежнему под признанных вызов для клиницистов, с больницы смертности 35-45%¹. Несмотря на интенсивные исследования определение эффективной ОРДС фармакологической терапии или предупреждения не дату. Две основные особенности способствуют смертности в ОРДС: Распродажа альвеолярной жидкости (АФК) (т.е., изменены резорбции жидкости альвеолярный отек от дистальной легких НТУС) и тяжелые воспаления². Так как ОРДС смертности остается высоким, текущие инициативы должны также включать первичной профилактики; Однако ключевой проблемой является для выявления риска пациентов в которых ОРДС может развиваться и кто выиграет, если ОРДС были предотвращены.

Летучие галогенированных анестетиков, например севофлюран и изофлюрановая, широко используются для обеспечения общей анестезии в операционной комнате. По всему миру более чем 230 миллионов пациентов, подвергающихся серьезной операции каждый год требует общей анестезии и искусственной вентиляции легких³, и послеоперационных легочных осложнений негативно сказаться на клинические исходы и медицинского использования⁴ . Использование севофлюран вместо пропофол был связан с более легких воспаления у пациентов, перенесших торакальной хирургии и значительное сокращение неблагоприятных событий, таких как ОРДС и послеоперационных легочных осложнений⁵. Аналогичным образом Предварительная обработка с изофлюрановая имел защитные эффекты на респираторные механики, оксигенации и гемодинамики в экспериментальных моделях на животных ОРДС^6,7. Хотя дальнейшие исследования необходимы для устранения последствий ингаляционных агентов на исходы в noncardiac хирургии, аналогичные снижение легочных осложнений недавно наблюдается в мета анализ, демонстрируя, что вдыхают анестетиков — как против внутривенный наркоз — значительно связаны со снижением смертности для кардиохирургии⁸.

Отсутствуют конкретные перспективных данные об использовании летучих агентов для успокоения СИС пациентов для профилактики или лечения повреждения легких. Однако несколько испытаний теперь поддерживают эффективность и безопасность ингаляции севофлурана для успокоения пациентов ОРИТ и доклинические исследования показали, что ингаляции севофлурана и изофлюрановая^7,9 улучшить обмен газа, снизить альвеолярный отек и ослабление воспаления в экспериментальных моделях ОРДС. Кроме того севофлюран смягчает типа II эпителиальных клеток повреждения¹⁰, тогда как изофлюрановая поддерживает целостность альвеолярного капиллярная барьера путем модуляции туго Джанкшен белка¹¹. Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы проверить, в какой степени экспериментальные доказательства орган защиты от ингаляции севофлурана и изофлюрановая могут быть переведены на людей. Первый сингл центр контролируемых рандомизированного исследования (РКИ) из нашей группы было установлено, что раннее использование ингаляции севофлурана у больных с ОРДС связан с улучшения оксигенации, снижение уровня некоторых провоспалительных маркеров и сокращение легких эпителия повреждение, как оценивать уровень растворимой формы рецептора для Расширенный гликирования конечных продуктов (sRAGE) в плазме и альвеолярного жидкости¹².

Взятые вместе, благотворное влияние севофлюран и изофлюрановая на повреждения легких может указывать на несколько биологические пути или функциональных процессов, которые зависят от ЯРОСТИ путь, а именно альвеолярной жидкости Распродажа (АФК), эпителиальные травмы, транслокации ядерного фактора (NF)-κB и активация макрофагов. Кроме того севофлюран могут влиять выражения протеина RAGE, сам. Так как предыдущие исследования, Наша исследовательская группа и другие поддерживает ключевую роль для RAGE в альвеолярной воспаления и легких эпителиальных травмы/ремонт при ОРДС, мы разработали экспериментальную модель для трансляционного понимания механизмов севофлюран в легких травмы ремонт^13,,14и¹⁵. Эффекты в vitro севофлюран и изофлюрановая были исследованы в строке Роман альвеолярного эпителия первичной клетки человека, специально предназначенных для изучения барьер крови воздух периферийных легких, hAELVi (человеческий альвеолярного эпителия человека увековечен), с характеристиками-как альвеолярного типа, включая функциональные плотные соединения¹⁶.

При подготовке дизайн нашего в vitro исследования (например, культур альвеолярных клеток эпителия на интерфейсе воздуха жидкость с воздействием «ингаляционных» севофлюран или изофлюрановая, мы поняли из ранее опубликованных исследований, фракций севофлюран только были оценены в «воздух» интерфейс^17,18,19 с использованием стандартных мониторов (похожие на те, которые используются в клинических условиях). Галогенированные агент концентрации обычно были выбраны согласно минимальной альвеолярной концентрации (MAC) значения (например, людей, для севофлуран, 0.5, 1.1 и 2.2 vol %, представляющий 0,25, 0,5 и 1 MAC, соответственно; для изофлюрановая, 0.6, 0.8, и 1.3 vol % представляющих 0,25, 0,5 и 1 MAC, соответственно)²⁰. Действительно севофлюран и изофлюрановая концентрации никогда не были расследованы в культурной среде, сам, таким образом ограничивая действия предыдущих экспериментальных моделей/инструментов. Кроме того большинство экспериментов используются анаэробные банку, которая была решена после того, как содержащий севофлюран смесь воздуха сброшен внутри. Поскольку нашей целью было учиться альвеолярных клеток эпителия «физиологические» условиях, мы считали, что такое анаэробного государство может не быть оптимальной и не будут совместимы с давно экспериментальной длительности. Таким образом мы разработали собственную систему в культуре клеток в интерфейсе воздуха жидкость и подвергать их галогенированные агентов (севофлюран и изофлюрановая) с целью предоставления точных контролируемых фракций «воздуха» и «средний» концентрации для этих агентов. По нашему мнению этот экспериментальный шаг, который не сообщается до настоящего времени в литературе, является обязательным до любые дальнейшие в vitro исследования севофлюран и изофлюрановая.

протокол

1. Культура альвеолярного эпителиальных клеток (hAELVi)

1. Оттаивания
   1. Пипетка 4 мл среды выращивания готовых к использованию человеческого альвеолярного эпителия (huAEC) в 15 мл пластиковую трубку и быстро разморозить флакона в разогретой водяной бане (37 ° C).
   2. Суспензию клеток талой передать 15 мл пластиковая трубка, содержащая 4 мл среды перед центрифугирования трубки на 200 x g за 5 мин.
   3. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки лепешка с 5 мл среды культивирования. Затем перенесите клетки для T25 колбу.
   4. Культивировать клетки в стандартных условиях (5% CO₂, 95% увлажненный воздух, 37 ° C)
2. Разделение
   1. Микроскопически Проверьте состояние клеток. Когда клетки 80-90% притока, разбить ячейки, следующие шаги 1.2.2 через 1.2.10.
   2. Аспирационная СМИ культивирования клеток с стерильной пипеткой.
   3. Вымыть клетки один раз с 4 мл из Дульбекко фосфат буфер солевой (DPBS) и аспирационная DPBS.
   4. Добавить 1 мл раствора (TE) трипсина/ЭДТА в клетки до инкубации при 37 ° C 3 мин до тех пор, пока клетки начинают отсоединить; Проверка на отряд под микроскопом.
   5. Ресуспензируйте клетки с 2 мл питательной среды и центрифуги клетки на 200 x g за 5 мин. Затем аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки Пелле снова с 3 мл среды культивирования.
   6. Используйте исключения пробирного Трипановый синий краситель для определения жизнеспособности клеток. Возьмите 30 мкл суспензии клеток и 30 мкл 0,4% раствора Трипановый синий в трубку. После этого эффективно Смешайте раствор 3 - 5 раз с помощью пипетки 100 мкл. Возьмите 10 мкл раствора и положил его под coverslip Горяева.
   7. Подсчитайте общее количество жизнеспособных клеток и количество мертвых клеток (синий) в области Горяева. Затем рассчитайте по формуле жизнеспособность клеток [%]: Сотовые жизнеспособность = 100 – (100 / общее количество клеток x количество мертвых клеток)
   8. Передать Алиготе с Пелле ресуспензированы ячейки новой культуры клеток T25 колбу или 6 хорошо плиты. Добавьте средство культивирования клеток для достижения в общей сложности 5 мл среды культивирования в колбу Т25, или 1 мл раствора для каждой скважины 6 пластины хорошо.
   9. Культивировать клетки в инкубаторе в стандартных условиях (5% CO₂, 95% увлажненный воздух, 37 ° C)
   10. После того, как клетки полностью вырожденная, они готовы для эксперимента.

2. Подготовка герметичная Камера

Примечание: План строительства герметичная Камера изображен на рисунке 1.

1. Использовать поле герметичные полипропиленовые мощностью 6,5 л Длина, ширина и высота, 30 x 20 x 15,5 см, соответственно. Пожалуйста, обратите внимание, что объем коробки ниже, чем теоретический объем из-за закругленными углами.
2. Просверлите отверстие диаметром 2,5 см на нижней стороне боковой стены.
3. Вставьте гофрированная труба с зеленым знаком, который будет служить газовоздушной смеси ввода труб и запечатать его с кремнием.
4. Сверлить второе отверстие диаметром 2,5 см на верхней стороне противоположной боковой стены.
5. Вставьте другой гофрированная труба с красным знаком и подключить его с угольный фильтр, который будет служить в качестве газовоздушной смеси вывода трубы и запечатать его с кремнием.
6. Просверлите отверстие диаметром плотный 4 мм в центре средней стенке коробки.
7. Вставьте короткий настой труб, что связано в коллектор с вращающейся мужской luer-lock, который будет подключен анализатор газов и запечатать его с кремнием.
8. Место цифровой термометр/гигрометр внутри герметичных камеры.

3. предоставлять альвеолярных клеток эпителия галогенированные агентам (севофлюран и изофлюрановая)

Примечание: Схема, чертеж устройства изображен на рисунке 2.

Предостережение: Хотя исследования на животных показали никаких признаков эмбриональный вред или нарушением плодородия, и очень небольшое исследование во время кесарева сечения не показывают каких-либо неприятных эффектов на матери или плода, безопасность использования галогенированных агентов (например, севофлюран или изофлюрановая) на сегодняшний день не было продемонстрировано во время родов. Кроме того не контролируемые данные были собраны во время беременности человека. Таким образом проведение экспериментов с использованием севофлюран или изофлюрановая во время беременности следует решительно отвергать.

1. Работа в лаборатории вытяжка.
2. Настройка цепи обезболивающий машина для переключения линии газ закиси азота, двуокиси углерода (CO₂).
3. Подключите заказной обезболивающий машина цепи герметичная камера с отмеченные зеленым, гофрированные трубки. Вставьте трубу между анестезии машиной и герметичная Камера теплой смеси потока газа приблизительно 37 ° C подогревом увлажнитель воздуха (например, те, которые используются на СИС вентиляторов)
4. Установите герметичная Камера на горячей плите, обеспечивая Отопление пластины температуре 37° C.
5. Положите 6 хорошо плита содержащие клетки hAELVI в герметичных камеры и уплотнение крышки.
6. Регулирование скорости потока газа (т.е. смесь воздуха и CO₂) быстро получить стандартные условия, определяется как 5% CO₂ и 95% увлажненный воздух.
7. Откройте испарителя галогенированные агент и выберите желаемый процент (в настоящем исследовании, протестированных концентраций севофлурана и изофлюрановая были 4% и 1%, соответственно).
8. Обратите внимание на состав смеси и севофлюран или изофлюрановая концентрации газа измеряется внешней газоанализатор и отображаются на экране.
9. После того, как будут достигнуты целевые показатели, уменьшите расход свежего газа до 1 Л/мин.
10. Герметичная Камера может поддерживаться с этой скорости потока газа столько, сколько необходимо для эксперимента.

4. Измерьте севофлюран или изофлюрановая хромотографией

1. Подготовка образцов
   1. В разное время точках, очень кратко открыть камеру взять из исследуемых образцов (в настоящем исследовании, мы использовали 6 скважин плита) и закройте крышку. Держите и другие примеры в поле. Затем аспирационная 1 мл среды, содержащихся в каждой пробе с многотомной регулируемые микропипеткой.
   2. Поместите носитель в 10 мл headspace хроматографии флаконов, которые должны быть закручены плотно герметично с тефлоновой герметичный колпачок. Заморозить хроматографии флаконов при-20 ° C, если вы не используете их немедленно.
   3. Подготовьте Стоковый раствор севофлюран и другой Стоковый раствор изофлюрановая, как на 50 г/Л в метаноле. Одновременно Подготовьте Стоковый раствор хлороформ (внутренний стандарт, IS) на 2 g/L в метаноле. Хранить все стандартные решения, при-20 ° C.
   4. Подготовить рабочие решения севофлюран и изофлюрановая на 50, 500 и 5000 мг/Л в ультрачистая вода/диметил sulfoxyde (представленности; v/v). Для внутренней стандартизации рабочий раствор фиксируется на 100 мг/Л в метаноле.
2. Анализ клеточных образцов
   Примечание: Процедура извлечения основывается на ранее одобренного метода газовой хроматографии и масс-спектрометрии из бордовых и др. ¹ и использует те же параметры чувствительности и специфичности. Севофлюран и хлороформе (IS) были использованы в настоящем Протоколе, и изофлюрановая был связан с многопараметрических аналитического метода. Кратко для приобретения масс-спектрометрии, метод был разработан после чистый раствор для инъекций. Затем m/z было подтверждено с эталонным стандартам и литературные данные. Для каждого исследуемое вещество (за исключением IS) были отобраны три m/z: один m/z для количественной оценки (наиболее распространённый и выше), для которого изобилие была рассчитана путем интеграции площадь под кривой для количественной оценки и две m/z для подтверждения. С помощью трех m/z, аналитов могут быть конкретно определены потому что все m/z имел то же время удержания, а также потому, что все суммы m/z (родственник Ион подтверждение против квантификация) были такими же, в стандарте чистой и во всех образцах. В этом режиме приобретения аналитов может определить и количественно с хорошей точностью.
   1. Построить калибровочных кривых 8-точка с диапазоны концентраций 0,5-400 мг/Л и несколько качества контроль (0,5, 1, 5, 10, 20, 75, 200 и 400 мг/Л).
      Примечание: Для проверки каждой калибровки, были использованы четыре контроль качества: нижний предел количественного определения (C1 = 0,5 мг/Л), два промежуточных уровней (C2 = 20 мг/Л и C3 = 75 мг/Л) и последний уровень (C4 на 400 мг/Л; верхний уровень количественной оценки). Все стандарты и меры контроля были проанализированы в культивируемых клеток матрицы, чтобы избежать эффекта матрицы. Для каждого калибровочной кривой Пустая матрица была проанализирована для проверки, что не существует никакого вмешательства с искусственного сотовой и внутренними стандартами.
   2. Подготовьте Стоковый раствор севофлюран и другой Стоковый раствор изофлюрановая, как на 50 г/Л в метаноле. Одновременно Подготовьте Стоковый раствор хлороформ (внутренний стандарт, IS) на 2 g/L в метаноле. Хранить все стандартные решения, при-20 ° C. Затем, подготовить рабочие решения смешанных севофлюран/изофлюрановая на 50, 500 и 5000 мг/Л в ультрачистая вода / диметил sulfoxyde (представленности; v/v). Для IS рабочий раствор разбавляют в 100 мг/Л в метаноле.
   3. Для калибровочных кривых и элементов управления для подготовки образцов пики 50 мкл IS (100 мг/Л) в 1 мл клеточных образцов матриц.
   4. Подготовка образца решения с 200 мкл насыщенных натрия хлорид водный раствор в 10 мл headspace трубку, герметически туго болтами с тефлоновой герметичный колпачок.
3. Газовой хроматографии и масс-спектрометрии
   1. Для анализа образцов используйте headspace инъекции в газовой хроматографии, в сочетании с методом массового обнаружения.
   2. Нести headspace трубы для 10 мин при 80 ° C с шейкере нагреватель. Затем снять и вставляют 1,5 мл пробы газа газового хроматографа. Установите значение параметра инжектора на 260 ° C с поток раскол в 100 мл/мин на 2 мин в начале выполнения хроматографии.
   3. Используйте Сплит/splitless инжектор с давлением запрограммированы режим перевозчика. Во-первых Держите давление газа на 40 кПа для 0,15 мин. Затем увеличьте скорость программы давление до 150 кПа в 125 кПа/мин перед установкой размере 16 кПа/мин 300 кПа давление на 5 мин.
   4. Одновременно в месте инъекции, начните с печи температура 60 ° c за 1 мин и увеличения до 140 ° c температуры со скоростью до 20 ° C/мин. Затем увеличьте температуру снова, вплоть до 250 ° С. Общее время выполнения – 7 мин.
   5. Осуществляют разделение хроматографии с использованием капиллярной колонки плавленый кремнезема (30 м х 1,4 мкм, ID 0,25 мм). Выполнение массового эксперименты с одного иона, мониторинга состояния (SIM) и контролировать Ион количественная оценка m/z 181 и Ион квалификации m/z 151 и 51 одновременно во время хранения (RT) 2.30 минут для севофлуран, m/z 149 (Ион квантификацией), m/z, 115 и 87 (Ион квалификации) для изофлюрановая на RT 2.8 мин и m/z 83 (Ион квантификацией) для метилхлороформа в RT 3,70 мин.
   6. Определения концентраций севофлурана и изофлюрановая в клеточной культуре их области коэффициенты, ИС, используя вес квадратичных fit. Нижний предел количественного определения (LLOQ) для севофлюран и изофлюрановая 0,5 мг/Л и верхний предел квантификации (УЛОК) был 400 мг/л.

Результаты

Концентраций севофлурана и изофлюрановая, который растворяется в среде с течением времени, приводятся в таблице 1 и таблице 2, соответственно.

Курсы концентраций севофлурана и изофлюрановая в среднесрочном были похо?...

Обсуждение

Наш протокол описывает метод легко подвергать клетки для точного часть галогенированных анестетиков агента, севофлюран или изофлюрановая. Кроме того, мы приводим здесь — в первый раз — строгой корреляции между газовой фракции и концентрация севофлюран и изофлюрановая внутри самой с?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sevoflurane	Baxter		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane	Virbac		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells	InScreenex	INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use)	InScreenex	INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit	Drager	Fabius
Gas analyzer	Drageer	Vamos Plus
Anesthetic gas filter	SedanaMedical	FlurAbsord
Heated Humifier	Fisher&Paykel	MR850
Chamber	Curver	00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection	Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA	Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID)	Restek, Lisses, France	Rxi-624Sil MS