Nanoparticelle di ossido di ferro rivestite con Polyethyleneimine come un veicolo per la consegna di piccolo RNA interferente ai macrofagi In Vitro e In Vivo

Riepilogo

Descriviamo un metodo di utilizzo polyethyleneimine (PEI)-rivestito di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico per macrofagi trasfezione con siRNA. Queste nanoparticelle è in grado di fornire in modo efficiente siRNA di espressione del gene bersaglio macrofagi in vitro e in vivo e silenzio.

Abstract

A causa del loro ruolo critico nella regolazione della risposta immunitaria, i macrofagi sono stati continuamente oggetto di intensa ricerca e rappresentano un promettente bersaglio terapeutico in molti disturbi, quali malattie autoimmuni, aterosclerosi e cancro. Silenziamento genico RNAi-mediata è un valido approccio di scelta per sonda e modificare la funzione del macrofago; Tuttavia, la transfezione di macrofagi con siRNA è spesso considerata di essere tecnicamente impegnativo e, attualmente, sono disponibili alcune metodologie dedicati al trasferimento siRNA ai macrofagi. Qui, presentiamo un protocollo di utilizzo di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico rivestite con polyethyleneimine (PEI-SPIONs) come veicolo per la somministrazione mirata di siRNA di macrofagi. PEI-SPIONs sono capaci di legare e di condensazione completamente siRNA quando il rapporto di peso di Fe: siRNA raggiunge 4 e sopra. In vitro, queste nanoparticelle possono fornire in modo efficiente siRNA in macrofagi primari, così come nella linea cellulare del 264,7 macrofago-come, senza compromettere la vitalità cellulare presso la dose ottimale per la transfezione, e, in definitiva, essi inducono destinazione di siRNA-mediata del silenziamento genico. Oltre ad essere usato per trasfezione con siRNA in vitro , PEI-SPIONs sono anche uno strumento promettente per la consegna di siRNA a macrofagi in vivo. In considerazione di sue caratteristiche unite di proprietà magnetiche e capacità di silenziamento genico, sistematicamente amministrati PEI-SPION/siRNA particelle dovrebbero non solo di modulare la funzione dei macrofagi, ma anche per attivare i macrofagi a essere imaged e tracciati. In sostanza, PEI-SPIONs rappresentano una piattaforma nonviral semplice, sicura ed efficace per la consegna di siRNA ai macrofagi sia in vitro che in vivo.

Introduzione

I macrofagi sono un tipo di cellule immuni innate distribuiti in tutti i tessuti del corpo, anche se in quantità diverse. Producendo una varietà di citochine e altri mediatori, giocano ruoli critici nella difesa ospite contro l'invasione di microrganismi patogeni, nella riparazione del tessuto dopo la lesione e nel mantenimento di omeostasi del tessuto¹. A causa della loro importanza, i macrofagi sono stati continuamente oggetto di intensa ricerca. Tuttavia, nonostante la sua prevalenza negli studi di funzione e regolazione genica, silenziamento genico siRNA-mediata è meno probabilità di riuscire a macrofagi perché queste cellule — in particolare, macrofagi primari — spesso sono difficili a transfect. Ciò può essere ascritto ad un grado relativamente elevato di tossicità associata con approcci di transfezione più consolidati in cui la membrana cellulare è chimicamente (ad es., con polimeri e lipidi) o fisicamente (ad es., mediante elettroporazione e pistole di gene) interrotto per consentire siRNA molecole attraversano la membrana, riducendone drasticamente vitalità^{2,3 dei macrofagi}. Inoltre, i macrofagi sono dedicati fagociti ricchi di enzimi degradativi. Questi enzimi possono danneggiare l'integrità del siRNA, indebolendo la sua efficienza silenziamento anche se siRNA gene-specifico è stato consegnato in cella^3,4. Di conseguenza, un sistema di consegna efficace del macrofago-mirati siRNA ha bisogno proteggere l'integrità e la stabilità di siRNA durante la consegna⁴.

È sempre più evidente che i macrofagi disfunzionali siano implicati nell'iniziazione e progressione di alcuni comuni disturbi clinici come cancro, aterosclerosi e malattie autoimmuni. Per questo motivo, modulando la funzione del macrofago con, per esempio, siRNA, sta emergendo come una metodologia attraente per il trattamento di questi disturbi^5,6,7. Nonostante i progressi realizzati, una sfida importante della strategia di trattamento basati su siRNA è la specificità di povera cella di siRNA sistematicamente amministrato e l'assorbimento di siRNA insufficiente da parte dei macrofagi, che di conseguenza portare a effetti collaterali indesiderati. Confrontato con acido nucleico libero terapeutica che in genere mancano della selettività cellulare ottimale e spesso portare a effetti avversi, caricati nanoparticelle (NPs), a causa della loro tendenza spontanea di essere catturato dal sistema reticoloendoteliale, fuori bersaglio possono essere progettati per il targeting passivo a macrofagi in vivo, permettendo una migliore efficacia terapeutica con effetti collaterali minimi⁸. NPs corrente esplorato per il rilascio di molecole di RNA includono nanovettori inorganici e liposomi vari polimeri⁹. Tra loro, polyethyleneimine (PEI), un tipo di polimeri cationici in grado di legare e di condensazione di acidi nucleici in NPs stabilizzato, Mostra il RNA più alto offrendo capacità^9,10. PEI protegge gli acidi nucleici da degradazione enzimatici e non enzimatici, media il loro trasferimento attraverso la membrana cellulare e promuove il loro rilascio intracellulare. Anche se inizialmente introdotto come un reagente di consegna di DNA, PEI successivamente è stata dimostrata per essere una piattaforma attraente per in vivo siRNA consegna, o in locale o sistemica^9,10.

Nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPIONs) hanno mostrato grande promessa nel campo della biomedicina, a causa delle loro proprietà magnetiche, biocompatibilità, dimensioni paragonabili agli oggetti biologicamente importanti, alto rapporto superficie-zona--volume e facilmente adattabile superficie per agente allegato¹¹. Per esempio, a causa della loro utilità potenziale come un agente di contrasto e di rapido assorbimento da parte dei macrofagi, SPIONs sono emersi come uno strumento clinico a immagine del tessuto macrofagi¹². Mentre SPIONs inoltre sono stati studiati estesamente come acido nucleico consegna veicoli^11,13,14,15, a nostra conoscenza, la letteratura contiene pochi rapporti di SPIONs come vettore per consegna del macrofago-mirati siRNA. Per la consegna del gene di SPIONs, la loro superficie è solitamente rivestita con uno strato di polimeri cationici idrofilici su cui caricati negativa degli acidi nucleici può essere elettrostaticamente attratto e legati. Qui, presentiamo un metodo per la sintesi di SPIONs cui superficie viene modificata con basso peso molecolare (10 kDa), ramificata PEI (PEI-SPIONs). Questi nanoplatforms magnetico sono quindi impiegati per condensare siRNA, formando dei complessi PEI-SPION/siRNA che permettono il trasporto di siRNA nella cellula. Abbiamo ragione quella spontanea fagocitosi di SPIONs dalle cellule del sistema reticoloendoteliale¹⁶, accoppiato con la forte capacità di associazione e condensazione di acidi nucleici da PEI, rende PEI-SPIONs adatto per il trasporto efficiente di siRNA in macrofagi. I dati presentati qui sostengono la fattibilità del silenziamento genico PEI-SPION/siRNA-mediata nei macrofagi in cultura come pure in vivo.

Protocollo

Tutti i metodi che coinvolgono animali vivi sono stati eseguiti in conformità con l'animale con cautela e linee guida di Southeast University, Cina.

1. preparazione del PEI-SPIONs

1. Preparazione dell'acido oleico-modificato SPIONs
   1. Sciogliere FeCl₃•6H₂O e FeSO₄•7H₂, O nell'acqua sotto la protezione di N₂.
      1. Aggiungere 28 g di FeCl₃•6H₂O e 20 g di FeSO₄•7H₂O in 80 mL di acqua deionizzata in un becher. Introdurre l'acqua attraverso una condotta di vetro N₂ e mescolare fino a sciolta la materia solida.
      2. Riscaldare la miscela di reazione a 72 ° C ad una velocità di agitazione di 800 giri/min, seguita dalla aggiunta di 40 mL di acqua ammoniacale (28%). Mescolare per 5 min.
   2. Aggiungere goccia a goccia 9 mL di acido oleico nella soluzione di cui sopra e mescolate a 72 ° C per 3 h.
   3. Raffreddare la soluzione risultante a temperatura ambiente (TA). Precipitare la soluzione tramite separazione magnetica.
   4. Lavare il precipitato contenente SPIONs 3 x con alcool etilico assoluto e, quindi, disperdere il precipitato in 100 mL di N-esano.
2. Preparazione di dimercaptosuccinic acido-modificati SPIONs
   1. Aggiungere 800 mg di acido oleico (OA)-modificato SPIONs distribuiti in 200 mL di N-esano, e 400 mg di acido dimercaptosuccinic (DMSA) dispersi in 200 mL di acetone, in un pallone a tre colli in un bagno di acqua a 60 ° C.
      Nota: Per determinare la concentrazione di OA-modificato SPION ottenuti nel passaggio precedente, prendere un piccolo volume (ad es. 1 mL) della dispersione SPION, volatilizzare il N-esano e pesare la polvere risultante.
   2. Aggiungere 200 µ l di trietilammina goccia a goccia nella soluzione di cui sopra con agitazione a 1.000 giri/min e riflusso.
   3. Dopo 5 h di agitazione e di riflusso, è possibile ottenere un precipitato nero di separazione magnetica.
   4. Regolando il pH della soluzione con idrossido di tetrametilammonio si disperdono in modo omogeneo la SPIONs idrofile in acqua deionizzata.
3. Preparazione di PEI-SPIONs
   1. Aggiungere goccia a goccia soluzione colloidale SPION DMSA-modificato nella soluzione di PEI (10 kDa) in un matraccio da tre colli di 500 mL sotto agitazione meccanica a 1.000 giri/min per 2h (W_Fe: W_PEI = 1:3).
      Nota: Il costo e le dimensioni di PEI-SPIONs variano a seconda della percentuale di W_Fe a W_PEI. Il W_Fe: W_PEI rapporto di 1:3 può essere un buon punto di partenza per la sintetizzazione PEI-SPIONs adatto per la consegna di siRNA.
   2. Aggiungere la soluzione risultante in una provetta di ultrafiltrazione avendo un peso molecolare di taglio di 100 kDa e un contenuto di 15 mL; quindi, centrifugare a 5.400 x g per 10 min fino a quando la soluzione rimanente è di 1 mL. Aggiungere acqua deionizzata alla soluzione per rendere il volume 15ml nuovamente e ripetere la procedura sopra 10 x per ottenere il prodotto finale. Quindi, filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 μm e conservare il prodotto finale a 4 ° C.
   3. Determinare la concentrazione di Fe di PEI-SPIONs con il metodo colorimetrico utilizzando fenantrolina¹⁷. PEI-SPIONs di diluire con acqua deionizzata sterile ad una concentrazione di 1 mg Fe/mL e conservarla a 4 ° C.
   4. Diluire 10 μL della soluzione di PEI-SPION (1 mg Fe/mL) a 1 mL con acqua deionizzata; quindi, verificare le dimensioni idrodinamico e potenziale zeta da un dispositivo dinamico di luce-dispersione.
      Nota: Preparare il PEI-SPIONs nella gamma di circa 30-50 nm. In questo intervallo di grandezza, l'effetto della dimensione del NP sull'associazione di siRNA e l'assorbimento cellulare non sembra essere significativo. PEI-SPIONs cuscinetto un potenziale zeta media oltre + 37 mV può essere tossico nell'intervallo delle dosi per la transfezione, e dovrebbe essere effettuata un'analisi di citotossicità per garantire la sicurezza. La carica superficiale e idrodinamica dimensioni delle nanoparticelle possono essere controllati all'interno di un intervallo desiderato regolando la percentuale di PEI.

2. preparazione ed elettroforesi del Gel dell'agarosi di PEI-SPION/siRNA NPs

1. SiRNA diluito con acqua priva di RNAsi per ottenere una concentrazione finale di 20 μM (0,26 μg/μL).
2. Preparare le provette microcentrifuga RNAsi-libera cinque etichettati 0, 1, 2, 4 e 8. Le etichette rappresentano rapporti di peso diverso Fe: siRNA. Dispensare 3 μL di soluzione di siRNA a tutte le provette (~0.8 μg di siRNA/tubo).
3. Aggiungere 0, 0.8, 1.6, 3.2, e 6,4 μg di Fe sottoforma di PEI-SPIONs ai tubi etichettati 0, 1, 2, 4 e 8, rispettivamente. Tenere il volume totale del campione di ogni tubo meno di 20 μL. Mescolare pipettando delicatamente su e giù.
4. Incubare le miscele a temperatura ambiente per 30 minuti per permettere la formazione di complessi di PEI-SPION/siRNA. Durante questo periodo, fare un 3% di agarosio gel con elevata purezza dell'agarosi.
   Nota: Ulteriori PEI-SPION/siRNA complessi con altri rapporti di Fe: siRNA (ad esempio, 5 o 6) possono essere preparati e testati.
5. Aggiungere 1 μL di tampone di DNA-caricamento a 5 μL di campione: 6x e mescolare con cautela. Caricare tutti i campioni ed eseguire l'elettroforesi a 5 V/cm fino a quando il blu di bromofenolo migra fino a due terzi della lunghezza del gel. Macchia il gel con bromuro di etidio (EB) per 15-20 min.
   Nota: Il tampone di elettroforesi preparati al momento e la soluzione EB deve essere utilizzati.
6. Visualizzate le fasce di siRNA sotto un UV sistema di imaging. Controllare i rapporti di Fe: siRNA a quali complessi di forme di siRNA con PEI-SPIONs e, di conseguenza, le bande che rappresentano gratis siRNA sono ritardati o non rilevabili.

3. la transfezione di macrofagi RAW 264.7 In Vitro

1. Macrofago-come le cellule RAW 264.7 di cultura del mouse in un piatto di 10 cm utilizzando DMEM completano Media contenente 10% siero bovino fetale (FBS) a 100 U/mL di penicillina per 100 μg/mL streptomicina a 37 ° C in un incubatore di 5% CO₂ .
2. Un giorno prima la transfezione, aspirare medio dalle cellule e risciacquarli con soluzione tampone fosfato (pH 7,4). Aggiungere 1 mL di tripsina 0,25% per il piatto di 10 cm. Tripsinizzano RAW 264.7 celle per circa 5-10 min a 37 ° C in un incubatore di 5% CO₂ .
3. Quando la maggior parte delle cellule hanno staccato (dopo 5-10 min), aggiungere 5 mL di terreno completo DMEM al piatto per inattivare la tripsina. Dispensare su e giù per disperdere i mazzi delle cellule in cellule singole.
4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica sterile di 15 mL. Centrifugare a 300 x g per 3 min a RT. rimuovere il surnatante.
5. Risospendere le cellule con 5 mL di terreno completo nuovo DMEM e contare le celle.
6. Cellule di⁴ piastra 9 x 10 per bene in una piastra a 6 pozzetti con 2 mL di terreno DMEM completo e incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO₂ per circa 24 h.
   Nota: Se si utilizza una piastra di dimensioni diverse, regolare la densità cellulare placcato proporzionale alla relativa superficie affinché le cellule raggiungere confluency di 80% al momento della trasfezione.
7. Quando confluency di cella è 80%, rimuovere il supporto dalle cellule e sostituirlo con 1 mL di terreno completo DMEM per pozzetto. Restituire la piastra nell'incubatore fino a PEI-SPION/siRNA complessi sono stati preparati e sono pronti all'uso (circa 30 min).
8. Preparare il PEI-SPION/siRNA complessi: calcolare la quantità di complessi di PEI-SPION/siRNA necessario per un esperimento di transfezione. In un tubo del microcentrifuge RNAsi-libera 1,5 mL, mescolare una quantità appropriata di PEI-SPIONs con siRNA un rapporto determinato Fe: siRNA. Per esempio, per preparare il PEI-SPION/siRNA NPs contenente 100 µ g di Fe con un rapporto di Fe: siRNA di 4, aggiungere 100 µ l (1 mg Fe/mL) di PEI-SPIONs a 96 μL di siRNA (0,26 μg/μL), seguita da mescolando delicatamente con una micropipetta. Incubare per 30 minuti a TA.
   Nota: Preparare un volume di PEI-SPION/siRNA complesso che è 10% oltre la massa totale finale per tenere conto di eventuali perdite accidentali. Fare PEI-SPION/siRNA complessi rapporti di bassa Fe: siRNA, sotto il quale molecole di siRNA sono completamente caricati su PEI-SPIONs e, quindi, piccole quantità di PEI-SPIONs può essere utilizzato per ridurre al minimo il potenziale citotossicità. Esperimenti pilota (analisi di ritardo del gel) per l'ottimizzazione del rapporto Fe: siRNA sono necessari.
9. Prendere la piastra 6 pozzetti dall'incubatrice (punto 3.7). Aggiungere un volume richiesto di PEI-SPION/siRNA complesso goccia a goccia in ciascun pozzetto e agitare la piastra con cautela per garantire una distribuzione uniforme. Riporre la piastra nell'incubatore fino alla valutazione del cellulare assorbimento o gene atterramento efficienza (d 1-3).
   Nota: Macrofagi trasfezione con siRNA/PEI-SPION ad una concentrazione di ~ 15 μg Fe/mL possono massimizzare efficienza di trasfezione riducendo potenziali citotossicità.

4. consegna sistemica di siRNA ai macrofagi nei ratti con artrite sperimentale

1. Ottenere specifiche di Wistar maschio esenti da patogeni che sono vecchio 7 settimane. Habituate i ratti per 7 d prima dell'uso e di fornire loro con acqua e cibo adeguato. Indurre l'artrite ausiliaria (AA) nei ratti come descritto in precedenza¹⁸.
2. Preparare il PEI-SPION/siRNA complessi come descritto al punto 3.8.
3. Iniettare il NPs PEI-SPION/siRNA (0,3 mg di siRNA/kg) nell'AA ratti tramite vena caudale. Valutare l'assorbimento cellulare tramite, per esempio, citometria a flusso, tessuto biodistribuzione tramite, per esempio, una fluorescenza in tempo reale sistema di imaging o effetti terapeutici sulla base, per esempio, clinici, istologici e radiografici ¹⁸punti di analisi all'orario desiderato.
   Nota: Per gli studi di biodistribuzione cellulari e tissutali, trattare i ratti con una singola iniezione di NPs desiderata; per gli studi terapeutici, iniettare i ratti con NPs per essere testato 1 volta a settimana per tre settimane consecutive.

Risultati

La dimensione e la zeta potenziale di PEI-SPIONs preparato con questo protocollo sono stati nella gamma di 29-48 nm (indice di polidispersione: 0.12 - 0.23) e 30-48 mV, rispettivamente. Erano stabili in acqua a 4 ° C per oltre 12 mesi senza aggregazione ovvio. Per valutare la loro capacità di associazione di siRNA, PEI-SPIONs sono stati mescolati con siRNA a vari rapporti di peso Fe: siRNA. La figura 1 Mostra che quando il rapporto di peso di Fe: siRNA ragg...

Discussione

I macrofagi sono refrattari a transfect da approcci nonviral comunemente utilizzati, quali l'elettroporazione, liposomi cationici e specie del lipido. Qui abbiamo descritto un metodo affidabile ed efficiente per transfect macrofagi con siRNA. Utilizzando il presente protocollo, oltre 90% di macrofago-come 264.7 celle grezze (Figura 2B) e macrofagi peritoneali di ratto¹⁸ può essere trasfettate con siRNA senza significativa compromissione dell'attuabilità delle cellul...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	C11995500BT	Warm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serum	Gibco	A31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml)	Gibco	15140122
Tetrazolium-based MTS assay kit	Promega	G3582	For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell line	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China	TCM13
Tissue culture plates (6-well)	Corning	3516
Tissue culture dishes (10 cm)	Corning	430167
RNase-free tubes (1.5 ml)	AXYGEN	MCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml)	Corning	430791
Trypsin	Gibco	25200-056
Wistar rats	Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder	National Institutes for Food and Drug Control, China		for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNA	GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA	RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa)	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	E107079
Ammonia water	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	A112077
Oleic acid	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	O108484
Dimethylsulfoxide	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	D103272
FeSO4•7H2O	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10012118
FeCl3•6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10011918
Dimercaptosuccinic acid	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	D107254
ultrafiltration tube	Millipore	UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	T100882
Particle size and zeta potential analyzer	Malvern, England	Nano ZS90