体外培養肺胞上皮細胞におけるハロゲン化ガスの濃度を制御する方法

要約

具体的に達するように設計正確かつ制御された濃度セボフルランやイソフルランの in vitroの上皮性肺障害に関与するメカニズムの私達の理解を改善するために、小説をテストする簡単なプロトコルについて述べる急性呼吸窮迫症候群の治療。

要約

急性呼吸窮迫症候群 (ARDS) は、障害者の肺胞液クリアランスと重度の炎症びまん性肺胞損傷の症候群です。集中治療室 (ICU) 患者の鎮静のイソフルラン、セボフルランなどのハロゲン化剤を使用することができますガス交換を改善、肺胞浮腫を軽減、ARDS の中に炎症を弱めます。ただし、連続的な鎮静治療または肺の損傷を防ぐために ICU での吸入剤の使用上のデータは欠けています。「生理学的」条件下での肺胞上皮細胞におけるハロゲン化剤の効果を検討する我々 は気液界面培養細胞に対する簡単なシステムを記述して正確な制御「空気」分数を提供するハロゲン化剤にそれらを公開し、これらのエージェントの「中」の濃度。セボフルランやイソフルラン麻酔器回路によって提供されるガスの連続的な流れを使用して正確な制御された分数にさらされるひと肺胞上皮不死化細胞とプレートで密閉気密室を開発しました。細胞は、24 時間 4% セボフルランとイソフルランの 1% にさらされました。ガス質量分析法は、媒体に溶解したハロゲン化剤の濃度を決定するため行われました。最初の後時間, セボフルランとイソフルラン吸入中の濃度であった 251 mg/L と 25 mg/L。セボフルランとイソフルランの濃度を表す曲線は、時間をかけて、1 時間暴露後に達した高原と類似したコースを示した媒体に溶解しました。

このプロトコルは、セボフルランやイソフルラン体外ARDS の間に上皮性肺障害に関与するメカニズムの私達の理解を改善するためとの新規治療法をテストするための正確かつ制御された濃度に到達するために設計されました、症候群。

概要

急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)、びまん性肺胞損傷、肺浮腫、および hypoxemic の呼吸不全によって特徴付けられる臨床的な症候群です。ARDS は、集中治療室 (ICU) 入学の 10% 以上、機械換気を必要とする ICU 患者の約 25% を表し、それはまだ 35-45¹の病院の死亡率と、臨床医のための認識の下で挑戦です。強烈な研究にもかかわらず、ARDS の薬理学的治療または予防の同定は、日付に失敗しました。ARDS の死亡率に貢献する 2 つの主要な機能: 障害肺胞液クリアランス (AFC) (すなわち、遠位部の肺空域から肺胞浮腫液の変化の吸収) と重度の炎症²。以来、ARDS の死亡率は高いまま、現在の取り組みも一次予防; を含める必要があります。しかし、重要な課題は ARDS を発症する可能性は誰と誰が得を ARDS ができない場合のリスクの高い患者を識別します。

セボフルランやイソフルランなど、揮発性のハロゲン化麻酔薬は、手術室で全身麻酔を提供するために広く使用されます。世界中で全身麻酔と換気³、毎年主要な手術よりも 2 億 3000 万の患者が必要し、臨床転帰と医療利用^{4 術後肺合併症に悪影響}.セボフルラン プロポ フォールではなく使用は、呼吸器外科と ARDS と術後肺合併症⁵などの有害事象の重要な減少の患者で改善された肺の炎症と関連付けられました。同様に、イソフルランによる前処理は、ARDS^6、7の実験動物モデルで血行動態、酸素、呼吸力学に対する保護効果を持っていた。肺合併症と同様の減少が最近、吸入麻酔剤を示すメタ分析で観察されている非心臓手術の転帰に吸入剤の影響に対処するため、さらなる研究が保証されているが-として静脈麻酔に反対-⁸心臓手術死亡率の削減に大幅に関連付けられています。

防止したり、肺の損傷を治療する ICU 患者の鎮静のため揮発性剤の使用に関する特定のプロスペクティブなデータは欠けています。ただし、いくつかの試験は今の ICU 患者の鎮静とセボフルラン吸入麻酔の安全性をサポート、前臨床研究は、吸入セボフルランとイソフルラン^7,9ガス交換を改善、軽減に示されています。肺胞浮腫と ARDS の実験モデルでの減衰の炎症。また、イソフルラン タイト結合タンパク質の¹¹の変調による歯槽毛管障壁の整合性を維持するのに対し、セボフルランはタイプ II の上皮細胞のダメージ¹⁰を軽減します。しかし、さらなる研究がどの程度吸入セボフルランとイソフルラン吸入から臓器保護の実験的証拠を人間に翻訳できることを確認する必要です。最初単一施設無作為化制御-試験 (RCT) 私たちのグループから発見 ARDS 患者における吸入セボフルランの早期使用は改良された酸素処理、いくつかのプロ炎症性マーカー、および減らされた肺上皮の減らされたレベルと関連付けられています。損傷、プラズマと肺胞液¹²で高度の glycation の最終製品 (sRAGE) の受容体の可溶性のレベルにより評価しました。

一緒に取られて、肺障害に対するセボフルランとイソフルランの有益な効果は、複数の生物学的経路または肺胞液クリアランス (AFC)、上皮損傷、すなわち怒り経路に依存している機能のプロセスを指すことが核因子 (NF) の転流-B とマクロファージ活性化。また、セボフルランが怒り蛋白質自体の表現に影響を与えます。並進運動のメカニズムの理解を提供する実験的モデルを考案した当社の調査チームなどによる前の調査は、ARDS の中に肺胞の炎症や肺上皮傷害/修理の怒りの極めて重要な役割をサポートするのでセボフルラン肺傷害と修復^13,14,15。HAELVi (人間の肺胞上皮レンチ末梢肺の空気血液関門を研究に特化した新規ひと肺胞上皮プライマリ細胞ラインでセボフルランとイソフルランの生体外で影響を調べた不死化)、機能のタイトな接合¹⁶を含む型肺胞のような特性を持つ。

生体外で調査の設計を準備中 (など「吸入」セボフルランやイソフルランへの暴露と気液界面における肺胞上皮細胞の培養、わかったから以前に発表された研究セボフルランの分数は、「空気」インターフェイス^17,18,19標準的なモニター (臨床設定で使用されるものに似ています) を使用してのみ評価されている.ハロゲン化剤濃度は通常最小肺胞内濃度 (MAC) 値に従って選ばれた (例えば、ヒト、セボフルラン、0.5、1.1、および 2.2 vol %、0.25、0.5、および 1 の MAC を表すそれぞれのイソフルラン、0.6、0.8 と0.25、0.5、および 1 の MAC をそれぞれ表す 1.3 vol %)²⁰。確かに、セボフルランとイソフルラン吸入濃度決して行った従って実験モデル/楽器の前の有効性を制限すること自体は、培養液中で。また、ほとんどの実験は、空気のミックス含むセボフルランは内部フラッシュされていた後に封印された嫌気性の jar を使用しました。私たちの目標は、「生理」の条件下で肺胞上皮細胞を研究することだったと、そのような嫌気状態が最適ではないかもしれない、長い実験期間と互換性がないだろうと考えました。したがって、我々 は気液界面培養細胞に独自のシステムを開発、精密制御された「空気」分数とこれらのエージェント「中濃度を提供すること目的とハロゲン化剤 (セボフルランとイソフルラン) にそれらを公開。我々 の意見で文学にまで報告されていないが、この実験の手順はセボフルランとイソフルランのさらなる生体外で調査する前に必須です。

プロトコル

1. 肺胞上皮細胞 (hAELVi) の文化

1. 融解
   1. 栽培に使えるひと肺胞上皮 (huAEC) 15 mL プラスチック チューブ中の 4 mL をピペットし、予熱した水浴 (37 ° C) のバイアルをすばやく解凍します。
   2. 解凍の細胞懸濁液を 5 分間 200 x g でチューブを遠心分離する前に培地 4 mL を含む 15 mL プラスチック チューブに転送します。
   3. 上清を吸引し、5 mL の培地で細胞ペレットを再懸濁します。その後、T25 フラスコにセルを転送します。
   4. 標準条件 (5% CO₂、湿度 95% の空気、37 ° C) の下で細胞を養う
2. 分割
   1. 顕微鏡で細胞の状態を確認します。セルが 80-90% の合流は、以下手順を実行を通じて 1.2.10 1.2.2 セルを分割します。
   2. 滅菌ピペットで細胞の培養メディアを吸い出しなさい。
   3. 4 mL のダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で一度セルを洗浄し、吸引、DPBS。
   4. セル開始; をデタッチするまで、3 分の 37 ° C で培養する前にセルに 1 mL のトリプシン/EDTA 溶液 (TE) を追加します。顕微鏡下で剥離を確認します。
   5. 2 ml の培養液中の細胞を再懸濁し、5 分の 200 x g で細胞を遠心分離します。上清を吸引し、培地 3 mL で再び細胞ペレットを再懸濁します。
   6. トリパン ブルー色素排除試金を使用して、細胞の生存を確認します。細胞懸濁液の 30 μ l をとり、トリパン ブルー チューブでの 0.4% 溶液 30 μ l を追加します。その後、3-5 回は 100 μ l ピペットを使用して、ソリューションを効果的にミックスします。ソリューションの 10 μ l をとり、検定の coverslip の下に置きます。
   7. 検定の分野で実行可能なセルの合計数と死細胞数の両方を (青) カウントします。計算式を使用して細胞生存率 [%]: 細胞生存率 = 100-(100/総細胞数 x の死んだ細胞の数)
   8. 新しい細胞培養 T25 フラスコまたは 6 ウェル プレートに再懸濁細胞ペレットの因数を転送します。T25 フラスコ内で培地 5 mL または 6 ウェル プレートの各ウェルに 1 mL の合計を達成するために細胞に培地を追加します。
   9. 標準条件 (5% CO₂、湿度 95% の空気、37 ° C) の下でインキュベーターで細胞を養う
   10. 細胞が完全に合流されたら、彼らは実験のため準備ができています。

2. 気密室の準備

注: の気密室の工事計画図 1.に描かれています。

1. 6.5 L の容量を持つ気密ポリプロピレン ボックスを使用します。長さ、幅、および高さが 30 x 20 x 15.5 cm、それぞれです。角が丸いためボックスのボリューム、理論量よりも低いのでご了承ください。
2. 横方向の壁の下側に 2.5 cm の直径の穴をドリルします。
3. 緑のマーク、ガス空気混合物の入力パイプとして機能し、シリコン シールとコルゲート チューブを挿入します。
4. 反対側壁の上にある目の 2.5 cm 径の穴をドリルします。
5. 赤いマークが別のコルゲート チューブを挿入し、ガス空気混合物の出力管として使用し、シリコン シール、木炭のフィルターで接続します。
6. ボックスの平均の壁の中央にタイトな 4 mm 径の穴をドリルします。
7. 回転男性ルアーロック、ガス分析計に接続されますと、シリコン シールとマニホールドに接続されている短い点滴チューブを挿入します。
8. 気密室内デジタル温度計/湿度計を配置します。

3. ハロゲン化剤 (セボフルランとイソフルラン) に肺胞上皮細胞を公開します。

メモ: デバイスの略図図 2.で描かれています。

注意: 動物の研究が胎児への害や障害不妊治療の証拠は認められなかった、帝王の中に非常に小規模な研究は母親あるいは胎児に任意の厄介な効果を示さなかったが、使用の安全性ハロゲン化剤 (例えば、セボフルランやイソフルラン) 分娩が日付に示されていません。さらに、人間妊娠中に制御データを収集しません。そのため、妊娠中は強く落胆する必要があります一方、セボフルランやイソフルランを用いた実験を実行しています。

1. 研究室のレンジフードの下で働きます。
2. 二酸化炭素 (CO₂) による亜酸化窒素のガス管線を切り替える麻酔器回路をカスタマイズします。
3. グリーン マーク、コルゲート管の気密室をカスタマイズされた麻酔器回路に差し込みます。麻酔器とおよそ 37 ° C に流れ混合ガスを暖めるための気密室の間のパイプに温水加湿器 (ICU の人工呼吸器の使用など) を挿入します。
4. 暖房を提供するホット プレート上の気密室をインストール プレート温度 37 ° C
5. 置くの気密に hAELVI 細胞チャンバーし、蓋をシール 6、よくプレートを含みます。
6. CO₂の 5% と 95% 加湿空気の定義された、標準的な条件をすぐに取得する (すなわち空気と CO₂の混合物) ガス流量を調節します。
7. ハロゲン化剤の蒸発器を開き、必要な割合を選択 (本研究では、テスト セボフルランとイソフルランの濃度 4% と 1% それぞれ)。
8. 画面に外部ガス分析装置による測定と表示されているガスの混合物およびセボフルランやイソフルラン濃度の構成に注意してください。
9. 目標値が達成されれば、1 L/分に新鮮ガス流量を減らします。
10. 気密室は、実験のため必要な限りこのガス流量を維持できます。

4. セボフルランやイソフルラン クロマトグラフィーを測定します。

1. 試料の調製
   1. 異なる時点で非常に簡単に開く研究サンプルを出す商工会議所 (現在の研究では、我々 使用 6 ウェル プレート) 蓋を閉じます。他のサンプルはそのままに。その後、マルチ ボリュームの調節可能なマイクロ ピペットで各サンプルに含まれている培地 1 mL を吸引します。
   2. 媒体をテフロン シール キャップで密閉タイトなねじ込みすべき 10 mL ヘッド スペース クロマトグラフィー バイアルに入れ。あなたはすぐにそれらを使わない場合は、-20 ° C でクロマトグラフィー バイアルをフリーズします。
   3. 原液セボフルランとイソフルランの別の原液メタノール 50 g/L の両方を準備します。同時に、2 g/l メタノール クロロホルム (内部標準、IS) の原液を準備します。-20 ° C ですべての標準溶液を保存します。
   4. セボフルランとイソフルラン吸入 50、500、5000 mg/L 超純水水/ジメチル sulfoxyde での作業ソリューションを準備 (50/50; v/v)。社内標準化の作業ソリューションはメタノールで 100 mg/L で固定されます。
2. 細胞試料の分析
   注: 抽出プロシージャはガス ・ クロマトグラフィーと質量ボルドーらから以前に検証済みのメソッドに基づいてください。¹感性と特異性の同じパラメーターを使用します。セボフルランおよびクロロホルム (IS) がこのプロトコルで使用されていた、イソフルランは多重解析手法に関連付けられていた。簡単に言えば、質量獲得のため純粋なソリューション注射後メソッドが開発されました。その後、m/z は参照基準と文献データを確認しました。3 m/z は (IS) を除く各検体に選ばれた: 定量化 (最も豊富なおよびより高い)、豊かさが定量化, 曲線下の領域を統合することにより求めた 1 m/z と確認のため 2 m/z。3 m/z を使用すると、検体が特定すべて m/z 同じの保持時間があったのでと同様、全額 m/z (イオンの確認と定量化の相対的な) 純粋な規格で、すべてのサンプルで同じであったので。この買収のモードでは、検体識別でき, 特異性の定量化します。
   1. 0.5 400 の濃度範囲で検 8 ポイントを構築 mg/L と複数品質コントロール (0.5、1、5、10、20、75、200、および 400 mg/L)。
      メモ: 各校正を検証するため、4 つの品質コントロールに用い: 定量の下限 (C1 = 0.5 mg/L)、2 つの中間レベル (C2 = 20 mg/L と C3 = 75 mg/L) および最終的なレベル (400 mg/L で C4; 数量の上位レベル)。行列を避けるために培養細胞マトリックスのすべての基準とコントロールを行った各検量線の培養細胞と内部標準との干渉がなかったことを検証するため空白の行列を行った。
   2. 原液セボフルランとイソフルランの別の原液メタノール 50 g/L の両方を準備します。同時に、2 g/l メタノール クロロホルム (内部標準、IS) の原液を準備します。-20 ° C ですべての標準溶液を保存します。その後、50、500、5000 mg/L の純水で混合セボフルラン/イソフルランの作業ソリューションを準備/ジメチル sulfoxyde (50/50; v/v)。実用的なソリューションが 100 mg/L メタノールで希釈しました。
   3. 較正曲線とコントロール細胞試料 1 mL には (100 mg/L) の 50 μ L スパイキングによるサンプルを準備します。
   4. 飽和塩化ナトリウム水溶液 10 mL ヘッド チューブ、テフロン シール キャップで密閉タイトなねじ込みの 200 μ L を試料溶液を準備します。
3. ガス ・ クロマトグラフィーと質量分析法
   1. サンプル分析、ガス ・ クロマトグラフィー、質量検出法と相まってのヘッド スペース注射を使用します。
   2. ヒーター シェーカー 80 ° C で 10 分間のヘッド チューブを運ぶ。撤回し、ガスクロマト グラフにガス試料 1.5 mL を注入します。クロマトグラフィーの実行の開始時に 100 mL/分 2 分間でスプリット流れ 260 ° C でインジェクターのパラメーターを設定します。
   3. キャリア モードに設定されている圧をスプリット/スプリットレス注入器を使用します。最初、0.15 分 40 kPa でガス圧を保持します。その後、5 分の 300 kPa の圧力に 16 kPa/分の速度を設定する前に 125 kPa/分で 150 kpa 率プログラム圧を上げてください。
   4. 同時注入には 60 ° C、1 分および増加のオーブンの温度 140 ° C の温度が 20 ° C/分の速度に達するまでが始まります。その後、250 ° C を達成するまで温度が再び上昇します。実行の合計時間は 7 分です。
   5. 溶融シリカ毛細管カラム (30 m × 1.4 μ m、0.25 mm ID) を利用したクロマトグラフィー分離を行います。単一イオン監視 (SIM) の状態で大量の実験を実行し、115 と 87 (イオン イオン定量 m z 181、およびイオン資格 m/z 151 と 51 m/z 149 セボフルランの 2.30 分の保持時間 (RT) で同時に (イオン定量) m/z を監視資格) RT 2.8 min, と RT 3.70 分でクロロホルム 83 (イオン定量) の m を z にイソフルランの。
   6. 重量二次フィットを使用してはの面積比によって細胞培養におけるイソフルランとセボフルランの濃度を決定します。セボフルランとイソフルランの定量化 (LLOQ) の下限は 0.5 mg/L と定量化 (ULOQ) の上限は 400 mg/L でした。

結果

セボフルランとイソフルランは、時間の経過と共に媒体に溶解、濃度は表 1と表 2にそれぞれ報告しました。

媒体におけるセボフルランとイソフルラン吸入濃度のコースは時間をかけて同様であった。ハロゲン化剤の必要な濃度が設定された直後後は、最初の 1 時間濃度が上昇しました。高原はハ...

ディスカッション

提案プロトコルでは、セボフルランやイソフルランなどのハロゲン化麻酔薬の正確な割合に細胞を公開する簡単な方法について説明します。さらに、我々 はここで報告-初めて-セボフルランとイソフルラン吸入自体培養液中の濃度とガス留分の厳密な相関。この基本的なステップは今、私たち人間の肺胞上皮細胞の培養単分子膜ハロゲン化剤の効果を研究する私たちの気密室を安全に使用す?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sevoflurane	Baxter		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane	Virbac		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells	InScreenex	INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use)	InScreenex	INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit	Drager	Fabius
Gas analyzer	Drageer	Vamos Plus
Anesthetic gas filter	SedanaMedical	FlurAbsord
Heated Humifier	Fisher&Paykel	MR850
Chamber	Curver	00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection	Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA	Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID)	Restek, Lisses, France	Rxi-624Sil MS