小鼠 mptp 诱导的帕金森病模型中自发性运动的行为评估

摘要

我们描述了使用 mptp 建立帕金森病小鼠模型, 以及使用圆筒和开放场测试测量运动功能的行为评估。然后, 我们使用 l-dopa 作为一个例子, 说明如何将这个模型应用于 pd 药物的研究。

摘要

帕金森病 (pd) 是一种常见的神经退行性疾病, 引起晃动、僵硬、运动缓慢和痴呆的现象。1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶 (mptp) 可以通过破坏大脑黑质中的多巴胺能神经元导致一些帕金森病样症状。因此, 它被用于在各种动物研究中建立 pd 模型。在这里, 小鼠接受7天的 mptp 注射 (20 mgsg"), 并在第八天进行行为测试。该模型在 pd 研究中得到了有效的适应。这里的行为测试包括气缸测试和开放场测试。气缸实验是用来检测动物的能力, 以提高他们的前爪, 当投入到不同的环境。当 pd 模型小鼠显示拱形--小鼠拱起它的背部--时, 爪子的增加次数就会减少。此测试易于执行。开放场测试用于检测老鼠在跑步、行走和保持不动上的时间。我们使用软件分析动物在野外的运动, 并获得数据。最后, 我们使用 l-dopa, 最常用的 pd 药物之一, 作为一个例子, 说明如何应用该模型的 pd 药物的研究。我们的研究结果表明, mptp 神经毒性会诱发运动缺陷, 而 l-dopa 可以缓解这种情况。

引言

帕金森病 (pd) 是老年人中最常见的疾病之一, 是一种长期的神经退行性疾病¹_.患者总是表现出随着时间的推移而恶化的晃动、僵硬、运动缓慢和痴呆的现象^.其他症状, 包括感官、睡眠和情绪问题也被观察到²。pd 的原因尚不清楚, 但一般认为它既涉及遗传因素, 也涉及环境因素, 这些因素导致黑质3中多巴胺能神经元的丢失, 以及黑质中莱维体和莱维神经元的发育。大脑⁴_.

在 pd 的研究中, 1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氢吡啶 (mptp)⁵在实验模型中被广泛用于再现一些 pd 症状。1984年, langston等人首次发现, 在松鼠猴身上注射 mptp 导致帕金森病.尽管 mptp 啮齿类动物模型没有显示 lewy 体的存在, 这是 pd 的生物标志物, 但 mptp 通过破坏大脑黑质7中的多巴胺能神经元而引起帕金森病样症状.与其他 pd 药物模型 (如 6-羟基多巴胺 (6-ohda)⁸和 1-甲基-4-苯基吡啶 (mpp +)⁹诱导的药物模型相比, mptp 注射操作容易, mptp 模型所需时间更短。小鼠接受7天的 mptp 注射 (20-30 mgggg"天), 并在第八天^{第10日进行}行为测试。

公开场试验¹ 1 首次由美国^{1 2号}的卡尔文 s. 霍尔开发。在各种研究中, 对不同类型的行为进行了测试。在以帕金森病为重点的研究中, 对运动活动和运动速度等行为进行了测试, 以确定动物的移动能力是否受到影响。与其他用于测试 pd 动物建立的方法相比, 开放现场测试很容易进行, 因为所需的设备简单, 原型和数据分析软件 (如matlab、excel) 可以很容易地收集和绘制数据。另外, 变异系数相对较小, 为 1^3,这意味着露天试验的结果是可靠的。与其他方法相比, 另一个优点是本实验中包含的行为易于区分;老鼠可以是跑的, 也可以是站着的。通常, 当研究人员需要评估研究对象的流动性时, 开放场测试可以用于老鼠。

气缸试验也被称为不对称使用前肢的试验。在首次设计该测试时, 它被用来测试老鼠前肢¹⁴的不对称使用。在这里, 我们用这个测试来分析动物的能力, 伸展和使用它的两个前肢探索新的环境。当黑质和纹状体在大脑中被 mptp 破坏时, 动物往往会弓起背部, 更不可能伸展和探索未知的环境。此测试易于执行, 并能给出初步结果。然而, 这种测试具有很高的内部变异性, 所以它通常与其他行为实验一起使用。

以 l-dopa (也称为左旋多巴或 l-3, 000-二羟基苯基丙氨酸) 为治疗帕金森病的常用方法, 因为 pd 的一个原因是多巴胺的减少。l-dopa 是多巴胺的前体。但与多巴胺不同的是, 它可以跨越血脑屏障, 这意味着它将更有效地增加大脑区域的多巴胺浓度。通过血脑屏障后, l-dopa 被 l-氨基酸脱羧酶¹⁵转化为多巴胺。

本文介绍了利用圆筒试验¹⁴和改进的开放场试验对 mptp 诱导 pd 模型小鼠运动功能的测量和分析。我们以 l-dopa 为例, 说明了如何将该模型应用于 pd 药物的研究。我们的研究结果表明, mptp 会导致电机赤字, 可以通过 l-dopa 来缓解。

研究方案

这项研究是根据考虑动物实验的国际、国家和机构规则进行的。研究方案得到了南开大学动物伦理委员会的批准。

1. mptp 和 l-dopa 管理

注: 中国科学院动物学研究所提供了为期10周的雌性 balb1 小鼠。在12小时的光/暗周期 (在08岁至20:00 亮起)、21-22°c 的恒温和55% ±5% 的相对湿度下, 每个笼子容纳了6个小鼠。对所有动物给予同一配方的高压灭菌标准小鼠和水 。

1. 经过一周的适应, 将这些动物分成三组, 每组6只老鼠。
2. 第1组,从第1天至第7天进行250μlmusese·day 的腹腔注射 (见步骤 1.5), 然后在第8天进行250μl·鼠的胃内注射 (见步骤 1.6)。
3. 对第2组, 从第1天到第7天每天进行 20 mggg"mpp 的腹腔注射, 然后在第8天对盐水的 250μl-小鼠进行胃内给药。
4. 对第3组, 从第1天至第7天进行腹膜注射 20 mggg"mgg" 的 mggg", 然后在第8天进行 5 mg kg 的胃内注射。
5. 按如下方式进行腹腔内注射。
   1. 用 26 g 针将药物装入无菌的1毫升注射器中。消除注射器中的空气。
   2. 用它的腹部朝上擦洗老鼠。保持鼠标的头部、颈部和身体保持直线, 并固定头部。
   3. 将针头倾斜以穿透腹膜。将针头推至适当的距离, 直到几乎没有阻力, 然后注射药物。顺利地拔掉针头。
6. 进行胃内给药, 如下所示。
   1. 用耳喷针在无菌的1毫升注射器中准备药物。消除注射器中的空气。
   2. 把老鼠的腹部朝上抱起来。保持鼠标的头部、颈部和身体在一条直线上, 保持头部固定。
   3. 保持针头与鼠标的主体平行, 并将其从鼠标的嘴角插入, 按下舌头, 并向内推到上颌。
   4. 阻力小, 这表明针头正在顺利进入食道, 小心地将针头推到适当的距离。在针尖到达胸部底部之前, 注射药物。
   5. 顺利地拔掉针头。

2. 气缸试验

注: 行为测试是在第8天进行的。在行为测试前 40分钟, l-dopa 被注射到第三组小鼠体内。如果行为测试不是在动物所在的同一个房间里进行的, 那么在测试前, 动物需要适应新的房间30-60。

1. 在最后一次服用 mptp 后24小时进行测试。
2. 将透明玻璃圆筒 (高度 = 19.5 厘米, 直径 = 15 厘米, 重量≥1公斤) 放置在桌子的中心。用黑色纸板将气缸三面环绕, 以减少环境照明的效果。将气缸的一侧放在相机的一侧进行视频录制。
   注: 纸板和圆筒之间的距离应在4至8厘米左右。
3. 在距离气缸约40-60 厘米的地方安装相机 (> 100万像素分辨率), 以确保整个气缸可见。
   注: 这既不是太近, 也不是太远, 以不打扰鼠标, 而记录其运动的视频。
4. 一次将一只鼠标放入圆柱体中, 然后立即开始拍摄。3分钟后停止拍摄。
   注: 在此过程中, 请尽量避免噪音或光线变化, 以避免影响鼠标的行为。
5. 测试后, 将鼠标放回家庭笼子。
6. 用水清洗钢瓶, 然后在内壁上喷洒70% 的乙醇, 对其进行消毒, 去除小鼠气味。在另一个鼠标放入之前, 请将钢瓶擦干。
7. 以正常速度的0.5倍播放视频, 并在每只鼠标的墙壁上数出爪子举的数量。
   注: 当老鼠在后肢上抬起时, 就会发生爪子提升, 将前肢提高到肩部水平以上, 并将其抬起。一个前肢电梯不计算在内。通常情况下, 鼠标提高其前肢触摸气缸壁。如果鼠标在没有着陆的情况下连续多次将前肢提高到肩部水平以上, 则应只计算为一次。

3. 开放现场测试

1. 在 mptp 给药24小时后进行开放现场测试。
   注: 可在气缸试验的同时进行。
2. 准备一个透明的开放场反应箱 (45 厘米长 x 45 厘米 w x 25 厘米 h), 底部用黑色布覆盖一个木板。将相机 (> 100万像素分辨率) 固定在1米的高度上。
   注: 打开字段框底部的颜色应不同于测试的鼠标颜色, 以确保视频中的颜色对比度。
3. 调整相机, 确保打开的场反应框正好位于视频的中心。
4. 将一个测试鼠标放入框中, 让鼠标熟悉环境约1分钟。
5. 使用连接到计算机的摄像机录制5分钟的视频。
6. 使用软件工具 (如matlab) 分析视频, 以获得运动轨迹图、静态 (速度和 lt;1 厘米) 的分布、行走 (速度1-20 厘米) 和运行 (速度和 gt;20 厘米) 时间、总行驶距离和平均值每个测试鼠标的速度。
   注: 分析视频时, 我们会跟踪鼠标的整个正文。物体的平均速度是指所覆盖的路径的总长度, 除以经过的时间。因此, 如果鼠标不移动, 其瞬时速度将被视为零。
7. 清理开放场反应箱中的粪便。在盒子上喷洒70% 的乙醇并擦拭。

结果

在圆筒试验中, 在第1天至第7天用 mptp 处理的小鼠 (第2组) 和第8天用盐水处理的小鼠 (第1组) 中观察到, 与受过盐水处理的小鼠 (第1组) 相比, 在使用 mp 处理的小鼠 (第3组) 中观察到了更多的环 (第3组)从第1天到第7天和第8天 l-dopa 与第1天至第7天用 mptp 处理的小鼠 (第2组) 和第8天用盐水治疗的小鼠 (第2组) 进行比较 (图 1)。

讨论

由于大脑黑质中多巴胺能神经元的破坏, mptp 在小鼠⁷中引起类似帕金森症的症状。l-dopa 是自临床使用以来最受欢迎的 pd 药物, 因为它有助于维持 pd 患者的正常日常活动, 有效抑制运动异常, 包括亚术和僵硬¹⁵。用 mptp 治疗的小鼠在圆筒试验和开放场试验等行为测试中表现出损伤, 可用于 mptp 模型的研究。气缸试验和露天试验通常用于测量自发作用。在这里, 我们?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Ruiboxing Company	RBX-64175
Camera	BASLER	acA645-100gm
Cylinder test	Made in-house at Nankai University	N/A
Excel	Microsoft	N/A
Levodopa	Sigma-Aldrich	72816
Matalb 2017a	Mathworks	N/A
Mice	Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences	Balb/c	Adult female mice(10 weeks)
MPTP	Yuanye Biological Technology Company Ltd., Shanghai	S31504-500mg
Open field test	Made in-house at Nankai University	N/A
Syringe	Solelybio	S-xsgwz-w	Irrigation
Syringe	Jiangxi Fenglin Medical Application Co.	hc3824	Intraperitoneal injection