Evaluación conductual de locomoción espontánea en un modelo murino MPTP-inducido la enfermedad de Parkinson

Resumen

Se describe el establecimiento de un modelo murino de la enfermedad de Parkinson con MPTP y evaluaciones conductuales usando el cilindro y abre campo de pruebas para medir función motora. Entonces utilizamos l-dopa como un ejemplo para mostrar cómo aplicar este modelo en el estudio de medicamentos PD.

Resumen

Enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad de desorden neurodegenerative común, causando el fenómeno de temblor, rigidez, lentitud de movimiento y la demencia. 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) puede conducir a algunos síntomas de la enfermedad de Parkinson-como por la destrucción de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra del cerebro. Se ha utilizado así para establecer modelos de PD en varios estudios con animales. Aquí, ratones reciben inyecciones de MPTP (20 mg/kg/día) durante siete días y las pruebas de comportamiento se realizan en el octavo día. Este modelo se adapta eficientemente en el estudio de la EP. Aquí las pruebas conductuales son el cilindro y la prueba de campo abierto. El experimento de cilindro se utiliza para detectar la capacidad de los animales para levantar sus patas delanteras cuando está puestos en un ambiente diferente. Como el PD modelo de ratones muestra arco — el ratón arquea su espalda, el número de disminución de levantamientos de la pata. Esta prueba es fácil de ejecutar. La prueba de campo abierto se utiliza para detectar la cantidad de tiempo los ratones a correr, caminar y permanecer inmóvil. Analizar movimientos de animales en campo abierto, utilizando el software y obtener información. Por último, utilizamos l-dopa, uno de los más utilizados medicamentos PD, como un ejemplo para mostrar cómo aplicar este modelo al estudio de medicamentos PD. Nuestros resultados indican que la neurotoxicidad MPTP induce un déficit motor que puede ser mitigado por l-dopa.

Introducción

La enfermedad de Parkinson (EP), una de las enfermedades más comunes entre las personas mayores, es un largo plazo neurodegenerativas trastorno¹_. Los pacientes siempre presentan el fenómeno de temblor, rigidez, lentitud de movimiento y la demencia que empeoran con el tiempo². Otros síntomas incluyendo sensoriales, problemas emocionales y sueño, también comúnmente se observan². La causa de la EP es todavía confusa, pero se cree generalmente que involucran factores genéticos y ambientales, que inducen la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra³y el desarrollo de los cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy en las distintas regiones de la cerebro⁴_.

Entre los estudios de la EP, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP)⁵ se adapta ampliamente en recrear algunos síntomas de la EP en modelos experimentales. En 1984, Langston et al encontraron primero que inyecciones de MPTP en monos ardilla dieron lugar en parkinsonismo⁶. Aunque el modelo de roedores de MPTP no muestra la presencia de cuerpos de Lewy, que es el biomarcador de la EP, MPTP causa síntomas parecidos a la enfermedad de Parkinson mediante la destrucción de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra del cerebro⁷. En comparación con otro modelo de droga para la EP como los inducidos por 6-hydroxydopamine (6-OHDA)⁸ y 1-metil-4-phenylpyridinium (MPP +)⁹, la inyección de MPTP es fácil de ejecutar y el modelo MPTP toma menos tiempo. Ratones reciben inyecciones de MPTP (20-30 mg/kg/día) para siete días y las pruebas de comportamiento se realizan en el octavo día¹⁰.

La prueba de campo abierto¹¹ primero fue desarrollado por Calvin S. Hall, un americano¹². En diversos estudios, se prueban diferentes tipos de comportamientos. En la investigación que se centra en las enfermedades de Parkinson, comportamientos como actividades de locomoción y la velocidad de locomoción son probados para ver si se ve afectada la capacidad del animal para moverse. En comparación con otros métodos utilizados para probar la creación de animales de PD, prueba de campo abierto es fácil de realizar porque el equipo necesario es simple y prototipos y datos software de análisis (por ejemplo, MATLAB, Excel) puede utilizarse para recopilar y ver fácilmente el datos. Además, el coeficiente de variación es relativamente pequeño¹³, que significa que el resultado de la prueba de campo abierto es confiable. Otra ventaja sobre otros métodos es que los comportamientos incluidos en este experimento son fáciles de distinguir; los ratones pueden ser correr, caminar o permanecer inmóvil. Generalmente la prueba de campo abierto se puede usar en roedores cuando el investigador necesita para evaluar la movilidad del sujeto.

La prueba del cilindro también se llama la prueba del uso asimétrico de los miembros anteriores. Cuando esta prueba se diseñó en primer lugar, fue utilizado para probar el uso asimétrico de patas delanteras^{14 la rata}. Aquí, utilizamos esta prueba para analizar la capacidad del animal para estirar y usar dos de sus miembros anteriores para explorar nuevos entornos. Cuando la sustancia nigra y el cuerpo estriado se dañan por MPTP en el cerebro, el animal tiende a arquear su espalda y se convierte en menos probable que se extienden y explorar el entorno desconocido. Esta prueba es fácil de ejecutar y puede dar un resultado preliminar. Sin embargo, esta prueba tiene alta variabilidad interna, por lo que se utiliza generalmente con junto con otros experimentos de comportamiento.

Tomar l-dopa, que es también conocido como levodopa o L-3, 4-dopa, es una manera común para tratar la enfermedad de Parkinson ya que una de las causas de la EP es la disminución de la dopamina en el. L-dopa es el precursor a la dopamina. Pero a diferencia de la dopamina, puede cruzar la barrera blood - brain, que significa que será más eficiente en el aumento de la concentración de dopamina en el área del cerebro. Después cruza la barrera blood - brain, l-dopa es convertida en dopamina por decarboxylase ácido l-amino¹⁵.

Aquí describimos la medición y el análisis de la función motora en ratones modelo de MPTP-inducido-PD utilizando un cilindro de prueba de¹⁴ y una prueba de campo abierto modificado. Administrar l-dopa como un ejemplo para mostrar cómo aplicar este modelo en el estudio de medicamentos PD. Nuestros resultados indican que la MPTP induce un déficit motor que puede ser mitigado por l-dopa.

Protocolo

Este estudio fue realizado según la normativa institucional, nacional e internacional considerando los experimentos con animales. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de ética animal de la Universidad de Nankai.

1. MPTP y l-dopa la administración

Nota: Ratones BALB/c hembras de 10 semanas de edad fueron proporcionados por el Instituto de Zoología de la Academia China de Ciencias. Ratones fueron alojados seis por jaula bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (se enciende a las 8:00-20:00), una temperatura constante de 21-22 ° C y una humedad relativa de 55% ± 5%. Chow de autoclave estándar ratones de la misma formulación y agua ad libitum fue dado a todos los animales.

1. Después de una semana de aclimatación, los animales se dividen en tres grupos de seis ratones cada uno.
2. A Grupo 1, administrar inyecciones intraperitoneales (ver paso 1.5) de 250 μl/ratón/día de solución salina desde el día 1 al día 7 y llevar a cabo la administración intragástrica (ver paso 1.6) de 250 μl/ratón de solución salina el día 8.
3. Grupo 2, administrar inyecciones intraperitoneales de 20 mg/kg/día de MPTP todos los días desde el día 1 al día 7 y llevar a cabo la administración intragástrica de 250 μl/ratón de solución salina el día 8.
4. Grupo 3, administrar inyecciones intraperitoneales de 20 mg/kg/día de MPTP desde el día 1 al día 7 y llevar a cabo la administración intragástrica de 5 mg/kg de l-dopa el día 8.
5. Realizar la inyección intraperitoneal como sigue.
   1. De carga el medicamento en una jeringa estéril de 1 mL con una aguja de 26 G. Eliminar el aire de la jeringa.
   2. Pescuezo del ratón con su vientre hacia arriba. Mantenga la cabeza, cuello y cuerpo del ratón en una línea recta y con la cabeza fijada.
   3. Ángulo de la aguja para penetrar el peritoneo. Empuje la aguja a una distancia apropiada hasta que haya poca resistencia y luego inyectar el fármaco. Saque la aguja con suavidad.
6. Realizar la administración intragástrica como sigue.
   1. Preparar la medicación en una jeringa estéril de 1 mL con una aguja de gavage oral. Eliminar el aire de la jeringa.
   2. Sujete el mouse con su vientre hacia arriba. Mantener la cabeza, cuello y cuerpo del ratón en una línea recta con la cabeza fijada.
   3. Mantener la aguja paralela al cuerpo del ratón e insertarla desde la esquina de la boca del ratón, presionando la lengüeta y empujando hacia adentro contra la mandíbula superior.
   4. Con poca resistencia, que muestra la aguja entra en el esófago sin problemas, con cuidado, empuje la aguja a una distancia adecuada. Antes de que la punta de la aguja alcance la parte inferior del pecho, inyectar el medicamento.
   5. Saque la aguja con suavidad.

2. prueba de cilindro

Nota: Las pruebas de comportamiento se realizaron el día 8. L-dopa se inyectó al tercer grupo de ratones 40 minutos antes de las pruebas de comportamiento. Si no se hace la prueba de comportamiento en la misma habitación donde se alojan los animales, los animales necesitan aclimatarse a la nueva sala para 30-60 min antes de la prueba.

1. Realizar la prueba de 24 h después de la última dosis de MPTP.
2. Coloque un cilindro de vidrio transparente (altura = 19,5 cm, diámetro = 15 cm, peso ≥1 kg) en el centro de una mesa. Rodean el cilindro en tres lados con cartulina negra para reducir el efecto de la iluminación ambiental. Dejar a un lado del cilindro hacia la cámara para grabación de vídeo.
   Nota: La distancia entre el cartón y el cilindro debe ser aproximadamente de 4 a 8 cm.
3. Conectar una cámara (> 1 millón-píxeles de resolución) en el 40-60 cm de distancia del cilindro para asegurar que el cilindro completo es visible.
   Nota: Esto es ni demasiado cerca ni demasiado lejos para no molestar el ratón durante la grabación del video de su movimiento.
4. Hacer un ratón en el cilindro a la vez y empezar a filmar a la vez. Deje de filmar después de 3 minutos.
   Nota: Durante este proceso, trate de evitar ruidos o cambios de luz en orden de evitar influir en el comportamiento del ratón.
5. Coloque el ratón en la jaula casera después de la prueba.
6. Limpie el cilindro con agua y luego rociar etanol al 70% v/v sobre la pared interna lo desinfecte y quitar olores de ratón. Seque el cilindro antes de coloca en otro ratón.
7. Reproducir el vídeo a una velocidad de 0,5 x la velocidad normal y cuente el número de ascensores de la pata contra la pared de cada ratón.
   Nota: Pata ascensores ocurren cuando el ratón se encabrita sobre sus miembros posteriores, eleva ambos miembros anteriores por encima del nivel del hombro y tierras. NO se cuenta una elevación de la extremidad delantera. Generalmente, un ratón levanta sus patas delanteras para tocar las paredes del cilindro. Si el ratón levanta sus patas delanteras sobre los hombros varias veces continuamente sin aterrizar, debe ser contado sólo como una vez.

3. Abra prueba

1. Realizar la prueba de campo abierto 24 h después de la dosificación de MPTP.
   Nota: Se puede llevar a cabo al mismo tiempo de la prueba de cilindro.
2. Preparar un cuadro de reacción campo abierto transparente (L de 45 cm x 45 cm ancho x 25 cm H) con una cubierta de placa de madera en la parte inferior de un paño negro. Fijar una cámara (> 1 millón-píxeles de resolución) sobre el campo a una altura de 1 m.
   Nota: El color de la parte inferior de la caja de campo abierto debe ser diferente del color ratón probado para contraste de color en el video.
3. Ajustar la cámara para asegurarse de que el cuadro de reacción campo abierto está justo en el centro del vídeo.
4. Una prueba del ratón en la caja y el ratón familiarizarse con el medio ambiente durante aproximadamente 1 minuto.
5. Grabar un vídeo de 5 minutos con la cámara conectada al ordenador.
6. Analizar el video utilizando herramientas de software (por ejemplo, MATLAB) para obtener el movimiento traza, la distribución de la estática (velocidad < 1 cm/s), caminando (velocidad 1-20 cm/s) y (velocidad > 20 cm/s) tiempo, total recorrida distancia y media velocidad de cada ratón probado.
   Nota: Al analizar el vídeo, hacemos un seguimiento de todo el cuerpo del ratón. La velocidad media de un cuerpo significa la longitud total del camino cubierto, dividido por el tiempo transcurrido. Por lo tanto, si un ratón no se mueve, su velocidad instantánea sería considerado como cero.
7. Limpie cualquier heces en el cuadro de reacción de campo abierto. Etanol al 70% del aerosol en la caja y limpie.

Resultados

En la prueba de cilindros, la disminución de traseros contra la pared se observó en ratones (Grupo 2) tratados con MPTP desde el día 1 al día 7 y salina el día 8 en comparación con los ratones tratados con solución salina (Grupo 1), mientras que se observó un aumento de traseros en los ratones (grupo 3) tratados con MP TP del día 1 al día 7 y l-dopa el día 8 en comparación con los ratones (Grupo 2) tratados con MPTP desde el día 1 al día 7 y salina el día 8 (

Discusión

Debido a la destrucción de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra del cerebro, MPTP causa síntomas parecidos a la enfermedad de Parkinson en ratones⁷. L-dopa es la droga preferida para la EP desde su uso clínico, ya que ayuda en el mantenimiento de las actividades diarias normales en pacientes con enfermedad de Parkinson, con la supresión eficaz de motor anormalidades incluyendo aquinesia y rigidez¹⁵. Los ratones tratan con MPTP mostró deficiencias en las p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Ruiboxing Company	RBX-64175
Camera	BASLER	acA645-100gm
Cylinder test	Made in-house at Nankai University	N/A
Excel	Microsoft	N/A
Levodopa	Sigma-Aldrich	72816
Matalb 2017a	Mathworks	N/A
Mice	Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences	Balb/c	Adult female mice(10 weeks)
MPTP	Yuanye Biological Technology Company Ltd., Shanghai	S31504-500mg
Open field test	Made in-house at Nankai University	N/A
Syringe	Solelybio	S-xsgwz-w	Irrigation
Syringe	Jiangxi Fenglin Medical Application Co.	hc3824	Intraperitoneal injection