In Vitro Méthode de contrôle des Concentrations de gaz halogénés en cellules épithéliales alvéolaires

Résumé

Les auteurs décrivent un protocole facile, spécialement conçu pour atteindre des concentrations précises et contrôlées du sévoflurane ou isoflurane le in vitro afin d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans les lésions épithéliales pulmonaires et de tester les roman traitements pour le syndrome de détresse respiratoire aiguë.

Résumé

Syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est un syndrome d’une blessure alvéolaire diffuse avec dégagement de fluide alvéolaire avec facultés affaiblies et une inflammation sévère. L’utilisation d’agents halogénés, comme sévoflurane ou isoflurane, pour la sédation des patients de l’unité de soins intensifs (USI) peut améliorer les échanges gazeux, réduire l’oedème alvéolaire et atténuer l’inflammation au cours du SDRA. Cependant, manque des données sur l’utilisation des agents inhalés pour la sédation continue en réanimation pour traiter ou prévenir les dommages aux poumons. Afin d’étudier les effets des agents halogénés sur les cellules épithéliales alvéolaires dans des conditions « physiologiques », nous décrire un système facile à des cellules de culture à l’interface air-liquide et de les exposer à des agents halogénés pour fournir des fractions précis contrôlé « air » et concentrations de « moyen » pour ces agents. Nous avons développé une chambre hermétique scellée dans laquelle plaques avec des cellules immortalisées épithéliales alvéolaires humaines pourraient être exposés à une fraction précise et contrôlée du sévoflurane ou isoflurane en utilisant un flux de gaz en continu fourni par un circuit de la machine anesthésique. Les cellules ont été exposés à 4 % de sévoflurane et 1 % d’isoflurane pendant 24 heures. Spectrométrie de masse de gaz a été réalisée afin de déterminer la concentration des agents halogénés dissous dans le milieu. Après la première heure, la concentration de sévoflurane et isoflurane dans le milieu ont été 251 mg/L et 25 mg/L, respectivement. Les courbes représentant la concentration de sévoflurane et isoflurane dissolvent dans le milieu ont montré des cours similaires au fil du temps, avec un plateau à une heure après l’exposition.

Ce protocole a été spécialement conçu pour atteindre des concentrations précises et contrôlées de sévoflurane ou isoflurane in vitro afin d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans les lésions épithéliales pulmonaires au cours du SDRA et de tester de nouveaux traitements pour les syndrome.

Introduction

Syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est un syndrome clinique caractérisé par des lésions alvéolaires diffuses, œdème pulmonaire et une insuffisance respiratoire hypoxémie. Bien que SDRA représente plus de 10 % des admissions de l’unité de soins intensifs (USI) et près de 25 % des patients ICU nécessitant une ventilation mécanique, c’est toujours un défi sous-diagnostiquée pour les cliniciens, avec un taux de mortalité de l’hôpital de 35 à 45 %¹. Malgré d’intenses recherches, l’identification d’un traitement pharmacologique efficace SDRA ou la prévention a échoué jusqu'à présent. Deux principales caractéristiques contribuent à la mortalité en SDRA : malentendants jeu fluide alvéolaire (AFC) (c.-à-d., la résorption altérée du liquide d’oedème alvéolaire d’espaces d’air pulmonaire distale) et une inflammation sévère². Puisque ARDS de mortalité demeure élevé, initiatives actuelles devraient également inclure la prévention primaire ; Cependant, des principaux défis sont d’identifier les patients à risque dans lesquels SDRA est susceptible de se transformer et qui bénéficieraient si SDRA ont été empêché.

Les anesthésiques halogénés volatils, comme le sévoflurane et isoflurane, sont largement utilisés pour fournir une anesthésie générale au bloc opératoire. Dans le monde entier, plus de 230 millions de patients subissant une intervention chirurgicale majeure chaque année nécessitent une anesthésie générale et ventilation mécanique³, et des complications pulmonaires postopératoires altèrent les résultats cliniques et l’utilisation de soins de santé⁴ . L’utilisation de sévoflurane au lieu de propofol a été associée à l’inflammation pulmonaire améliorée chez les patients subissant une chirurgie thoracique et une diminution significative des événements indésirables, tels que l’ARDS et complications pulmonaires postopératoires⁵. De même, un prétraitement à l’isoflurane a des effets protecteurs sur la mécanique respiratoire, l’oxygénation et l’hémodynamique dans des modèles animaux expérimentaux de SDRA^6,7. Bien que d’autres études sont garantis d’examiner l’incidence des agents inhalés sur les résultats en chirurgie thoraciques, une diminution des complications pulmonaires similaire a été observée récemment dans une méta-analyse, démontrant que par inhalation des agents anesthésiques — comme opposé à l’anesthésie intraveineuse — sont significativement associée à une réduction de la mortalité pour la chirurgie cardiaque,⁸.

Les données prospectives spécifiques sur l’utilisation des agents volatils pour la sédation des patients ICU pour prévenir ou traiter des lésions pulmonaires sont absent. Toutefois, plusieurs essais prennent désormais en charge l’efficacité et l’innocuité du sévoflurane inhalée pour la sédation des patients ICU, et les études précliniques ont montré que le sévoflurane inhalée et isoflurane^7,9 améliorer les échanges gazeux, réduire oedème alvéolaire et atténuer l’inflammation dans des modèles expérimentaux de SDRA. En outre, sévoflurane atténue type II cellules épithéliales dommages¹⁰, tandis qu’isoflurane maintient l’intégrité de la barrière alvéolo-capillaire par la modulation des protéines de jonction serrée¹¹. Toutefois, les autres études sont nécessaires pour vérifier dans quelle mesure les preuves expérimentales de protection orgue de sévoflurane inhalée et isoflurane peuvent se traduire pour l’être humain. Un premier single-Centre contrôlée-essai randomisé (ECR) de notre groupe ont découvert que l’utilisation précoce de sévoflurane inhalé chez les patients atteints de SDRA et oxygénation améliorée, réduction des taux de certains marqueurs pro-inflammatoires et pulmonaire réduite épithéliales dommage, tel qu’évalué par le niveau de la forme soluble du récepteur pour produits de glycation avancée (iniriale) dans le plasma et alvéolaire fluide¹².

Pris ensemble, les effets bénéfiques de sévoflurane et isoflurane sur lésion pulmonaire peuvent pointer vers plusieurs voies biologiques ou les processus fonctionnels qui dépendent de la voie de la RAGE, à savoir jeu fluide alvéolaire (AFC), des lésions épithéliales, la translocation du facteur nucléaire (NF)-κB et l’activation des macrophages. En outre, sévoflurane peut influencer l’expression de la protéine RAGE lui-même. Étant donné que des recherches antérieures par notre équipe de recherche et d’autres prend en charge un rôle essentiel pour la RAGE en inflammation alvéolaire et poumon épithéliales blessure/réparation au cours du SDRA, nous avons conçu un modèle expérimental pour fournir une compréhension translationnelle des mécanismes de sévoflurane en poumon dommage et réparation^13,14,15. Les effets in vitro de sévoflurane et isoflurane ont été étudiés en ligne roman humaine alvéolaire primaire des cellules épithéliales, spécifiquement conçue pour étudier la barrière air-sang du poumon périphérique, hAELVi (humain LentiVirus épithélial alvéolaire immortalisée), présentant des caractéristiques de j’ai-comme de type alvéolaire dont des jonctions serrées fonctionnelles¹⁶.

Tout en préparant la conception de nos recherches in vitro (p. ex., cultures de cellules épithéliales alvéolaires à l’interface air-liquide avec l’exposition « inhalation » sévoflurane ou isoflurane, nous avons compris dès inédit qui étudie fractions de sévoflurane ont seulement été évaluées dans le « air » interface^17,18,19 à l’aide de moniteurs standard (similaires à celles utilisées en milieu clinique). Concentrations d’agent halogénés ont été choisies généralement selon les valeurs de concentration alvéolaire minimale (MAC) (par exemple, chez l’homme, pour le sévoflurane, 0,5 1,1 et vol 2,2 %, ce qui représente 0,25, 0,5 et 1 MAC, respectivement ; pour l’isoflurane, 0.6, 0.8, et ²⁰de vol 1,3 % ce qui représente 0,25, 0,5 et 1 MAC, respectivement). En effet, concentration de sévoflurane et isoflurane ont jamais été étudiées dans le milieu de culture lui-même, ce qui limite la validité des anciens modèles expérimentaux/instruments. En outre, la plupart des expériences utilisés pot d’anaérobie qui a été scellé après que le sévoflurane contenant de mélange air avait été vidée à l’intérieur. Comme notre but était d’étudier les cellules épithéliales alvéolaires dans des conditions « physiologiques », nous avons cru que tel un État anaérobie n’est peut-être pas optimale et qu’il ne serait pas compatible avec des durées longues expérimentales. Donc, nous avons développé notre propre système de cellules en culture à l’interface air-liquide et de les exposer aux agents halogénés (sévoflurane et isoflurane) dans le but de fournir des fractions « aérien » contrôlé précis et des concentrations « moyen » pour ces agents. À notre avis, cette étape expérimentale, qui n’a pas été signalée à ce jour dans la littérature, est obligatoire avant toute autres investigations in vitro de sévoflurane et isoflurane.

Protocole

1. culture des cellules épithéliales alvéolaires (hAELVi)

1. Dégel
   1. Pipetter 4 mL de milieu de culture prêt à l’emploi humain alvéolaire épithéliales (huAEC) dans un tube en plastique de 15 mL et décongeler rapidement le flacon au bain-marie préchauffé (37 ° C).
   2. Transférer la suspension cellulaire décongelés dans un tube de 15 mL en plastique contenant 4 mL du milieu avant la centrifugation du tube à 200 x g pendant 5 min.
   3. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 5 mL de la milieu de culture. Ensuite, transférer les cellules dans une fiole de T25.
   4. Cultiver les cellules dans des conditions normales (5 % de CO₂, 95 % humidifie l’air, 37 ° C)
2. Fractionnement
   1. Vérifier l’état des cellules au microscope. Lorsque les cellules sont 80 à 90 % anastomosé, fractionner les cellules, en suivant les étapes 1.2.2 par 1.2.10.
   2. Aspirer le support de culture des cellules avec une pipette stérile de.
   3. Laver les cellules une fois avec 4 mL de Dulbecco Phosphate Buffered Saline (SPD) et aspirer le SPD.
   4. Ajouter 1 mL de solution de trypsine/EDTA (TE) dans les cellules avant incubation à 37 ° C pendant 3 min, jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher ; Recherchez le détachement sous un microscope.
   5. Remettre en suspension les cellules avec 2 mL de milieu de culture et centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min. Ensuite, aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 3 mL de milieu culture.
   6. Utilisez le test d’exclusion de colorant bleu trypan pour déterminer la viabilité des cellules. Prendre 30 µl de la suspension cellulaire et ajouter 30 µl d’une solution de 0,4 % de trypan bleu dans un tube. Après cela, effectivement mélanger la solution 3 - 5 fois en utilisant une pipette 100 µl. Prendre 10 µl de la solution et placez-la sous le couvre-objet de l’hémocytomètre.
   7. Compter le nombre de cellules viables tant le nombre de cellules mortes (bleu) dans les domaines de l’hémocytomètre. Puis, calculer la viabilité cellulaire [%] en utilisant l’équation : viabilité cellulaire = 100 – (100 / nombre total de cellules x nombre de cellules mortes)
   8. Transférer l’aliquote avec le culot cellulaire resuspendues dans un nouveau flacon de T25 de culture cellulaire ou une plaque 6 puits. Ajouter le milieu de culture pour les cellules pour atteindre un total de 5 mL de milieu de culture dans le flacon de T25, ou 1 mL pour chaque puits de la plaque 6 puits.
   9. Cultiver les cellules dans un incubateur dans des conditions normales (5 % de CO₂, 95 % humidifie l’air, 37 ° C)
   10. Une fois que les cellules sont complètement confluentes, ils sont prêts pour l’expérience.

2. Elaboration d’une chambre étanche à l’Air

Remarque : Le plan de construction de la chambre étanche à l’air est représenté dans la Figure 1.

1. Utilisez une boîte hermétique en polypropylène avec une capacité de 6,5 L. La longueur, la largeur et la hauteur sont 30 x 20 x 15,5 cm, respectivement. Veuillez noter que le volume de la boîte est plus faible que le volume théorique en raison de l’arrondi.
2. Percer un trou de diamètre de 2,5 cm sur la face inférieure de la paroi latérale.
3. Insérer un tube ondulé avec une marque verte, qui servira le tuyau d’entrée du mélange gaz-air et scellez-la avec de la silicone.
4. Percer un deuxième trou de diamètre de 2,5 cm sur le dessus de la paroi latérale opposée.
5. Insérer un autre tube ondulé avec une marque rouge et le connecter avec un filtre à charbon, ce qui servira le tuyau de sortie du mélange gaz-air et scellez-la avec de la silicone.
6. Percer un trou de diamètre serré de 4 mm au centre de la moyenne de la paroi de la boîte.
7. Insérer tubulure de perfusion courte qui est relié à un collecteur avec un rotation luer-lock mâle, qui doit être connecté à un analyseur de gaz et scellez-la avec de la silicone.
8. Placez un thermomètre/hygromètre digital à l’intérieur de la chambre étanche à l’air.

3. exposer les cellules épithéliales alvéolaires à des Agents halogénés (sévoflurane et Isoflurane)

Remarque : Un schéma de l’appareil est représenté dans la Figure 2.

ATTENTION : Bien que les études chez l’animal ont révélé aucun signe de blessure fœtale ou altération de la fertilité, et une très petite étude au cours de la césarienne n’a pas montré les effets négatifs sur la mère ou le foetus, l’innocuité des halogénés (p. ex., des agents sévoflurane ou isoflurane) pendant le travail et l’accouchement n’a pas été démontré à ce jour. En outre, aucune données contrôlées n’ont été collectées au cours de la grossesse humaine. Par conséquent, réaliser des expériences à l’aide de sévoflurane ou isoflurane tandis que les femmes enceintes doivent être fortement déconseillés.

1. Travailler sous une hotte de laboratoire.
2. Personnaliser un circuit anesthésique machine permettant de changer la conduite de gaz d’oxyde nitreux en dioxyde de carbone (CO₂).
3. Branchez la chambre étanche à l’air avec le tube ondulé, vert marqué dans le circuit machine anesthésique sur mesure. Introduisez un humidificateur chauffant (tels que ceux utilisés sur les ventilateurs d’ICU) dans le tuyau entre la machine d’anesthésie et de la chambre étanche à l’air pour réchauffer le mélange de débit de gaz d’environ 37 ° C
4. Installer la chambre étanche à l’air sur une plaque chauffante, un chauffage sur plaque de température de 37° C.
5. Mettre la plaque-puits 6 contenant les cellules hAELVI dans l’air ne s’échappe de chambre et sceller le couvercle.
6. Réguler le débit de gaz (c'est-à-dire, le mélange d’air et CO₂) afin d’obtenir rapidement les conditions standards, définies comme 5 % de CO₂ et 95 % de l’air humidifié.
7. Ouvrez l’évaporateur agent halogénés et choisissez le pourcentage désiré (dans la présente étude, les concentrations testées de sévoflurane et isoflurane étaient de 4 % et 1 %, respectivement).
8. Notez la composition de la concentration de gaz mélange et le sévoflurane ou isoflurane mesuré par un analyseur de gaz externe et affichée sur l’écran.
9. Une fois que les valeurs cibles sont atteints, réduire le débit de gaz frais à 1 L/min.
10. La chambre étanche à l’air peut être maintenue à ce débit de gaz aussi longtemps que nécessaire pour l’expérience.

4. mesurer le sévoflurane ou Isoflurane par chromatographie

1. Préparation des échantillons
   1. À différents moments, très brièvement ouvrir la chambre pour sortir les échantillons étudiés (dans la présente étude, nous avons utilisé une plaque 6 puits) et refermer le couvercle. Gardez les autres échantillons dans la zone. Ensuite, aspirez 1 mL de milieu contenu dans chaque échantillon avec une micropipette réglable multi-volumes.
   2. Mettre le support en flacons de chromatographie de feuillure de 10 mL, qui doivent être vissés hermétiquement étanche avec un bouchon étanche téflon. Congeler les flacons de chromatographie à-20 ° C si vous ne les utilisez pas immédiatement.
   3. Préparer une solution mère de sévoflurane et une autre solution-mère d’isoflurane, tous deux à 50 g/L dans le méthanol. En même temps, préparer une solution de chloroforme (standard interne, IS) à 2 g/L dans le méthanol. Stocker toutes les solutions standards à-20 ° C.
   4. Préparer des solutions de travail de sévoflurane et isoflurane à 50, 500 et 5 000 mg/L dans l’eau ultrapure/diméthyl diméthylsulfoxyde (50/50 ; v/v). De normalisation interne, la solution de travail est fixée à 100 mg/L dans le méthanol.
2. Analyse des échantillons cellulaires
   Remarque : La procédure d’extraction est basée sur la méthode précédemment validée de chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse de Bourdeaux et al. ¹ et utilise les mêmes paramètres de sensibilité et de spécificité. Sévoflurane et le chloroforme (IS) ont été utilisés dans le présent protocole, et isoflurane a été associé à la méthode d’analyse multiparamétrique. En bref, pour l’acquisition de spectrométrie de masse, la méthode a été développée après l’injection de solution pure. Puis, m/z a été confirmée avec des étalons de référence et les données de la littérature. Trois m/z ont été choisis pour chaque analyte (sauf IS) : un m/z pour la quantification (le plus abondant et le plus élevé), pour lequel l’abondance a été calculée en intégrant la surface sous la courbe pour la quantification et deux m/z pour confirmation. À l’aide de trois m/z, analytes pourrait être spécifiquement identifiées car tout m/z avait le mêmes temps de rétention, mais aussi parce que tous les montants de m/z (parent d’ion confirmation vs quantification) étaient les mêmes dans la norme pure et dans tous les échantillons. Avec ce mode d’acquisition, les analytes pourraient être identifiés et quantifiés avec bonne spécificité.
   1. Construire une courbes de 8 points d’étalonnage avec les gammes de concentration de 0,5 à 400 mg/L et qualité plusieurs contrôles (0,5, 1, 5, 10, 20, 75, 200 et 400 mg/L).
      Remarque : Pour valider chaque étalonnage, quatre contrôles de qualité ont été utilisés : la limite inférieure de quantification (C1 = 0,5 mg/L), deux intermédiaires niveaux (C2 = 20 mg/L et C3 = 75 mg/L) et le niveau final (C4 à 400 mg/L ; niveau supérieur de quantification). Toutes les normes et les contrôles ont été analysées dans des matrices de cellules cultivées pour éviter l’effet de la matrice. Pour chaque courbe d’étalonnage, une matrice vide a été analysée afin de valider qu’il n’a pas d’interférence avec les normes internes et cellulaires cultivées.
   2. Préparer une solution mère de sévoflurane et une autre solution-mère d’isoflurane, tous deux à 50 g/L dans le méthanol. En même temps, préparer une solution de chloroforme (standard interne, IS) à 2 g/L dans le méthanol. Stocker toutes les solutions standards à-20 ° C. Ensuite, préparer une travail mixte sévoflurane/isoflurane à 50, 500 et 5 000 mg/L dans l’eau ultrapure / diméthyl diméthylsulfoxyde (50/50 ; v/v). Pour IS, la solution est diluée à 100 mg/L dans le méthanol.
   3. Pour les contrôles et les courbes d’étalonnage, préparer les échantillons en fortification 50 µL de IS (100 mg/L) dans 1 mL des matrices de prélèvement cellulaire.
   4. Préparer les solutions d’échantillon avec 200 µL de solution aqueuse saturée de chlorure de sodium dans un tube de 10 mL headspace, vissé hermétiquement étanche avec un bouchon étanche téflon.
3. Chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse
   1. Pour les analyses de l’échantillon, utiliser des injections de feuillure à une chromatographie en phase gazeuse, couplée avec la méthode de dépistage de masse.
   2. Transporter des tubes headspace pendant 10 min à 80 ° C avec un shaker de chauffage. Ensuite, retirer et injecter 1,5 mL de l’échantillon de gaz dans le chromatographe en phase gazeuse. Définissez le paramètre de l’injecteur à 260 ° C avec un débit de split à 100 mL/min pendant 2 min au début de la course de chromatographie.
   3. Utiliser un injecteur Split/splitless avec une pression de mode-programmé du transporteur. Tout d’abord, maintenir la pression du gaz à 40 kPa pour 0.15 min. Ensuite, augmenter la pression de programme de taux à 150 kPa à 125 kPa/min avant d’affecter un taux de 16 kPa/min 300 kPa pression pendant 5 min.
   4. Simultanée à l’injection, commencez avec une température de 60 ° C pendant 1 min et augmentation jusqu'à obtention d’une température de 140 ° C à raison de 20 ° C/min. Ensuite, augmenter la température à nouveau jusqu'à atteindre 250 ° C. La durée totale de la course est de 7 min.
   5. Effectuer la séparation de chromatographie à l’aide d’une colonne capillaire en silice fondue (30 m x 1,4 µm, 0,25 mm ID). Réaliser des expériences de massives avec une ion simple surveillance de l’État (SIM) et surveiller la quantification d’ion m/z 181 et ion qualités m/z 151 et 51 simultanément à un temps de rétention (RT) de 2,30 min pour le sévoflurane, m/z 149 (quantification des ions), m/z 115 et 87 (ion qualifications) pour l’isoflurane à 2.8 RT min et m/z 83 (quantification de l’ion), du chloroforme à RT 3,70 min.
   6. Déterminer la concentration de sévoflurane et isoflurane dans la culture de cellules de leurs ratios de surface à celui de l’IS à l’aide d’une forme quadratique de poids. La limite de quantification (PPQM) pour le sévoflurane et isoflurane était à 0,5 mg/L et la limite supérieure de quantification (LSDQ) était de 400 mg/L.

Résultats

Les concentrations du sévoflurane et isoflurane, qui dissous dans le milieu au fil du temps, sont signalées dans le tableau 1 et tableau 2, respectivement.

Les méandres de la concentration de sévoflurane et isoflurane dans le milieu étaient semblables au fil du temps. Immédiatement après que la concentration requise d’agent halogéné a été définie, les concentrations ont augmenté a...

Discussion

Notre protocole décrit une méthode simple pour exposer les cellules à une fraction précise d’un agent anesthésique halogéné, comme sévoflurane ou l’isoflurane. En outre, nous rapportons ici — pour la première fois — une corrélation rigoureuse entre la fraction de gaz et la concentration de sévoflurane et isoflurane à l’intérieur du milieu de culture lui-même. Cette étape fondamentale permet maintenant d’utiliser en toute sécurité notre chambre étanche à l’air pour étudier les effets de c...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sevoflurane	Baxter		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane	Virbac		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells	InScreenex	INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use)	InScreenex	INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit	Drager	Fabius
Gas analyzer	Drageer	Vamos Plus
Anesthetic gas filter	SedanaMedical	FlurAbsord
Heated Humifier	Fisher&Paykel	MR850
Chamber	Curver	00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection	Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA	Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID)	Restek, Lisses, France	Rxi-624Sil MS