Поведенческие оценки спонтанного передвижения в модели мышиных MPTP-индуцированной болезни Паркинсона

Резюме

Мы опишем создание мышиных модели для болезни Паркинсона с помощью MPTP и поведенческие оценки с использованием цилиндра и открытом поле тесты для измерения моторную функцию. Затем мы используем l-допы как один из примеров показать, как применить эту модель в изучении PD наркотиков.

Аннотация

Болезнь Паркинсона (PD) является распространенным заболеванием нейродегенеративных расстройства, вызывая явление встряхивания, жесткость, медлительность движения и слабоумие. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) может привести к некоторым Паркинсона-подобные симптомы, уничтожив дофаминергических нейронов в Substantia головного мозга. Он таким образом использовался для создания модели PD в различных исследованиях на животных. Здесь, мышей получать инъекции MPTP (20 мг/кг/день) за семь дней и поведенческие тесты выполняются на восьмой день. Эта модель эффективно адаптирована в исследовании PD. Поведенческие тесты здесь включают цилиндра и открытом поле теста. Цилиндр эксперимент используется для обнаружения животных возможность поднять их передние лапы, когда положить в другую среду. Как PD модели мышей показывают, выгибая — мышь арки его обратно — количество сокращение отгрузок лапы. Этот тест легко выполнить. Открытое поле тест используется для обнаружения количество мышей тратить время на бег, ходьба и оставаясь неподвижным. Мы анализируем движений животных в открытом поле, с помощью программного обеспечения и получения данных. Наконец мы используем также l-ДОФА, один из наиболее часто используемые PD наркотиков, как один пример, чтобы показать, как применить эту модель к изучению PD наркотиков. Наши результаты показывают, что нейротоксичность MPTP индуцирует мотор дефицита, которые могут быть компенсированы l-допы.

Введение

Болезнь Паркинсона (PD), один из самых распространенных заболеваний среди людей старшего возраста, является долгосрочной нейродегенеративных расстройств¹_. Пациенты всегда показывают явление встряхивания, жесткость, медлительность движения и слабоумие, ухудшить течение времени². Другие симптомы, включая чувств, сна и эмоциональные проблемы также часто наблюдаются². Причиной PD до сих пор неизвестно, но считается включать генетические и экологические факторы, которые вызывают потерю дофаминергических нейронов в substantia nigra³и развития органов Леви и невритов Леви в различных регионах мозг⁴_.

Среди исследований PD 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)⁵ широко адаптирована в воссоздании некоторых PD симптомы в экспериментальных моделях. В 1984 году Лангстон et al. впервые обнаружил, что инъекции MPTP белка обезьян привели к паркинсонизм⁶. Хотя модель MPTP грызунов не показывают наличие органов Леви, который является биомаркером присутствия PD, MPTP вызывает Паркинсона-подобные симптомы, уничтожив дофаминергических нейронов в Substantia мозг⁷. По сравнению с другими наркотиками модель для PD таких вызванных 6-hydroxydopamine (6-OHDA)⁸ и 1-метил-4-phenylpyridinium (MPP +)⁹, инъекции MPTP легко выполнить и MPTP модель занимает меньше времени. Мышей получать инъекции MPTP (20-30 мг/кг/день) за семь дней и поведенческие тесты выполняются на восьмой день¹⁰.

Открытое поле тест¹¹ была впервые разработана Calvin S. зал, американский¹². В различных исследованиях тестируются различные виды поведения. В исследованиях, которая фокусируется на болезни Паркинсона поведения как деятельности локомоции и скорость передвижения проверяются, чтобы увидеть, если затронуты животного способность двигаться. По сравнению с другими методами, используемые для тестирования создания PD животных, открытое поле тест легко осуществить, потому что необходимое оборудование является простым, и прототипирование и данных анализа программного обеспечения (например, MATLAB, Excel) может использоваться для легко собирать и график данных. Кроме того коэффициент вариации является относительно небольшой¹³, это означает, что результат теста открытом поле является надежным. Еще одно преимущество над другими методами является то, что поведение, включенные в этом эксперименте легко отличить; мышей может быть либо бег, ходьба, или стоя на месте. Обычно тест открытое поле может использоваться на грызунов, когда исследователь необходимо оценить тему мобильности.

Цилиндр тест также называется тест асимметричной использования передних конечностей. Когда этот тест был впервые разработан, он использовался для тестирования асимметричных использование крыса Передние конечности¹⁴. Здесь мы используем этот тест для анализа животного способность растянуть и использовать оба его передние конечности, чтобы исследовать новые окрестности. Когда substantia nigra и полосатое повреждены MPTP в головном мозге, животное стремится арки его обратно и становится меньше шансов растянуть и исследовать неизвестные окружающей среды. Этот тест легко выполнить и может дать предварительный результат. Однако этот тест обладает высокой внутренней изменчивости, поэтому он обычно используется с вместе с другими поведение экспериментов.

Принимая l-допа, который также известен как леводопы или L-3,4-Диоксифенилаланин, является распространенным способом для лечения болезни Паркинсона, поскольку одной из причин PD является уменьшение допамина в. L-допы является предшественником дофамина. Но в отличие от допамина, он может пересечь гематоэнцефалический барьер, который означает, что она будет более эффективной в повышении концентрации допамина в мозге области. После того, как она пересекает blood - brain барьер, l-допы преобразуется в допамина L-аминокислот кислоты Декарбоксилаза¹⁵.

Здесь мы описываем, измерение и анализ двигательной функции MPTP-индуцированной PD модели мышей с использованием цилиндра тест¹⁴ и измененные открытом поле теста. Мы управляем l-допы как один пример, чтобы показать, как применить эту модель в изучении PD наркотиков. Наши результаты показывают, что MPTP индуцирует мотор дефицита, которые могут быть компенсированы l-допы.

протокол

Это исследование было проведено по данным международных, национальных и институциональных норм, учитывая экспериментов на животных. Протокол исследования был одобрен Комитетом животных этики Нанкай университета.

1. MPTP и l-допы администрация

Примечание: Институт зоологии, Китайской академии наук были предоставлены 10 недельных самок мышей BALB/c. Мышей были размещены шесть в клетке под свет/темно цикла 12 h (огни на 08:00-20:00), постоянная температура 21-22 ° C и относительной влажности 55% ± 5%. Газобетона стандартных мышей Чоу же разработки и воды ad libitum было уделено всех животных.

1. После одной недели акклиматизации делят на три группы шести мышей животных.
2. Группа 1, администрировать внутрибрюшинной инъекции (см. шаг 1.5) 250 мкл/мыши/день физиологического раствора от 1 дня до 7 день, а затем выполнить внутрижелудочного администрирования (см. шаг 1.6) 250 мкл/мыши физиологического раствора на 8 день.
3. Группа 2, администрировать внутрибрюшинной инъекции 20 мг/кг/день MPTP каждый день от 1 дня до 7 день, а затем выполнить внутрижелудочного отправления 250 мкл/мыши физиологического раствора на 8 день.
4. Группа 3, администрировать внутрибрюшинной инъекции 20 мг/кг/день MPTP от 1 дня до 7 день, а затем выполнить внутрижелудочного отправления 5 мг/кг l-допы на 8 день.
5. Выполняйте внутрибрюшинной инъекции.
   1. Загрузите препарата в 1 мл стерильного шприца с иглой 26 G. Ликвидировать воздуха из шприца.
   2. Загривок мыши с его живота вверх. Держите головы, шеи и тела мыши в прямой линии также с руководителем фиксированной.
   3. Угол иглы прорезывают брюшины. Нажмите иглы для надлежащего расстояния до тех пор, пока существует незначительное сопротивление и затем вводить препарат. Вытащите иглу гладко.
6. Выполняйте внутрижелудочного администрации.
   1. Подготовьте препарата в 1 мл стерильного шприца с иглой Оральный затравки. Ликвидировать воздуха из шприца.
   2. Удерживайте кнопку мыши, с его живота вверх. Держите головы, шеи и тела мыши в прямой линии с главой фиксированной.
   3. Держите иглы параллельно телу мыши и вставить его из угла рта мыши, нажатия язык и толкая внутрь против верхней челюсти.
   4. С мало сопротивления, который показывает игла входит пищевода плавно, аккуратно протолкните иглу в надлежащее расстояние. До того, как кончик иглы достигает нижней части груди, вводить лекарство.
   5. Вытащите иглу гладко.

2. цилиндр тест

Примечание: Поведенческие тесты проводились на 8 день. L-допы вводили к третьей группе мышей 40 мин перед поведенческие тесты. Если поведенческое тестирование выполняется не в той же комнате, где размещаются животных, животных необходимо приспособиться к новой комнате за 30-60 мин до теста.

1. Выполните тест 24 ч после введения последней дозы MPTP.
2. Поместите цилиндр прозрачного стекла (высота = 19,5 см, диаметр = 15 см, вес ≥1 кг) в центре стола. Окружают цилиндр с трех сторон с черного картона, чтобы уменьшить эффект освещения окружающей среды. Оставьте одну сторону цилиндра, стоящих перед камерой для записи видео.
   Примечание: Расстояние между картоном и цилиндра должно быть около 4-8 см.
3. Прикрепить камеру (> 1 миллион пикселей) на ~ 40-60 см от цилиндра для обеспечения полного баллона является видимым.
   Примечание: Это не слишком близко, не слишком далеко с тем, чтобы не беспокоить мыши во время записи видео его движения.
4. Место один мышь в цилиндр, в то время и начать съемки сразу. Остановите съемки через 3 мин.
   Примечание: В ходе этого процесса, старайтесь избегать шума или легкие изменения в порядке избежать влияния на поведение мыши.
5. Поместите курсор мыши обратно в дом клетку после тестирования.
6. Очистить баллон с водой, а затем спрей 70% v/v этанола на внутренней стене он дезинфицировать и удалить мыши ароматов. Протрите цилиндр сухой, прежде чем другой мыши помещается в.
7. Воспроизводить видео со скоростью 0,5 x регулярных скорость и количество подъемников лапу на стену каждой мыши.
   Примечание: Лапы, подъемники возникают, когда мышь поднимает вверх на его гомотерия, поднимает обе передние конечности выше уровня плеча и земли. Один Лифт передних конечностей не учитываются. Как правило мыши вызывает его передние конечности прикоснуться к стенкам цилиндра. Если мышь вызывает его передние конечности выше уровня плеча несколько раз непрерывно без посадки, он должен считаться только раз.

3. открытые поля тест

1. Выполните тест открытое поле 24 ч после дозирования MPTP.
   Примечание: Это может осуществляться в то же время теста цилиндра.
2. Подготовка прозрачной открытые поля реакции (45 см L x 45 см Ш x 25 см H) с крышкой деревянную пластину в нижней черной тканью. Исправить камеру (> 1 миллион пикселей резолюции) над полем на высоте 1 м.
   Примечание: Цвет открытом поле поле внизу должна отличаться от протестированных мыши цвет для обеспечения цветовой контраст в видео.
3. Настройте камеру, чтобы убедиться, что открытые поля реакции находится прямо в центре видео.
4. Поставьте один тест мыши в поле и пусть мыши ознакомить себя с окружающей средой для около 1 мин.
5. Запись видео 5 минут с помощью камеры, подключенные к компьютеру.
6. Анализ видео, с помощью программных средств (например, MATLAB) для получения трассировки рисунок движения, распределение статических (скорость < 1 см/с), пешком (скорость 1-20 см/s) и работает (скорость > 20 см/сек) время, Общая путешествовал расстояние и средний скорость каждого испытания мыши.
   Примечание: При анализе видео, мы отслеживаем все тело мыши. Средняя скорость тела означает, Общая длина пути покрыно, деленное на общее затраченное время. Поэтому если мышь не движется, ее мгновенной скорости будет рассматриваться как ноль.
7. Очистите все фекалии в открытом поле реакции. Спрей на 70% спирте на поле и протрите его.

Результаты

В тесте, цилиндр наблюдалось снижение тылы против стены в мышах (Группа 2) лечили MPTP от 1 дня до дня 7 и засоленных на 8-й день по сравнению с соленой лечение мышей (Группа 1), в то время как в мышей (Группа 3) относились с MP было отмечено увеличение числа тылы ТП от 1 до 7 день дн?...

Обсуждение

Из-за разрушения дофаминергических нейронов в Substantia мозга MPTP вызывает симптомы Паркинсона-как в⁷мышей. L-допы является наиболее предпочтительным препарат для PD с тех пор его клинического применения, потому что он помогает в поддержании нормальной повседневной деятельност...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Ruiboxing Company	RBX-64175
Camera	BASLER	acA645-100gm
Cylinder test	Made in-house at Nankai University	N/A
Excel	Microsoft	N/A
Levodopa	Sigma-Aldrich	72816
Matalb 2017a	Mathworks	N/A
Mice	Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences	Balb/c	Adult female mice(10 weeks)
MPTP	Yuanye Biological Technology Company Ltd., Shanghai	S31504-500mg
Open field test	Made in-house at Nankai University	N/A
Syringe	Solelybio	S-xsgwz-w	Irrigation
Syringe	Jiangxi Fenglin Medical Application Co.	hc3824	Intraperitoneal injection