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Resumo

Nós descrevemos um método de usar polyethyleneimine (PEI)-revestido de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético para macrófagos transfecting com siRNA. Essas nanopartículas podem eficientemente entregar siRNA expressão macrófagos gene-alvo em vitro e in vivo e silêncio.

Resumo

Devido ao seu papel crítico na regulação da resposta imune, os macrófagos continuamente tenham sido objecto de intensa investigação e representam um alvo terapêutico promissor em muitas doenças, como doenças auto-imunes, aterosclerose e câncer. Silenciamento de genes mediada por RNAi é uma valiosa abordagem de escolha para investigar e manipular a função de macrófagos; no entanto, o transfeccao de macrófagos com siRNA é considerado frequentemente para ser tecnicamente desafiador, e, neste momento, algumas metodologias dedicadas para a transferência de siRNA para macrófagos estão disponíveis. Aqui, apresentamos um protocolo do uso de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético polyethyleneimine-revestido (PEI-SPIONs) como um veículo para a entrega de alvo de siRNA para macrófagos. PEI-SPIONs são capazes de vinculação e completamente condensação siRNA quando a relação de peso de Fe: siRNA atinge 4 e acima. In vitro, essas nanopartículas podem eficientemente entregar siRNA em macrófagos primários, bem como para a linha de celular de macrófagos, como 264.7 crus, sem comprometer viabilidade celular na dose ideal para transfeccao, e, em última análise, eles induzem silenciamento de genes mediada por siRNA alvo. Além de ser usado para em vitro transfeccao siRNA, PEI-SPIONs são também uma ferramenta promissora para a entrega de siRNA para macrófagos na vivo. Tendo em conta as suas características combinadas de propriedade magnética e silenciamento capacidade, sistemicamente administrado PEI-SPION/siRNA partículas são esperadas não só para modular a função de macrófagos, mas também para ativar macrófagos para ser fotografado e rastreado. Em essência, PEI-SPIONs representam uma plataforma nonviral simples, segura e eficaz para a entrega de siRNA para macrófagos tanto in vitro e in vivo.

Introdução

Os macrófagos são um tipo de células do sistema imune inatos distribuídos em todos os tecidos do corpo, embora em quantidades diferentes. Produzindo uma variedade de citocinas e outros mediadores, eles desempenham papéis críticos na defesa do hospedeiro contra patógenos microbianos a invadir, na reparação de tecidos após lesão e na manutenção da homeostase de tecido1. Devido à sua importância, os macrófagos continuamente tenham sido objecto de intensa investigação. No entanto, apesar de sua prevalência em estudos de função e regulação gênica, silenciamento de genes mediada por siRNA é menos susceptível de ter êxito em macrófagos, porque estas células — particularmente, macrófagos primários — são frequentemente difíceis de transfect. Isto pode ser atribuído a um grau relativamente elevado de toxicidade associado com abordagens de transfeccao mais bem estabelecidas que a membrana celular é quimicamente (por exemplo, com polímeros e lipídios) ou fisicamente (por exemplo, por eletroporação e armas de gene) interrompeu deixar siRNA moléculas atravessam a membrana, reduzindo assim drasticamente viabilidade de2,3 dos macrófagos. Além disso, os macrófagos são os fagócitos dedicados ricos em enzimas degradativos. Estas enzimas podem danificar a integridade do siRNA, enfraquecendo sua eficiência silencioso mesmo se siRNA gene-específico foi entregue para a célula3,4. Portanto, precisa de um sistema de entrega de siRNA macrófago-alvo eficaz proteger a integridade e a estabilidade de siRNA durante entrega4.

É cada vez mais evidente que macrófagos disfuncionais estão implicados na iniciação e progressão de certas desordens clínicas comuns como doenças auto-imunes, aterosclerose e câncer. Por este motivo, modulando a função do macrófago com, por exemplo, siRNA, tem sido a emergir como uma metodologia atraente para o tratamento destes transtornos5,6,7. Embora muito progresso tem sido feito, um grande desafio da estratégia de tratamento baseado em siRNA é a especificidade da célula pobre de siRNA sistemicamente administrado e a absorção de siRNA insuficiente pelos macrófagos, que, consequentemente, levar a efeitos colaterais indesejados. Comparado com terapêutica de ácido nucleico livre que geralmente carecem de seletividade de célula ideal e muitas vezes levam a efeitos adversos, carregado de drogas nanopartículas (NPs), devido à sua propensão espontânea de ser capturado pelo sistema reticuloendotelial, fora do alvo pode ser projetada para o direcionamento passiva de macrófagos na vivo, permitindo a maior eficácia terapêutica com efeitos colaterais mínimos8. Atual NPs explorado para a entrega de moléculas do RNA incluem nanocarriers inorgânicos e lipossomas diversos polímeros9. Entre eles, o polyethyleneimine (PEI), um tipo de polímeros cationic capazes de vinculação e condensação de ácidos nucleicos em NPs estabilizado, mostra o RNA maior fornecimento de capacidade9,10. PEI protege os ácidos nucleicos de degradação enzimática e nonenzymatic, Medeia sua transferência através da membrana celular e promove sua liberação intracelular. Embora inicialmente introduzido como um reagente de entrega de DNA, PEI foi posteriormente demonstrado ser uma plataforma atrativa para na vivo entrega siRNA, localmente ou sistemicamente9,10.

Nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIONs) tem mostrado grande promessa na biomedicina, devido às suas propriedades magnéticas, biocompatibilidade, tamanho comparável aos objetos biologicamente importantes, alta proporção de superfície-área-volume e facilmente adaptável superfície para o bioagente anexo11. Por exemplo, por causa de sua utilidade potencial como um agente de contraste e rápida absorção por macrófagos, SPIONs surgiram como uma ferramenta clínica favorita para imagem de macrófagos de tecido12. Enquanto SPIONs também têm sido muito estudados como ácido nucleico entrega veículos11,13,14,15, nosso conhecimento, a literatura contém alguns relatos de SPIONs como um portador para entrega de siRNA macrófago-alvo. Para a entrega do gene por SPIONs, sua superfície geralmente é revestida com uma camada de polímeros cationic hidrofílicos na qual carregados negativamente ácidos nucleicos pode ser eletrostaticamente atraiu e amarrados. Aqui, apresentamos um método para a síntese de SPIONs cuja superfície é modificada com baixo peso molecular (10 kDa), ramificada PEI (PEI-SPIONs). Estes nanoplatforms magnéticos então são empregados para condensar siRNA, formando complexos de PEI-SPION/siRNA que permitem o transporte de siRNA para a célula. Nós razão aquela espontânea fagocitose de SPIONs pelas células do sistema reticuloendotelial16, juntamente com a forte capacidade de ligação e condensação de ácidos nucleicos por PEI, processa a PEI-SPIONs apropriado para o transporte eficiente de siRNA em macrófagos. Os dados apresentados aqui apoiar a viabilidade de silenciamento de genes PEI SPION/siRNA-mediada em macrófagos na cultura, bem como na vivo.

Protocolo

Todos os métodos que envolvem animais vivos foram realizados em conformidade com o animal cuidado e usam as diretrizes da Universidade do sudeste, China.

1. preparação do PEI-SPIONs

  1. Preparação do ácido oleico-modificado SPIONs
    1. Dissolva FeCl3•6H2O e Filipa4•7H2O na água sob a proteção de N2.
      1. Adicione 28 g de FeCl3•6H2O e 20 g de Filipa4•7H2O em 80 mL de água desionizada num copo. Introduzir a água através de uma canalização de vidro N2 e mexa até dissolver a matéria sólida.
      2. Aqueça a mistura de reação a 72 ° C, a uma taxa de agita de 800 rpm, seguido pela adição de 40 mL de água de amônia (28%). Mexa por 5 min.
    2. Adicionar 9 mL de ácido oleico gota a gota, na solução acima mencionada e agite-a 72 ° C por 3 h.
    3. Esfrie a solução resultante a temperatura ambiente (RT). Precipitar a solução através da separação magnética.
    4. Lavar o precipitado contendo SPIONs 3 x com absoluto álcool etílico e, em seguida, dispersar o precipitado em 100 mL de N-hexano.
  2. Preparação de dimercaptosuccínico ácido-modificado SPIONs
    1. Adicionar 800 mg de ácido oleico (OA)-modificado SPIONs dispersadas em 200 mL de N-hexano, e 400 mg de ácido dimercaptosuccínico (DMSA) dispersos em 200 mL de acetona, para um balão de três-pescoço em um banho de água a 60 ° C.
      Nota: Para determinar a concentração de SPION OA-modificado obtido na etapa anterior, tomar um volume pequeno (por exemplo, 1ml) de dispersão SPION, volatilize o N-hexano e pesar o pó resultante.
    2. 200 µ l de trietilamina adicione gota a gota a solução acima mencionada com agitação a 1.000 rpm e refluxo.
    3. Após 5h de agitação e refluxo, obter um precipitado preto por separação magnética.
    4. Disperse homogeneamente os hidrofílicos SPIONs em água desionizada, ajustando o pH da solução usando hidróxido de tetrametilamónio.
  3. Preparação do PEI-SPIONs
    1. Adicionar a solução coloidal de DMSA-modificado SPION gota a gota em solução de PEI (10 kDa) em um balão de 500 mL três-pescoço sob agitação mecânica a 1.000 rpm por 2 h (WFe: WPEI = 1:3).
      Nota: A carga e tamanho de PEI-SPIONs variam dependendo da proporção de WFe para WPEI. O WFe: WPEI rácio de 1:3 pode ser um bom ponto de partida para a síntese de PEI-SPIONs apropriados para entrega de siRNA.
    2. Adicionar a solução resultante em um tubo de ultrafiltração, tendo um peso molecular de corte de 100 kDa e um teor de 15 mL; em seguida, centrifugar 5.400 x g por 10 min até que o restante da solução é de 1 mL. Adicionar água desionizada para a solução para tornar o volume 15 mL novamente e repita o processo acima 10 x para obter o produto final. Em seguida, filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm e armazenar o produto final a 4 ° C.
    3. Determine a concentração de Fe de PEI-SPIONs pelo método colorimétrico, utilizando fenantrolina17. Diluir a PEI-SPIONs com água desionizada estéril, a uma concentração de 1 mg Fe/mL e armazená-lo em 4 ° C.
    4. Diluir 10 μL da solução de PEI-SPION (1 mg Fe/mL) para 1 mL com água desionizada; em seguida, teste seu tamanho hidrodinâmico e potencial zeta por um dispositivo de dispersão de luz dinâmico.
      Nota: Preparar PEI-SPIONs na faixa de aproximadamente 30-50 nm. Nesta faixa de tamanho, o efeito do tamanho da NP na ligação de siRNA e absorção celular parece não ser significativa. PEI-SPIONs tendo um potencial zeta média mais + 37 mV pode ser tóxica na faixa de dose para transfeccao, e um ensaio de citotoxicidade deve ser realizado para garantir a segurança. A carga de superfície e tamanho hidrodinâmico das nanopartículas podem ser controlados dentro de um intervalo desejado ajustando o conteúdo de PEI.

2. preparação e electroforese do Gel do Agarose de PEI-SPION/siRNA NPs

  1. SiRNA diluído com água livre de RNase para produzir uma concentração final de 20 μM (0.26 μg/μL).
  2. Prepare cinco livre de RNase microcentrifuga tubos rotulados 0, 1, 2, 4 e 8. As etiquetas representam Fe: siRNA diferentes relações de peso. Pipetar 3 μL de solução de siRNA para todos os tubos (~0.8 μg de siRNA/tubo).
  3. Adicionar 0, 0.8, 1.6, 3.2, e 6.4 μg de Fe na forma de PEI-SPIONs aos tubos rotulados 0, 1, 2, 4 e 8, respectivamente. Manter o volume total da amostra de cada tubo inferior a 20 μL. Misture suavemente pipetando acima e para baixo.
  4. Incube as misturas em RT por 30 min para permitir a formação do complexo PEI-SPION/siRNA. Durante este período, fazer um agarose a 3% gel de agarose de alta pureza.
    Nota: Adicionais PEI-SPION/siRNA complexos com outros rácios de Fe: siRNA (por exemplo, 5 ou 6) podem ser preparados e testados.
  5. Adicione 1 μL de 6x do amortecedor do DNA-carregamento por amostra 5 μL e misture com cautela. Carregar todas as amostras e executar eletroforese em 5 V/cm até que o azul de bromofenol migra até dois terços do comprimento do gel. Manche o gel com brometo de etídio (EB) por 15-20 min.
    Nota: Tampão de eletroforese preparados na hora e EB solução devem ser usados.
  6. Visualize siRNA bandas sob um sistema de imagem de UV. Verifique os rácios de Fe: siRNA na quais complexos de formas de siRNA com PEI-SPIONs e, como resultado, as bandas representando siRNA livre são retardados ou não detectável.

3. a transfeccao de RAW264.7 macrófagos In Vitro

  1. Cultura do mouse macrófago RAW264.7 células em um prato de 10 cm, usando DMEM completam médio contendo 10% fetal de soro bovino (FBS) por 100 penicilina U/mL por 100 estreptomicina μg/mL a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 .
  2. Um dia antes o transfeccao, Aspire médio das células e enxaguá-los com tampão fosfato salino (pH 7,4). Adicione 1 mL de tripsina 0,25% para o prato de 10 cm. Trypsinize RAW264.7 células por cerca de 5-10 min a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 .
  3. Quando a maioria das células ter desanexado (após 5-10 min), adicione 5 mL de meio completo DMEM ao prato para inactivar a tripsina. Pipetar para cima e para baixo dispersar clusters de célula em células únicas.
  4. Transferi a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL estéril. -Centrifugar a 300 x g por 3 min em RT. Remove o sobrenadante.
  5. Ressuspender as células com 5 mL de meio de completa DMEM fresco e contar as células.
  6. Células de4 placa 9 x 10 por bem em uma placa de 6 com 2 mL de meio DMEM completo e incubam a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 por cerca de 24 h.
    Nota: Se utilizar uma placa de um tamanho diferente, ajuste a densidade de celular chapeado na proporção de área de superfície relativa para que as células alcançar confluência de 80% na época do transfection.
  7. Quando a confluência de célula é de 80%, remover o meio das células e substituí-lo com 1 mL de meio completo DMEM por alvéolo. Devolve a chapa para a incubadora até PEI-SPION/siRNA complexos foram preparados e estão prontos para uso (cerca de 30 min).
  8. Preparar o PEI-SPION/siRNA complexos: calcular a quantidade de PEI-SPION/siRNA complexos necessários para uma experiência do transfection. Em um 1,5 mL RNase-livre microcentrifuga tubo, misture uma quantidade adequada de PEI-SPIONs com siRNA em uma proporção de Fe: siRNA determinado. Por exemplo, para preparar o NPs PEI-SPION/siRNA contendo 100 µ g de Fe em uma proporção de Fe: siRNA de 4, adicionar 100 µ l (1 mg Fe/mL) de PEI-SPIONs para 96 μL de siRNA (0.26 μg/μL), seguido de misturá-lo suavemente com uma micropipeta. Incubar durante 30 min à RT.
    Nota: Prepare um volume de PEI-SPION/siRNA complexo que é 10% superior a massa total final responsáveis por quaisquer perdas acidentais. Faça PEI-SPION/siRNA complexos em baixa Fe: siRNA rácios, em que moléculas de siRNA são completamente carregadas na PEI-SPIONs e, portanto, pequenas quantidades de PEI-SPIONs podem ser usadas para minimizar a citotoxidade potencial. Experiências piloto (ensaio de retardo de gel), para a otimização da relação de Fe: siRNA são necessárias.
  9. Retire a placa de 6 da incubadora (etapa 3.7). Adicionar um volume necessário de PEI-SPION/siRNA complexo gota a gota a cada poço e agite a placa cautelosamente para garantir uma distribuição uniforme. Devolve a chapa para a incubadora até o balanço do celular absorção ou gene "knockdown" eficiência (1-3 d).
    Nota: Transfecting macrófagos com PEI-SPION/siRNA em uma concentração de ~ 15 μg Fe/mL podem maximizar a eficiência de transfeccao minimizando a citotoxidade potencial.

4. sistêmica entrega de siRNA para macrófagos em ratos com artrite Experimental

  1. Obter ratos da linhagem Wistar masculinos isentos de organismos patogénicos específicos que são 7 semanas de idade. Se habituar os ratos para 7 d antes da utilização e fornecê-los com água e uma alimentação adequada. Induzi a artrite adjuvante (AA) de ratos como descrito anteriormente,18.
  2. Prepare-se complexos de PEI-SPION/siRNA conforme descrito na etapa 3.8.
  3. Injete o NPs PEI-SPION/siRNA (0,3 mg de siRNA/kg) a AA ratos através da veia da cauda. Avaliar a absorção celular através de, por exemplo, citometria de fluxo, tecido biodistribuição através de, por exemplo, uma sistema, de imagem em tempo real da fluorescência ou efeitos terapêuticos com base em, por exemplo, clínica, radiográfica e histológica 18pontos de análises no tempo desejado.
    Nota: Para estudos de biodistribuição celular e tecidos, tratar os ratos com uma única injeção do NPs desejado; para estudos terapêuticos, injete os ratos com o NPs para ser testado 1x por semana durante três semanas consecutivas.

Resultados

O tamanho e a zeta potencial de PEI-SPIONs preparado com este protocolo foram na faixa de 29-48 nm (índice de polidispersividade: 0.12 - 0,23) e 30-48 mV, respectivamente. Eles estavam estáveis em água a 4 ° C por mais de 12 meses sem agregação óbvia. Para avaliar sua capacidade de vinculação de siRNA, PEI-SPIONs foram misturadas com siRNA em várias relações de peso de Fe: siRNA. A Figura 1 mostra que quando a relação de peso de Fe: siRNA atinge...

Discussão

Os macrófagos são refratários a transfect por abordagens nonviral comumente usadas, como espécie de lipídios, lipossomas catiônicos e eletroporação. Aqui nós descrevemos um método confiável e eficiente para transfect macrófagos com siRNA. Utilizando o presente protocolo, mais 90% dos macrófagos, como 264.7 pilhas (Figura 2B) e de macrófagos peritoneais de ratos18 pode ser transfected com siRNA sem deterioração significativa da viabilidade celular. Esse...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo programa de desenvolvimento da China (n. º 2017YFA0205502) e nacional chave de pesquisa e a Fundação Nacional de ciências naturais da China (81772308).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMGibcoC11995500BTWarm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serumGibcoA31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml)Gibco15140122
Tetrazolium-based MTS assay kitPromegaG3582For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell lineCell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, ChinaTCM13
Tissue culture plates (6-well)Corning3516
Tissue culture dishes (10 cm)Corning430167
RNase-free tubes (1.5 ml)AXYGENMCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml)Corning430791
TrypsinGibco25200-056
Wistar ratsShanghai Experimental Animal Center of Chinese
Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powderNational
Institutes for Food and Drug Control, China		for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNAGenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNARiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa)Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.E107079
Ammonia waterAladdin Chemical Reagent Co., Ltd.A112077
Oleic acidAladdin Chemical Reagent Co., Ltd.O108484
DimethylsulfoxideAladdin Chemical Reagent Co., Ltd.D103272
FeSO4•7H2OSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012118
FeCl3•6H2OSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10011918
Dimercaptosuccinic acidAladdin Chemical Reagent Co., Ltd.D107254
ultrafiltration tubeMilliporeUFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solutionAladdin Chemical Reagent Co., Ltd.T100882
Particle size and zeta potential analyzerMalvern, EnglandNano ZS90

Referências

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