In Vitro Método de controle de concentrações de Gases halogenados em culturas de células epiteliais alveolares

Resumo

Descreveremos um protocolo fácil projetado especificamente para atingir concentrações precisas e controladas de sevoflurano ou isoflurano em vitro a fim de melhorar a nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na lesão pulmonar epitelial e para testar o romance terapias para a síndrome respiratória aguda.

Resumo

Síndrome da angústia respiratória (Sara) é uma síndrome de lesão alveolar difusa com afastamento fluido alveolar deficiente e inflamação grave. O uso de agentes halogenados, tais como o sevoflurano ou isoflurano, para a sedação de pacientes de unidade de terapia intensiva (UTI) pode melhorar a troca gasosa, reduzir o edema alveolar e atenuar a inflamação durante a SDRA. No entanto, dados sobre o uso de agentes inalatórios para sedação contínua na UTI para tratar ou prevenir danos nos pulmões é carente. Para estudar os efeitos dos agentes halogenados em pilhas epithelial alveolares em condições "fisiológicas", descrevemos um sistema fácil para células de cultura na interface ar-líquido e expô-las a agentes halogenados para fornecer fracções de precisão controlada "ar" e concentrações de "médio" para esses agentes. Desenvolvemos uma câmara hermética selada em que placas com células humanas de imortalizado epiteliais alveolares podem ser expostas a uma fração precisa, controlada de sevoflurano ou isoflurano usando um fluxo de gás contínua fornecido por um circuito de máquina anestésica. As células foram expostas a 4% de sevoflurano e 1% de isoflurano durante 24 horas. Espectrometria de massa de gás foi realizada para determinar a concentração de agentes halogenados dissolvido no meio. Após a primeira hora, as concentrações de sevoflurano e isoflurano no meio foram 251 mg/L e 25 mg/L, respectivamente. As curvas que representam as concentrações de sevoflurano e isoflurano dissolvido no meio mostrou cursos semelhantes ao longo do tempo, com um patamar alcançado em uma hora após a exposição.

Este protocolo foi projetado especificamente para atingir concentrações precisas e controladas de sevoflurano ou isoflurano em vitro para melhorar a nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na lesão pulmonar epitelial durante a SDRA e testar novas terapias para o Síndrome.

Introdução

Síndrome da angústia respiratória (Sara) é uma síndrome clínica caracterizada por lesão alveolar difusa, edema pulmonar e insuficiência respiratória hypoxemic. Embora a SDRA representa mais de 10% das admissões de unidade de terapia intensiva (UTI) e quase 25% dos pacientes de UTI que requerem ventilação mecânica, é ainda um desafio sob-reconhecido para os clínicos, com uma taxa de mortalidade do hospital de 35-45%¹. Apesar de intensas pesquisas, a identificação de uma terapia farmacológica eficaz de SDRA ou prevenção falhou até à data. Dois principais recursos contribuem para a mortalidade na SDRA: prejudicada afastamento fluido alveolar (AFC) (ou seja, a reabsorção alterada do fluido de edema alveolar de espaços aéreos do pulmão distal) e inflamação grave². Desde que a mortalidade de SDRA permanece elevada, iniciativas em curso também devem incluir a prevenção primária; no entanto, é um desafio-chave para identificar pacientes em risco, em que Sara é provável desenvolver e quem se beneficiaria se SDRA foram impedidas.

Anestésicos halogenados voláteis, tais como o sevoflurano e isoflurano, são amplamente utilizados para fornecer anestesia geral na sala de cirurgia. Em todo o mundo, mais de 230 milhões pacientes submetidos à cirurgia de grande porte cada ano exigem anestesia geral e ventilação mecânica³, e complicações pulmonares pós-operatórias afetam adversamente os resultados clínicos e saúde utilização⁴ . O uso do sevoflurano em vez de propofol foi associado com inflamação pulmonar melhorou em pacientes submetidos à cirurgia torácica e diminuições significativas em eventos adversos, tais como a SDRA e complicações pulmonares pós-operatórias⁵. Da mesma forma, o pré-tratamento com isoflurano tinha efeitos protectores na mecânica respiratória, oxigenação e hemodinâmica em modelos animais experimentais de SDRA^6,7. Embora mais estudos são garantidos para abordar o impacto de agentes inalatórios em resultados na cirurgia antiagregantes, uma diminuição semelhante de complicações pulmonares tem sido observada recentemente em uma meta-análise, demonstrando que inalou agentes anestésicos — como opôs-se à anestesia intravenosa — são significativamente associados com uma redução na mortalidade para cirurgia cardíaca⁸.

Está faltando dados prospectivos específicos sobre o uso de agentes voláteis para a sedação de pacientes de UTI para prevenir ou tratar a lesão pulmonar. No entanto, vários ensaios agora oferecem suporte a eficácia e segurança de sevoflurano inalado para a sedação de pacientes de UTI, e estudos pré-clínicos têm demonstrado que inalatórios sevoflurano e isoflurano^7,9 melhorar a troca gasosa, reduzir edema alveolar e atenua inflamação em modelos experimentais de SDRA. Além disso, sevoflurano atenua tipo II células epiteliais danos¹⁰, Considerando que o isoflurano mantém a integridade da barreira alveolar-capilar através da modulação da junção apertada proteína¹¹. No entanto, mais estudos são necessários para verificar em que medida as evidências experimentais de proteção de órgão de inalatórios sevoflurano e isoflurano poderiam ser traduzida como seres humanos. Um primeiro single-centro controlado-randomizado (ECR) do nosso grupo encontrou que o uso precoce de sevoflurano inalado em pacientes com SDRA foi associado com oxigenação melhorada, redução dos níveis de alguns marcadores pró-inflamatórios e reduzida pulmonar epitelial danificar, avaliada pelos níveis da forma solúvel do receptor para final-produtos de glicação avançada (sRAGE) no plasma e alveolar fluido¹².

Tomados em conjunto, os efeitos benéficos do sevoflurano e isoflurano na lesão pulmonar poderiam apontar para vários caminhos biológicos ou processos funcionais que dependem da via de raiva, ou seja, liberação de fluido alveolar (AFC), lesão epitelial, translocação do fator nuclear (NF)-κB e ativação de macrófagos. Além disso, sevoflurano pode influenciar a expressão da proteína raiva em si. Desde a pesquisa anterior, nossa equipe de pesquisa e outros suporta papéis pivotal para raiva na inflamação alveolar e pulmão, reparação de lesão epitelial durante a SDRA, projetamos um modelo experimental para fornecer uma compreensão translação dos mecanismos de sevoflurano em pulmão lesão e reparação^13,14,15. Os efeitos em vitro de sevoflurano e isoflurano foram investigados em uma linha de romance humano alveolar primária célula epitelial especificamente projetada para estudar a barreira sangue-ar do pulmão periférico, hAELVi (humana Alveolar LentiVirus epiteliais imortalizado), com tipo alveolar-como características incluindo junções apertadas funcional¹⁶.

Enquanto preparava o design de nossas investigações em vitro (por exemplo, culturas de células epiteliais alveolares na interface ar-líquido, com a exposição "inalado" sevoflurano ou isoflurano, entendemos anteriormente publicados estudos que frações de sevoflurano só foram avaliadas no "ar" interface^17,18,19 usando monitores padrão (semelhantes aos usados em um ambiente clínico). Agente halogenado concentrações geralmente foram escolhidas de acordo com os valores de concentração alveolar mínima (MAC) (por exemplo, em humanos, para sevoflurano, 0.5, 1.1 e 2.2 vol %, representando 0,25, 0,5 e 1 MAC, respectivamente; para isoflurano, 0.6, 0.8, e vol 1,3% representando 0,25, 0,5 e 1 MAC, respectivamente)²⁰. Com efeito, concentrações de sevoflurano e isoflurano nunca foram investigadas em meio de cultura em si, limitando assim a validade de modelos/instrumentos experimentais anteriores. Além disso, a maioria dos experimentos usado um frasco anaeróbio que foi selado depois o sevoflurano contendo mistura de ar tinha sido liberado dentro. Como nosso objetivo era estudar células epiteliais alveolares em condições "fisiológicas", acreditamos que tal um estado anaeróbico pode não ser ideal e não seria compatível com durações de tempo experimentais. Portanto, desenvolvemos nosso próprio sistema de células de cultura na interface ar-líquido e expô-las a agentes halogenados (sevoflurano e isoflurano) com o objectivo de proporcionar precisão controlada "ar" fracções e concentrações "médio" para esses agentes. Em nossa opinião, esta etapa experimental, que não foi relatada até agora na literatura, é obrigatória antes de qualquer em vitro investigações de sevoflurano e isoflurano.

Protocolo

1. cultura de células epiteliais alveolares (hAELVi)

1. Descongelamento
   1. Pipetar 4 mL de meio de cultivo prontos para uso humano alveolar epitelial (huAEC) em um tubo plástico de 15 mL e descongelar rapidamente o frasco num banho de água pré-aquecida (37 ° C).
   2. Transferi a suspensão de células descongeladas para um tubo de plástico de 15 mL contendo 4 mL de meio de antes da centrifugação do tubo a 200 x g por 5 min.
   3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com 5 mL de meio de cultivo. Em seguida, transferi as células para um balão de T25.
   4. Cultivar as células em condições padrão (5% de CO₂, 95% úmido ar, 37 ° C)
2. Divisão
   1. Verificar o status das células ao microscópio. Quando as células são 80-90% de confluencia, dividi as células, as seguintes etapas 1.2.2 através de 1.2.10.
   2. Aspire os meios de cultivo das células com uma pipeta estéril.
   3. Lavar as células uma vez com 4 mL de Dulbecco fosfato Buffered Saline (DPBS) e aspire o DPBS.
   4. Adicionar 1 mL de solução de tripsina/EDTA (TE) para as células antes da incubação a 37 ° C por 3 min, até que as células começam a se separar; Verifique se há desprendimento sob um microscópio.
   5. Ressuspender as células com 2 mL de meio de cultura e centrifugar as células a 200 x g por 5 min. Em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células novamente com 3 mL de meio de cultivo.
   6. Use o ensaio de exclusão do corante azul de Tripan para determinar a viabilidade das células. Pegue 30 µ l de suspensão de células e adicionar 30 µ l de uma solução 0,4% de trypan azul em um tubo. Depois disso, efetivamente misture a solução de 3 - 5 vezes utilizando uma pipeta de 100 µ l. Pegue 10 µ l da solução e colocá-lo sob a lamela do hemocytometer.
   7. Tanto o número total de células viáveis e contam o número de células mortas (azul) nas áreas do hemocytometer. Em seguida, calcular a viabilidade celular [%] usando a equação: viabilidade celular = 100 – (número 100 / total de células x número de células mortas)
   8. Transferi a alíquota com o centrifugado ressuspensão para um balão de T25 de cultura celular novo ou um 6-placa. Adicione o meio de cultivo para as células para alcançar um total de 5 mL de meio de cultivo no frasco T25, ou 1 mL para cada poço da placa bem-6.
   9. Cultivar as células em uma incubadora em condições padrão (5% de CO₂, 95% úmido ar, 37 ° C)
   10. Uma vez que as células estão completamente confluentes, eles estão prontos para o experimento.

2. preparação de uma câmara estanque

Nota: O plano de construção para a câmara hermética está representado na Figura 1.

1. Use uma caixa hermética de polipropileno com capacidade de 6,5 L. O comprimento, largura e altura são 30 x 20 x 15,5 cm, respectivamente. Por favor note, o volume da caixa é inferior ao volume teórico devido os cantos arredondados.
2. Faça um furo de diâmetro de 2,5 cm na parte inferior da parede lateral.
3. Inserir um tubo corrugado com uma marca verde, que servirá como o tubo de entrada de mistura gás-ar e selá-lo com silicone.
4. Faça um furo de diâmetro segundo 2,5 cm na parte superior da parede lateral oposta.
5. Inserir outro tubo corrugado com uma marca vermelha e conectá-lo com um filtro de carvão, que servirá como o tubo de saída de mistura gás-ar e selá-lo com silicone.
6. Faça um furo de diâmetro 4mm apertado no centro da parede média da caixa.
7. Inserir tubos de infusão curta que é conectado a um tubo colector com um rotação luer-lock macho, que será conectado em um analisador de gás e selá-lo com silicone.
8. Coloque um termômetro/higrômetro digital dentro da câmara estanque.

3. expor a células epiteliais alveolares para agentes halogenados (sevoflurano e isoflurano)

Nota: Um desenho esquemático do dispositivo é representado na Figura 2.

Atenção: Embora estudos em animais não revelaram nenhuma evidência de dano fetal ou perturbações da fertilidade, e um estudo muito pequeno durante cesarianas não mostrou qualquer efeito desfavorável sobre a mãe ou o feto, a segurança do uso de derivados halogenados agentes (por exemplo, sevoflurano ou isoflurano) durante o trabalho de parto não foi demonstrado até à data. Além disso, foram coletados dados não controlados durante a gravidez humana. Portanto, realizando experimentos utilizando sevoflurano ou isoflurano enquanto grávida deve ser fortemente desencorajada.

1. Trabalhar sob um exaustor de laboratório.
2. Personalize um circuito anestésico máquina para alternar a linha de gás de óxido nitroso, dióxido de carbono (CO₂).
3. Conecte a câmara estanque com o tubo ondulado verde-marcado o circuito da máquina anestésica personalizado. Inserir o tubo entre a máquina de anestesia e a câmara estanque para aquecer a mistura de fluxo de gás para cerca de 37 ° C com um umidificador aquecido (tais como aqueles usados em ventiladores de ICU)
4. Instalar a câmara estanque em uma chapa quente, proporcionando um aquecimento da placa a temperatura de 37° C.
5. Coloca o 6-placa contendo as células de hAELVI para a prova de ar câmara e feche a tampa.
6. Regule as taxas de fluxo de gás (ou seja, a mistura de ar e CO₂) para obter rapidamente as condições padrão, definidas como 5% de CO₂ e 95% de ar umidificado.
7. Abra o evaporador agente halogenados e escolha a porcentagem desejada (no presente estudo, as concentrações testadas de sevoflurano e isoflurano foram 4% e 1%, respectivamente).
8. Observe a composição da mistura e o sevoflurano, isoflurano concentração do gás como medido por um analisador de gás externo e exibido na tela.
9. Uma vez que os valores-alvo são alcançados, reduza a taxa de fluxo de gás fresco a 1 L/min.
10. A câmara estanque pode ser mantida com esta taxa de fluxo de gás, enquanto necessário para o experimento.

4. medir o sevoflurano ou isoflurano por cromatografia

1. Preparação de amostras
   1. Nos pontos de tempo diferente, muito brevemente abrir a câmara para tirar as amostras estudadas (no presente estudo, nós usamos uma placa-6) e feche a tampa. Mantenha as outras amostras na caixa. Em seguida, Aspire 1 mL do meio de contido em cada amostra com uma micropipeta ajustável de vários volume.
   2. Colocar o médio em 10 mL frascos de cromatografia por "headspace", que devem ser apertados hermeticamente com uma tampa de Teflon-selado. Congele os frascos de cromatografia-20 ° C, se você não usá-los imediatamente.
   3. Prepare uma solução stock de sevoflurano e outra solução stock de isoflurano, ambos a 50 g/L em metanol. Simultaneamente, prepare uma solução stock de clorofórmio (padrão interno, IS) a 2 g/L em metanol. Armazenar todas as soluções-padrão a-20 ° C.
   4. Preparar soluções de trabalho de sevoflurano e isoflurano em 50, 500 e 5000 mg/L em água ultrapura/dimetil sulfoxyde (50/50; v/v). Para padronização interna, a solução é fixada em 100 mg/L de metanol.
2. Análise de amostras celulares
   Nota: O procedimento de extração se baseia o método de cromatografia gasosa e espectrometria de massa de Bourdeaux et al previamente validado ¹ e usa os mesmos parâmetros de sensibilidade e especificidade. Sevoflurano e clorofórmio (IS) foram utilizados no presente protocolo, e isoflurano foi associado com o método analítico Multiparamétrico. Brevemente, para aquisição de espectrometria de massa, o método foi desenvolvido após a injeção de solução pura. Em seguida, m/z foi confirmado com padrões de referência e dados da literatura. M/z três foram selecionados para cada analito (exceto si): um m/z para quantificação (o maior e o mais abundante), para o qual abundância foi calculada através da integração da área sob a curva para quantificação e dois m/z para confirmação. Usando três m/z, analitos poderiam ser especificamente identificados porque todos m/z tinha o mesmo tempo de retenção, bem como porque todos os valores de m/z (parente do íon confirmação vs quantificação) eram os mesmos na norma pura e em todas as amostras. Com este modo de aquisição, analitos poderiam ser identificados e quantificados com boa especificidade.
   1. Construir uma curvas de 8 pontos de calibração com as gamas de concentração de 0,5-400 mg/L e a qualidade de Múltiplo controles (0,5, 1, 5, 10, 20, 75, 200 e 400 mg/L).
      Nota: Para validar cada calibração, quatro controles de qualidade foram usado: o limite inferior de quantificação (C1 = 0,5 mg/L), dois intermediários níveis (C2 = 20 mg/L e C3 = 75 mg/L) e o nível final (C4 a 400 mg/L; nível superior de quantificação). Todas as normas e controles foram analisados em matrizes de células cultivadas para evitar o efeito de matriz. Para cada curva de calibração, uma matriz em branco foi analisada para validar que não havia nenhuma interferência com as normas internas e celulares culturas.
   2. Prepare uma solução stock de sevoflurano e outra solução stock de isoflurano, ambos a 50 g/L em metanol. Simultaneamente, prepare uma solução stock de clorofórmio (padrão interno, IS) a 2 g/L em metanol. Armazenar todas as soluções-padrão a-20 ° C. Então, prepare-se soluções de trabalho de sevoflurano/isoflurano misturado em 50, 500 e 5000 mg/L em água ultrapura / dimetil sulfoxyde (50/50; v/v). Para IS, a solução é diluída em 100 mg/L de metanol.
   3. Para as curvas de calibração e controles, prepare as amostras por cravação 50 µ l de IS (100 mg/L) em 1 mL de matrizes de amostra celular.
   4. Prepare soluções de amostra com 200 µ l de solução de água saturada de cloreto de sódio em um tubo de headspace de 10 mL, hermeticamente apertada com uma tampa de Teflon-selado.
3. Cromatografia gasosa e espectrometria de massa
   1. Para análises, use injeções de headspace em uma cromatografia, juntamente com o método de deteção de massa.
   2. Carrega tubos de headspace para 10 min a 80 ° C com um misturador aquecedor. Em seguida, retirar e injetar 1,5 mL da amostra do gás no cromatógrafo a gás. Defina o parâmetro do injector a 260 ° C, com um fluxo dividido em 100 mL/min por 2 min no início da execução de cromatografia.
   3. Use o injector Split/splitless com uma pressão de modo programado do portador. Em primeiro lugar, manter a pressão do gás a 40 kPa para 0,15 min. Em seguida, aumente a pressão de programa de taxa de 150 kPa em 125 kPa/min antes de definir uma taxa de 16min/kPa a 300 kPa pressão por 5 min.
   4. Acesso simultâneo para a injeção, começar com uma temperatura de 60 ° C, durante 1 min e aumento do forno até atingir uma temperatura de 140 ° C a uma taxa de 20 ° C/min. Em seguida, aumente novamente a temperatura até 250 ° C seja alcançado. O tempo total da corrida é de 7 min.
   5. Realizar a separação cromatografia usando uma coluna capilar de sílica fundida (30 m x 1,4 µm, 0.25 mm ID). Realizar experimentos em massa com um único íon de monitoramento de condição (SIM) e monitorar a quantificação de íon m/z 181 e íon qualificações m/z 151 e 51 simultaneamente a um tempo de retenção (RT) de 2,30 min para sevoflurano, m/z 149 (quantificação do íon), m/z 115 e 87 (íon qualificações) de isoflurano em RT 2.8 min e m/z 83 (quantificação de íons) de clorofórmio no RT 3.70 min.
   6. Determine as concentrações de sevoflurano e isoflurano na cultura de pilha por seus rácios área do IS usando um ajuste quadrático de peso. Limite inferior de quantificação (LLOQ) para o sevoflurano e isoflurano foi de 0,5 mg/L e o limite superior de quantificação (ULOQ) foi de 400 mg/L.

Resultados

As concentrações do sevoflurano e isoflurano, que dissolveu a médio ao longo do tempo, são relatadas na tabela 1 e tabela 2, respectivamente.

Os cursos das concentrações no meio de sevoflurano e isoflurano foram semelhantes ao longo do tempo. Imediatamente após a concentração necessária de agente halogenado foi definida, concentrações levantou-se durante a primeira hora. Então foi a...

Discussão

Nosso protocolo descreve um método fácil para expor as células para uma fração precisa de um agente anestésico halogenado, tais como o sevoflurano ou isoflurano. Além disso, nós relatamos aqui — pela primeira vez — uma rigorosa correlação entre a fração do gás e da concentração de sevoflurano e isoflurano dentro do próprio meio de cultura. Este passo fundamental agora nos permite usar com segurança a nossa câmara estanque para estudar os efeitos destes agentes halogenados em uma cultura monocamadas ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sevoflurane	Baxter		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane	Virbac		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells	InScreenex	INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use)	InScreenex	INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit	Drager	Fabius
Gas analyzer	Drageer	Vamos Plus
Anesthetic gas filter	SedanaMedical	FlurAbsord
Heated Humifier	Fisher&Paykel	MR850
Chamber	Curver	00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection	Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA	Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID)	Restek, Lisses, France	Rxi-624Sil MS