聚乙胺包覆氧化铁纳米粒子作为载体, 在体外和体内向巨噬细胞输送小干扰 rna

摘要

我们描述了一种使用聚乙烯烯胺 (pei) 涂层超顺磁性氧化铁纳米粒子与 sirna 转染巨噬细胞的方法。这些纳米颗粒可以有效地传递 sirna 巨噬细胞在体外和体内和沉默目标基因表达。

摘要

巨噬细胞由于在调节免疫反应方面的关键作用, 一直是深入研究的对象, 在自身免疫性疾病、动脉粥样硬化和癌症等许多疾病中都是一个有希望的治疗目标。rnai 介导的基因沉默是探索和操纵巨噬细胞功能的一种有价值的选择方法;然而, 巨噬细胞与 sirna 的转染通常被认为是技术上具有挑战性的, 目前, 很少有专门用于 sirna 转移到巨噬细胞的方法。在这里, 我们提出了一个协议, 使用聚乙烯烯胺涂层超顺磁性氧化铁纳米粒子 (pei-spions) 作为有针对性地传递 sirna 到巨噬细胞的载体。当 fe: sirna 重量比达到4及以上时, pei-spions 能够结合并完全冷凝 sirna。在体外, 这些纳米粒子可以有效地将 sirna 传递到初级巨噬细胞中, 也可以传递到类似巨噬细胞的 raw 264.7 细胞系中, 而不会在最佳转染剂量下损害细胞活力, 最终, 它们会诱发sirna 介导的靶向基因沉默。除了用于体外sirna 转染外, pei-spion 也是一种很有前途的工具, 可将sirna 传递给体内的巨噬细胞。鉴于其磁性能和基因沉默能力的综合特点, 系统管理的 pei-spion/srna 颗粒不仅可以调节巨噬细胞的功能, 而且可以使巨噬细胞被成像和跟踪。从本质上讲, pei-spions 代表了一个简单、安全和有效的非病毒平台, 用于在体外和体内将 sirna 传递给巨噬细胞。

引言

巨噬细胞是一种分布在所有身体组织中的先天免疫细胞, 尽管数量不同。通过产生多种细胞因子和其他介质, 它们在宿主防御入侵微生物病原体、损伤后组织修复和维持组织稳态¹方面发挥着至关重要的作用。巨噬细胞由于其重要性, 一直是深入研究的主题。然而, 尽管 sirna 介导的基因沉默在基因调控和功能研究中很普遍, 但它在巨噬细胞中成功的可能性较小, 因为这些细胞--特别是初级巨噬细胞--往往难以转染。这可归因于与最成熟的转染方法相关的毒性相对较高, 在这种方法中, 细胞膜是化学的 (例如, 与聚合物和脂质的) 或物理的 (例如, 通过电穿孔和基因枪) 被破坏, 让 sirna 分子穿过膜, 从而极大地降低了巨噬细胞的生存能力^2,3。此外, 巨噬细胞是富含降解酶的专用吞噬细胞。这些酶会损害 sirna 的完整性, 削弱其沉默效率, 即使基因特异性 sirna 已被传递到细胞^3,4。因此, 一个有效的巨噬细胞靶向 sirna 传递系统需要在传递^过程中保护 sirna 的完整性和稳定性4。

越来越明显的是, 功能失调的巨噬细胞与某些常见临床疾病 (如自身免疫性疾病、动脉粥样硬化和癌症) 的发生和发展有关。因此, 调节巨噬细胞功能, 例如, sirna, 已经成为一种有吸引力的方法来治疗这些疾病^{5, 6,7.}虽然已经取得了很大进展, 但基于 sirna 的治疗策略的一个主要挑战是系统管理的 sirna 的细胞特异性差, 巨噬细胞的 sirna 吸收不足, 从而导致不受欢迎的副作用。与游离核酸疗法相比, 由于其自发倾向于被网状内皮系统捕获, 通常缺乏最佳的细胞选择性, 并经常导致离靶不良效应, 药物负载纳米粒子 (nps),可设计为在体内被动靶向巨噬细胞, 允许提高治疗效果与最小的副作用⁸。目前探索的用于传递 rna 分子的 np 包括无机纳米载体、各种脂质体和聚合物⁹。其中, 聚乙基烯胺 (pei) 是一种能够将核酸结合并凝结成稳定的 np 的阳离子聚合物, 它显示出最高的 rna 传递能力⁹,¹⁰。pei 保护核酸免受酶和非酶降解, 介导它们在细胞膜上的转移, 并促进它们在细胞内的释放。虽然最初作为 dna 传递试剂引入, pei 后来被证明是一个有吸引力的平台, 在本地或系统 9^,10体内 sirna 传递。

超顺磁性氧化铁纳米粒子 (spions) 由于其磁性能、生物相容性、与生物重要物体的可比尺寸、较高的表面积与体积比以及易于适应的特性, 在生物医学领域显示出巨大的前景表面活性剂附件¹¹的表面。例如, 由于 spions 作为造影剂的潜在效用和巨噬细胞的快速吸收, 已成为一种最受欢迎的临床工具, 可对巨噬细胞^进行成像。虽然 spions 也被广泛研究为核酸交付车辆^{11,13,14, 15,}据我们所知, 文献中很少有关于 spions 作为载体的报告。巨噬细胞靶向 sirna 的传递。对于 spions 的基因传递, 它们的表面通常涂有一层亲水阳离子聚合物, 负电荷核酸可以被静电吸引和捆绑在上面。在这里, 我们提出了一种方法, 合成 spions 的表面被修改与低分子量 (10 kda), 分枝 pei (pei-spions)。然后利用这些磁性纳米平台浓缩 sirna, 形成 pei-spion/sirna 复合物, 使 sirna 能够进入细胞。我们认为, 网状内皮系统¹⁶细胞自发吞噬的 spions, 再加上 pei 结合和凝结核酸的强大能力, 使得 pei-spions 适合有效地将 sirna 运进 sirna巨 噬 细胞。这里提供的数据支持了 pei-spion/sina 介导的基因沉默在培养和体内巨噬细胞中的可行性。

研究方案

所有涉及活体动物的方法都是按照中国东南大学的动物护理和使用指南进行的。

1. pei-spions 的制备

1. 油酸修饰 spions 的制备
   1. 在 n2 的保护下, 在水中溶解 fecl 3·6h2o 和 feso 4·7h2o.
      1. 在烧杯_中加入28克 fecl 3·6h2o 和20克 feso4·7h2o, 加入80毫升的去离子水中.通过玻璃导管将 n2 引入水中, 搅拌至固体物质溶解。
      2. 将反应混合物加热至 72°c, 搅拌速率为800转/分, 然后加入40毫升氨水 (28%)。搅拌5分钟。
   2. 在上述溶液中滴注9毫升的油酸, 在72°c 下搅拌3小时。
   3. 将生成的溶液冷却至室温 (rt)。通过磁选来沉淀溶液。
   4. 用绝对乙醇清洗含有 spions 3倍的沉淀物, 然后将沉淀物分散在 n-已烷的100毫升中。
2. 二硫代琥珀酸修饰 spone 的制备
   1. 加入800毫克油酸 (oa) 修饰的 spions, 分散在 n-已烷200毫升中, 400 毫克二硫代琥珀酸 (dmsa) 分散在200毫升的丙酮中, 放入60°c 水浴中的三颈烧瓶中。
      注: 要确定从上一步获得的 oa 修饰 spion 的浓度, 请对 spion 分散量进行小体积 (例如1毫升), 使 n-已烷挥发, 并称量由此产生的粉末。
   2. 在上述溶液中滴注200μl 三乙胺, 在 1, 000 转/分搅拌, 并回流。
   3. 搅拌和回流5小时后, 通过磁选得到黑色沉淀物。
   4. 利用四甲基氢氧化铵调整溶液的 ph 值, 均匀地分散去离子水中的亲水性 sponic。
3. pei-spions 的制备
   1. 在-mL 三颈烧瓶中滴入 pei 溶液 (10 kda), 在 1, 000 转/分的机械搅拌下, 为 2小时 (w1:3 pei = 1:3).
      注: pei-spions 的电荷和大小因 w_{fe 与 w pei 的}比例而异。wf:w pei _比为1:3 可以作为一个很好的起点, 用于合成适合 sirna 传递的 pei-spione。
   2. 将生成的溶液添加到分子量为 100 kda、含量为 15 ml 的超滤管中;然后, 离心机在 5400 x g 10分钟, 直到剩余的溶液是1毫升。在溶液中加入去离子水, 使体积达到15毫升, 并重复上述工艺 10倍, 以获得最终产品。然后, 通过0.22μm 过滤器对溶液进行过滤, 并将最终产品存储在4°c。
   3. 用酚^{类化合物 17}的比色法测定 pei-spions 的铁浓度。用去离子化的无菌水稀释 pei-spions, 浓度为1毫克 f\ ml, 并将其储存在4°c。
   4. 用去离子水稀释 pi-spion 溶液 (1 毫克 fe/ml) 的10μl 至1毫升;然后, 利用动态光散射装置对其流体力学尺寸和 zeta 电位进行测试。
      注意: 在大约30-50 纳米的范围内准备 pei-spions。在此大小范围内, np 大小对 sirna 结合和细胞吸收的影响似乎并不显著。平均 zeta 电位超过 + 37 mv 的 pei-spion 在转染剂量范围内可能有毒, 应进行细胞毒性试验, 以确保安全。通过调整 pei 含量, 可以将纳米粒子的表面电荷和流体动力学尺寸控制在所需的范围内。

2. pei-spion/sirna nps 的制备及琼脂糖凝胶电泳

1. 用无 rnase 的水稀释 sirna, 最终产生 20μm (0.26μμμl) 的最终浓度。
2. 准备5个标记为0、1、2、4和8的无 rnase 微离心管。标签代表不同的铁: sirna 重量比率。将吡格3μl sirna 溶液输送到所有管 (约0.8 微克的 sirn·管)。
3. 在分别标记为0、1、2、4和8的管中加入0、0.8、1.6、3.2 和6.4 微克的铁。将每根管的总样品量保持在20μl 以下。通过上下轻轻移液混合。
4. 在 rt 中对混合物进行30分钟的培育, 以使 PEI-SPION/siRNA 复合体形成。在此期间, 用高纯度琼脂糖制成3% 琼脂糖凝胶。
   注: 可以制备和测试其他 pei-spion/sirna 复合物与其他 fe: sirna 比率 (例如, 5 或 6)。
5. 每5μl 样品加入1μl 的 6x dna 加载缓冲液, 并谨慎混合。加载所有样品, 并运行电泳在 5 vcme, 直到溴酚蓝色迁移到凝胶长度的三分之二。用溴化乙酯 (eb) 染色凝胶15-20分钟。
   注: 应使用新鲜制备的电泳缓冲液和 eb 溶液。
6. 在紫外线成像系统下可视化 sirna 带。检查 f:sirna 比率, 其中 sirna 与 pei-spione 形成复合物, 因此, 代表游离 sirna 的波段被阻碍或检测不到。

3. raw264.7 巨噬细胞的转染

1. 在一个10-co2 孵化器中, 使用 dmem 完整培养基, 每100微克/青霉素在37°c 时培养小鼠巨噬细胞样 raw264.7 细胞, 这种细胞含量为10厘米.
2. 在转染前一天, 从细胞中抽吸培养基, 用磷酸盐缓冲盐水 (ph 7.4) 冲洗。在10厘米的盘子中加入1毫升0.25% 的胰蛋白酶。在 5% co2 孵化器中, 在37°c 下对 raw264.7 细胞进行约5-10分钟的胰化 。
3. 当大多数细胞分离 (5-10分钟后), 添加5毫升的 dmem 完整的培养基到菜品中, 以灭活胰蛋白酶。向上和向下移液, 将细胞团簇分散到单个细胞中。
4. 将细胞悬浮液转移到无菌的15-ml 锥形管。在 rt 以 300 x g 离心 3分钟, 去除上清液。
5. 用5毫升新鲜 dmem 完整培养基对细胞进行再利用, 并对细胞进行计数。
6. 将 9 x 10 4个细胞分在6孔板上, 每孔2毫升的完整 dmem 培养基, 并在37°c 时在 5% co2 孵化器中孵育约24小时。
   注意: 如果使用不同尺寸的板, 请根据相对表面积调整镀层细胞密度, 使细胞在转染时达到80% 的融合度。
7. 当细胞融合率为80% 时, 从细胞中取出培养基, 用每口1毫升的 dmem 完整培养基代替。将板材送回孵化器, 直到 PEI-SPION/siRNA 复合物准备好并准备好使用 (约 30分钟)。
8. 制备 pei-spion/sirna 复合物: 计算转染实验所需的 PEI-SPION/siRNA 复合物的数量。在一个 1.5 ml 的无 rnase 微离心管中, 以给定的 fe:sirna 比将适量的 pei-spione 与 sirna 混合。例如, 在铁: sirna 比率为4时制备含有 100μg fe 的 pei-spion/sirna nps, 将 pei-spions 添加 100μl (1 mg fe) 至 96μl sirna (0.26μμl), 然后将其与微移液轻轻混合。在 rt 孵化30分钟。
   注: 准备一份超过总最终质量的 PEI-SPION/siRNA 复合物的体积, 以考虑任何附带损失。使 pei-spion/sirna 复合物在低 fe: sirna 比率下, sirna 分子被完全加载到 pei-spions 上, 因此, 少量的 pei-spions 可用于最大限度地减少潜在的细胞毒性。试点实验 (凝胶阻滞试验) 优化铁: sirna 比是必要的。
9. 从孵化器中取出6孔板 (3.7 步)。在每口井上加入所需体积的 PEI-SPION/siRNA 复合物, 并谨慎地旋流板, 以确保均匀分布。将钢板返回孵化器, 直到评估细胞吸收或基因敲除效率 (1-3 d)。
   注: 用 pei-spion/sirna 在浓度 ~ 15μg fe/ml 下转染巨噬细胞, 可最大限度地提高转染效率, 同时最大限度地降低潜在的细胞毒性。

4. 对实验性关节炎大鼠巨噬细胞的系统传递

1. 获取7周大的特定无病原体雄性 wistar 大鼠。在使用前让老鼠习惯 7d, 并为它们提供足够的食物和水。导致佐剂性关节炎 (aa) 在大鼠如上文所述¹⁸。
2. 按照步骤3.8 中的描述, 准备 PEI-SPION/siRNA 复合物。
3. 通过尾静脉将 PEI-SPION/siRNA nps (0.3 毫克 sirnna kg) 注入 aa 大鼠体内。例如, 通过流式细胞仪评估细胞的吸收, 通过实时荧光成像系统等方式评估组织的生物分布, 或基于临床、组织学和影像学等的治疗效果在所需时间点¹⁸进行分析。
   注: 对于细胞和组织生物分布研究, 用一次注射所需的 np 来治疗大鼠;为了进行治疗研究, 给老鼠注射 n p, 每周检测 1 x, 连续三周。

结果

该协议制备的 pei-spions 的大小和 zeta 电位分别在 29-48 nm (多分散指数: 0.12-0.23) 和 30-48 mv 之间。在4°c 的水中, 它们在4°c 下稳定超过 12个月, 没有明显的聚集。为了评价它们的 sirna 结合能力, pei-spions 在不同的 f:sina 重量比条件下与 sirna 混合。图 1显示, 当 fe: sirna 重量比达到4及以上时, 游离 sirna 的带完全缺失, 这意味着成功的 sirna 与 pei-spions 结合。pei ...

讨论

巨噬细胞很难通过常用的非病毒方法进行转染, 如电穿孔、阳离子脂质体和脂质种。在这里, 我们描述了一个可靠和有效的方法来转染巨噬细胞与 sirna。使用目前的协议, 90% 以上的巨噬细胞样 raw 264.7 细胞 (图 2b) 和大鼠腹腔巨噬细胞18可以用 sirna 转染, 而不会对细胞的存活能力造成重大损害。该方法依赖于由氧化铁芯和 pei 壳组成的纳米载体--的输送平台 pei-s...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	C11995500BT	Warm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serum	Gibco	A31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml)	Gibco	15140122
Tetrazolium-based MTS assay kit	Promega	G3582	For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell line	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China	TCM13
Tissue culture plates (6-well)	Corning	3516
Tissue culture dishes (10 cm)	Corning	430167
RNase-free tubes (1.5 ml)	AXYGEN	MCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml)	Corning	430791
Trypsin	Gibco	25200-056
Wistar rats	Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder	National Institutes for Food and Drug Control, China		for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNA	GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA	RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa)	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	E107079
Ammonia water	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	A112077
Oleic acid	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	O108484
Dimethylsulfoxide	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	D103272
FeSO4•7H2O	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10012118
FeCl3•6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10011918
Dimercaptosuccinic acid	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	D107254
ultrafiltration tube	Millipore	UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	T100882
Particle size and zeta potential analyzer	Malvern, England	Nano ZS90