הערכות התנהגותיות של גפיים ספונטנית במודל מאתר MPTP-induced מחלת פרקינסון

Summary

אנו מתארים הקמת מודל מאתר מחלת פרקינסון באמצעות MPTP, הערכות התנהגותיות באמצעות גליל ובדיקות שדה פתוח כדי למדוד המוטורית. ואז נשתמש בסדר גמור. בתור דוגמה אחת להראות כיצד ליישם את מודל זה במחקר של משטרת הסמים

Abstract

מחלת פרקינסון (PD) היא מחלה הפרעה ניווניות נפוצה, גורמת התופעה של טלטול, נוקשות, איטיות תנועה של דמנציה. 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) יכול להוביל כמה תסמינים כמו פרקינסון על ידי השמדת נוירונים דופאמין ב הסובסטנציה ניגרה של המוח. זה שימש ובכך ליצור מודלים PD במחקרים שנעשו בבעלי חיים שונים. . הנה, עכברים לקבל זריקות MPTP (20 מ"ג/ק"ג/יום) במשך תשעה ימים ותשעה הבדיקות התנהגותית מבוצעות ביום השמיני. מודל זה הוא הותאם ביעילות במחקר של המשטרה. הבדיקות התנהגותית כאן כוללים את המבחן גליל ניסוי השדה הפתוח. הניסוי גליל משמש כדי לזהות את היכולת החיות להרים את כפותיהם קבלה לשים כאשר לתוך סביבה שונים. כמו המשטרה להראות מודל עכברים הקשתת הגב — העכבר קשתות גבו – המספר של ירידה liftings כפת. בדיקה זו קל לביצוע. ניסוי השדה פתוח משמש כדי לזהות את כמות הזמן שהעכברים לבלות על ריצה, הליכה, שנותר משותק. עלינו לנתח את התנועות של בעלי החיים בשדה פתוח באמצעות תוכנה, לקבל נתונים. לבסוף, אנו משתמשים בסדר גמור, נפוץ ביותר PD סמים, כמו למשל להראות כיצד להחיל מודל זה במחקר של משטרת הסמים. התוצאות שלנו מציינים כי MPTP neurotoxicity המניע גירעון המנוע אשר יכול להיות חמאני בסדר גמור.

Introduction

מחלת פרקינסון (PD), אחת המחלות הנפוצות ביותר בקרב אנשים מבוגרים, הוא לטווח ארוך ניווניות הפרעת¹_. מטופלים תמיד להראות את תופעת רועדת, נוקשות, איטיות תנועה של דמנציה כי להחמיר במשך הזמן². תסמינים אחרים כולל חושית, שינה, בעיות רגשיות ומהכלכלה שנצפו². הגורם של המשטרה עדיין לא ברור, אך נהוג להאמין לערב גורמים גנטיים וסביבתיים, אשר לגרום לאובדן של נוירונים דופאמין של הסובסטנציה ניגרה³, ופיתוח של גופיפי לוי neurites באזורים שונים של המוח⁴_.

בין המחקרים של המשטרה, (MPTP) 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine⁵ הוא הותאם באופן נרחב לשחזר כמה תסמינים PD במודלים ניסיוני. בשנת 1984, לנגסטון. et al. מצא כי זריקות של MPTP קופי סנאי, גרמו Parkinsonism⁶. אף על פי המודל מכרסמים MPTP לא להציג את הנוכחות של גופיפי, המהווה סמן של המשטרה, MPTP גורמת תסמינים דמויי פרקינסון על ידי השמדת נוירונים דופאמין ב הסובסטנציה ניגרה של המוח⁷. בהשוואה למודל סמים אחרים עבור משטרת כגון אלה שנגזרות 6-hydroxydopamine (6-OHDA)⁸ ו 1-מתיל-4-phenylpyridinium (MPP +)⁹, הזרקה של MPTP קל לבצע, המודל MPTP לוקח פחות זמן. עכברים לקבל זריקות MPTP (20-30 מ"ג/ק"ג/יום) עבור שבעה ימים, ואת המבחנים התנהגותית המבוצעות היום השמיני¹⁰.

מבחן שדה פתוח¹¹ פותחה לראשונה על ידי קלווין ס הול, אמריקאי¹². במחקרים שונים, סוגים שונים של התנהגויות נבדקים. במחקר אשר מתמקדת במחלות פרקינסון, התנהגויות כמו פעילויות גפיים, המהירות ומכניקה של נבדקים לראות אם היכולת החיה לנוע מושפע. לעומת שיטות אחרות ששימשו לבחון הקמת משטרת בעלי חיים, בדיקת שדה פתוח קל לבצע את כל הציוד הדרוש היא פשוטה, שטנץ ונתונים ניתוח תוכנה (למשל, MATLAB, Excel) יכולה לשמש בקלות לאסוף, גרף נתונים. גם, המקדם של וריאציה הוא קטן יחסית¹³, מה שאומר כי התוצאה של בדיקת שדה פתוח הוא אמין. יתרון נוסף על פני שיטות אחרות היא כי ההתנהגויות בניסוי זה קל להבחין; העכברים יכול להיות ריצה, הליכה או בעמידה. בדרך כלל ניתן להשתמש במבחן בשדה פתוח על מכרסמים כאשר החוקר צריך להעריך את הניידות של הנושא.

הבדיקה גליל נקרא גם מבחן אסימטרי השימוש forelimbs. בעת בדיקה זו תוכננה קודם, השתמשו בו כדי לבחון את השימוש של החולדה forelimbs¹⁴א-סימטרי. כאן, אנו משתמשים במבחן זה כדי לנתח היכולת של החיה למתוח ולהשתמש שניהם forelimbs שלו כדי לחקור את הסביבה החדשה. כאשר הסובסטנציה ניגרה ואת הקורפוס סטריאטום פגומים ידי MPTP במוח, החיה נוטה לקמר את הגב שלו והופך פחות סביר למתוח ולחקור את הסביבה לא ידוע. מבחן זה הוא קל לבצע, יכול לתת תוצאה ראשונית. עם זאת, בדיקה זו יש השתנות פנימית גבוהה, כך זה משמש בדרך כלל עם יחד עם ניסויים התנהגות אחרים.

בסדר גמור, אשר ידוע גם בשם levodopa או L-3,4-dihydroxyphenylalanine, היא דרך נפוצה לטיפול מחלת פרקינסון כיוון אחד הגורם PD הוא הירידה של דופמין,. בסדר גמור היא הקדמה דופמין. אבל בניגוד דופמין, לעבור את מחסום הדם - מוח, מה שאומר שזה יהיה יעיל יותר להגדיל את ריכוז הדופאמין באזור המוח. אחרי זה חוצה את מחסום דם - מוח, בסדר גמור מומר דופאמין על ידי decarboxylase חומצה אמינו L¹⁵.

כאן נתאר את מדידה וניתוח של המוטורית בעכברים דגם MPTP-induced-PD באמצעות מבחן גליל¹⁴ ומבחן שטח פתוח ששונה. אנחנו מחלקים בסדר גמור כדוגמה אחת להראות כיצד ליישם את מודל זה במחקר של משטרת הסמים. התוצאות שלנו מציינים כי MPTP המניע גירעון המנוע זה יכול להיות חמאני בסדר גמור.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם לכללים ותקנים בינלאומיים, מוסדיים בהתחשב ניסויים בבעלי חיים. פרוטוקול המחקר אושרה על ידי ועדת האתיקה בעלי חיים של אוניברסיטת שינקאנסן.

1. MPTP ניהול בסדר גמור

הערה: עכברים BALB/c נקבה בת שבוע 10 נמסרו על ידי המכון לזואולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים. עכברים היו שש שוכנו לכל בכלוב תחת מחזור/כהה 12 שעות (אורות דולקים-08:00 ל- 20:00), טמפרטורה של 21-22 ° C ולחות יחסית של 55% ± 5%. צ'או עכברים רגילים בלוק של באותו ניסוח ומים ad libitum נגבתה כל בעלי החיים.

1. אחרי שבוע אחד של הסתגלות, לחלק את החיות שלוש קבוצות של שישה עכברים.
2. קבוצה 1, לנהל זריקות בקרום הבטן (ראה שלב 1.5) של 250 µL/עכבר/day של תמיסת מלח מיום 1 יום 7 ולאחר מכן לבצע ניהול intragastric (ראה שלב 1.6) של 250 µL/עכבר של תמיסת מלח ביום 8.
3. קבוצה 2, לנהל זריקות בקרום הבטן של 20 מ"ג/ק"ג/יום של MPTP כל יום יום א' עד יום 7 ולאחר מכן לבצע ניהול intragastric של µL 250/עכבר של תמיסת מלח ביום 8.
4. קבוצה 3, לנהל זריקות בקרום הבטן של 20 מ"ג/ק"ג/יום של MPTP מיום 1 יום 7 ולאחר מכן לבצע ניהול intragastric של 5 מ"ג/ק"ג בסדר גמור ביום 8.
5. לבצע הזרקת בקרום הבטן כדלקמן.
   1. לטעון את התרופה לתוך מזרק 1 מ"ל סטרילי עם מחט 26 גרם. לחסל את האוויר מן המזרק.
   2. עורפה העכבר עם הבטן שלו פונה כלפי מעלה. לשמור על הראש, הצוואר והגוף של העכבר בקו ישר כמו גם עם ראש קבוע.
   3. זווית המחט כדי לחדור את הצפק. לדחוף את המחט למרחק נאות עד שיש מעט התנגדות ולאחר מכן מזריקים את התרופה. להוציא את המחט בצורה חלקה.
6. מבצע המינהל intragastric כדלקמן.
   1. להכין את התרופה במערכת מזרק 1 מ"ל סטרילי עם מחט אורלי-gavage. לחסל את האוויר מן המזרק.
   2. החזק את העכבר עם הבטן שלו פונה כלפי מעלה. לשמור על הראש, הצוואר והגוף של העכבר בקו ישר עם ראש קבוע.
   3. להשאיר את המחט מקבילה לגוף של העכבר, ולהוסיפו מהפינה של הפה של העכבר, לחיצה על הלשון ודחפתי פנימה נגד בלסת העליונה.
   4. עם מעט התנגדות, המציגה את המחט נכנסת הוושט בצורה חלקה, בזהירות לדחוף את המחט למרחק נאות. לפני קצה המחט מגיע החלק התחתון של החזה, מזריקים את התרופה.
   5. להוציא את המחט בצורה חלקה.

2-מבחן גליל

הערה: הבדיקות התנהגותי בוצעו ביום 8. בסדר גמור הוזרק לקבוצה השלישית של עכברים 40 דקות לפני הבדיקות התנהגותית. אם בדיקה התנהגותית אינה מתבצעת באותו החדר שבו שוכנות החיות, בעלי חיים צריך להיות שאמבטיה לחדר החדש למשך 30-60 דקות לפני המבחן.

1. לבצע את הבדיקה 24 שעות לאחר המנה האחרונה של MPTP.
2. מניחים גליל זכוכית שקופה (גובה = 19.5 ס מ, קוטר = 15 ס מ, במשקל ≥1 ק ג) במרכז הטבלה. מקיפים את הצילינדר משלושה צדדים עם קרטון שחור כדי להפחית את ההשפעה של תאורה סביבתית. להשאיר בצד אחד של הגליל מול המצלמה עבור הקלטת וידאו.
   הערה: המרחק בין גליל קרטון צריך להיות כ- 4 עד 8 ס מ.
3. לצרף המצלמה (> 1 מיליון פיקסלים ברזולוציה) ב ~ 40-60 ס מ מן הגליל כדי להבטיח הצילינדר מלא גלוי.
   הערה: זה גם קרוב וגם רחוק מדי כדי לא להפריע את העכבר בעת הקלטת הוידאו של התנועה שלו.
4. במקום עכבר אחד לתוך הגליל בכל פעם ולהתחיל לצלם בו זמנית. תפסיקי לצלם לאחר 3 דקות.
   הערה: במהלך תהליך זה, נסה להימנע רעש או שינויים קלים על מנת להימנע המשפיעים על ההתנהגות של העכבר.
5. הנח את העכבר בחזרה לתוך הכלוב הביתה לאחר בדיקה.
6. לנקות את הצילינדר עם מים, ואז לרסס אתנול וי/v 70% מעל החומה הפנימית כדי להפוך אותה לקבילה ולהסיר העכבר ריחות. נגב הגליל יבש לפני עוד. עכבר ימוקם.
7. לנגן הוידאו בקצב של 0.5 x מהירות רגילה, לספור את מספר מעליות כפה הקיר של העכבר בכל.
   הערה: פאו מעליות להתרחש כאשר העכבר מרימה למעלה על hindlimbs שלה, מעלה שתי forelimbs מעל בגובה הכתף וקרקעות. מעלית forelimb אחד לא נספרת. בדרך כלל, עכבר מעלה את forelimbs שלה כדי לגעת בקירות גליל. אם העכבר מעלה שלה forelimbs בגובה הכתפיים מספר פעמים ברציפות ללא נחיתה, זה צריך ניתן לספור רק פעם אחת.

3. בדיקת שדה פתוח

1. לבצע ניסוי השדה פתוח 24 שעות לאחר מינון MPTP.
   הערה: זה יכול להתבצע באותו הזמן של הבדיקה גליל.
2. להכין תיבה התגובה שקוף בשטח פתוח (45 ס מ L x 45 ס"מ W x 25 ס מ H) עם כיסוי עץ צלחת בתחתית על ידי בד שחור. תיקון מצלמה (> 1 מיליון פיקסלים ברזולוציה) מעל לשדה בגובה 1 מ'.
   הערה: הצבע של שדה פתוח תיבת התחתון צריך להיות שונה מהצבע העכבר שנבדקו כדי להבטיח חדות הצבעים וידאו.
3. להתאים את המצלמה כדי לוודא כי תיבת התגובה שדה פתוח הוא בדיוק במרכז של הוידאו.
4. לשים את העכבר מבחן אחד לתוך התיבה, והנח את העכבר להכיר את עצמה עם הסביבה במשך כ- 1 דקות.
5. רשומה 5 דקות וידאו באמצעות מצלמת ה מחובר למחשב.
6. נתחו את הווידאו באמצעות כלי תוכנה (למשל, MATLAB) כדי לקבל את הדמות מעקב תנועה, ההתפלגות של חשמל סטטי (מהירות < 1 ס"מ/s), הליכה (מהירות 1-20 ס"מ/s) והפעלת (מהירות > 20 ס"מ/s) זמן, סה כ נסע מרחק, וממוצע המהירות של העכבר כל נבדק.
   הערה: בעת ניתוח הוידאו, נוכל לאתר את כל הגוף של העכבר. המהירות הממוצעת של גוף פירושו האורך הכולל של הנתיב מכוסה, מחולק על ידי הזמן שחלף. לכן, אם העכבר לא זז, מהירות מיידי שלה ייחשב כאפס.
7. לנקות את כל צואה בתיבת התגובה שדה פתוח. תרסיס אתנול 70% על התיבה, נגב את זה.

תוצאות

במבחן גליל, הירידה של הצמיגים הקיר נצפתה בעכברים (קבוצה 2) שטופלו MPTP מיום 1 יום 7 ו מלוחים ביום 8 לעומת עכברים שטופלו תמיסת מלח (קבוצה 1), בזמן עלייה של הצמיגים נצפתה ב העכברים (קבוצה 3) שטופלו MP TP מיום 1 יום 7 בסדר גמור ביום 8 לעומת העכברים (קבוצה 2) שטופלו MPTP מיום 1 יום 7 ו מלוחים ביו...

Discussion

עקב הרס של נוירונים דופאמין ב הסובסטנציה ניגרה של המוח, MPTP גורם סימפטומים של פרקינסון כמו עכברים⁷. בסדר גמור רק הסם המועדף ביותר עבור משטרת מאז השימוש הקליני שלה, מכיוון שהוא מסייע בשמירה על פעילויות יומיות נורמלי אצל חולים עם המשטרה, עם דיכוי יעיל של ליקויים מוטוריים כולל akinesi...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Ruiboxing Company	RBX-64175
Camera	BASLER	acA645-100gm
Cylinder test	Made in-house at Nankai University	N/A
Excel	Microsoft	N/A
Levodopa	Sigma-Aldrich	72816
Matalb 2017a	Mathworks	N/A
Mice	Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences	Balb/c	Adult female mice(10 weeks)
MPTP	Yuanye Biological Technology Company Ltd., Shanghai	S31504-500mg
Open field test	Made in-house at Nankai University	N/A
Syringe	Solelybio	S-xsgwz-w	Irrigation
Syringe	Jiangxi Fenglin Medical Application Co.	hc3824	Intraperitoneal injection