在研究隐球菌-阿米巴相互作用中,显微技术和荧光读数的补充应用

摘要

本文详细介绍了利用静止光图像和高分辨率透射电子显微镜图像进行制备隐球细胞和阿米巴共同培养的协议。此处说明定量数据如何补充此类定性信息。

摘要

为了模拟隐球菌感染,阿米巴是环境中隐球细胞的天然捕食者,可以作为巨噬细胞的模型。这种食肉生物,类似于巨噬细胞,利用噬菌体杀死内化细胞。借助共聚焦激光扫描显微镜,可以捕获描述隐球细胞和阿米巴之间交互时刻的图像。电子显微镜的分辨率也有助于揭示隐球细胞的超结构细节,当被困在阿米巴食物真空中时。由于噬菌体是一个连续的过程,因此定量数据随后被集成到分析中,以解释捕获图像的时间点时发生的情况。具体来说,读取相对荧光单位是为了量化阿米巴在隐球细胞内化中的效率。为此,隐球细胞被染色的染料,使他们荧光一旦被困在食物的酸性环境中。当一起使用时,通过此类技术收集的信息可以提供关键信息,以帮助得出细胞在阿米巴内部化时以及可能由其他噬菌体细胞内化时的行为和命运的结论。

引言

微生物经过一段时间的进化,在不同的生态区中占据并茁壮成长,如土壤和水的开放物理边界,^等等。在这些利基中,微生物往往直接争夺有限的资源;重要的是,对于营养,他们用来支持他们的生长或空间,他们需要容纳不断扩大的人口2,3。在某些情况下,一些霍洛索生物,如阿米巴甚至可能早于隐球细胞,作为从生物量4,5中提取营养物质的一种方式。反过来,这允许这些生物通过控制猎物的数量来确立领土优势。由于这种掠夺性压力,一些猎物可能被选择来产生微生物因子,如隐球胶囊6,以调和压力的负面影响。然而,作为这种压力的意外后果,一些微生物获得一些因素,使它们能够跨越物种屏障,寻找新的利基来殖民7,如人体的封闭空间,富含营养,具有理想条件。后者可以解释陆地微生物如何像隐球菌(C.新福曼人可以转化为致病性。

为此,必须研究隐球细胞与阿米巴的初始接触,以及如何选择它们成为致病菌。更具体地说,这可能为隐球细胞在感染期间受到巨噬细胞作用时的行为提供线索。正是出于这个原因,阿米巴被选为这里巨噬细胞的模型,因为它是相对便宜和容易保持阿米巴文化在实验室8。感兴趣的也是研究隐球菌二次代谢物(即3-羟基脂肪酸9,10)如何影响阿米巴和隐球细胞之间的相互作用。

用肉眼感知阿米巴和猎物之间的相互作用的一种简单方法是在琼脂盘表面使用猎物创建草坪,并发现阿米巴。琼脂板上的斑块或透明区域的可视化描绘了阿米巴可能以猎物为食的区域。然而,在这个宏观层面上,只注意到这一进程的结果,并且不能观察到噬菌体过程是机械化的。因此,为了在细胞到细胞的基础上欣赏这个过程,有几种微观方法可以使用11,12。例如,带孵化室的倒置显微镜可用于视频记录噬菌细胞与其^目标13之间的事件延时。不幸的是,由于具有延时功能的显微镜的成本,实验室并不总是能够购买这种显微镜,尤其是在资源贫乏的环境中。

为了规避上述限制,本研究提出了一个顺序探索设计,评估C.新福曼斯(C.新福曼斯UOFS Y-1378)和C.新福曼斯LMPE 046与阿坎塔莫埃巴·卡斯特拉尼的相互作用.首先,使用在定量方法之前的定性方法。静止图像使用倒置荧光显微镜以及透射电子显微镜拍摄,以描绘阿米巴-隐球菌相互作用。随后,使用板读取器对荧光进行量化,以估计阿米巴将隐球细胞内化的效率。在数据解释阶段协调这些方法的发现时,这可能与浏览方位体延时视频一样多的关键信息。

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研究方案

隐球新毒杆菌和一些阿坎塔莫埃巴卡斯特兰尼菌株被视为生物安全-2级(BSL-2)病原体;因此,研究人员在使用这些生物时必须采取适当的预防措施。例如,实验室人员应接受专门的培训和个人防护设备 (PPE),如实验室外套、手套和眼睛防护。生物安全柜(2级)应用于可能导致感染^{的程序14。}

1. 真菌细胞的培养和标准化(从Madu等人改^性15)

1. 在酵母-肽-dextrose (YPD) 琼脂板上从库存培养物(不超过 9 个月)中分离出测试真菌菌株(即 C.新福曼 S UOFS Y-1378 和C. 新福曼LMPE 046)。有关YPD琼脂的成分资料,见表1。
   注:C.新福曼UOFS Y-1378 已被证明能产生 3 羟基脂肪酸,而C. 新福曼LMPE 046 不产生 3 羟基脂肪酸。有关如何确定这些分子存在的信息,请参阅补充文件1。
2. 在30°C下孵育琼脂板48小时。
   注:一个盘子可以在4°C下储存长达2个月,然后被丢弃或用于制作股票^培养16。
3. 从 48 h 型旧板中刮去一圈隐球细胞(C.新福利斯UOFS Y-1378 或C. 新福曼LMPE 046),并接种到含有 100 mL 化学定义的 YNB 溴 (6.7 g/L) 的 250 mL 环形烧瓶中,并辅以 4% (w/v) 葡萄糖。有关YNB肉汤成分的资料,见表2。
4. 在 30°C 下孵育烧瓶 24 小时,同时在旋转摇床上以 160 rpm 的转速搅拌。
5. 在24小时孵育期后,使用血细胞计计算真菌细胞,并将细胞数调整为1 x 10⁶细胞/mL,PBS为pH 7.4。
   注: 在步骤 3.1 和 3.2 中使用制备的C. 新福曼 S OfOFS Y-1378 接种,而C. 新福曼LMPE 046 接种仅在步骤 3.2 中使用。

2. 阿米巴细胞的培养和标准化(从Madu等人改^性15)

1. 解冻阿坎塔莫埃巴卡斯特莱尼的种群文化,并将其带到室温(RT)。
   注:阿莫埃巴是根据阿克塞尔松-奥尔松^等人8和舒斯特17的修改协议编制的。
2. 将1mL的解冻培养液注入50 mL离心管中,该管含有15 mL的ATCC介质712。有关ATCC介质712成分的资料,见表3。
3. 手动轻轻摇动,并立即在 400 x g和 30 °C 下离心 5 分钟。
4. 吸气上清液。
5. 在ATCC介质712的15 mL中重新悬浮细胞,并在30°C下孵育管14天。
   注:使用简单的光学显微镜定期检查细胞,以确定它们是否处于营养学状态。一旦他们处于营养状态,开始一种新鲜的文化。
6. 移液器 1 mL 的培养基,显示细胞处于营养动物状态,并用它来接种含有 15 mL 新鲜无菌 ATCC 介质 712 的无菌 50 mL 离心管。
7. 在 30°C 下孵育管 1 周,同时在旋转摇床上以 160 rpm 搅拌。
8. 一周后,使用血细胞计计算阿米巴细胞,并使用新鲜无菌 ATCC 培养基 712 将细胞数调整为 1 x 10⁷细胞/mL。
9. 使用斯特罗^伯18详细详述的锥蓝色染色进行可行性测定。进一步处理至少具有 80% 生存能力的文化。

3. 细胞的荧光染色,以研究噬菌体(从Madu^等人15中修饰)

1. 使用荧光显微镜收集定性数据
   注:使用阿坎塔莫伊巴·卡斯特兰尼和C.新福曼斯UOFS Y-1378执行此测定。
   1. 将200μL的标准化阿米巴悬浮液(ATCC培养基712中的1 x 10⁷细胞/毫升)放入粘附滑动室井中,在30°C下孵育2小时,使细胞粘附在表面。
   2. 当阿米巴细胞沉降以粘附时,在 1.5 mL 塑料管中用 1 μL 的氟素异异酸酯染色标准化 C.新福曼UOFS Y-1378 细胞,这些细胞被调整为 1 x 10⁶细胞/mL(在 PBS 的 999 μL 中)。
      注:在1mL丙酮中溶解1毫克的氟西辛异酸酯,制备污渍。
   3. 在 50 rpm 设置的轨道摇床上轻轻搅拌C. 新福曼UOFS Y-1378 电池,在 RT 和黑暗中设置 2 小时。
   4. 2小时后,在960 x g下在30°C下将离心机5分钟,以颗粒细胞。
   5. 吸出上清液,去除带有污渍的PBS。
   6. 将 1 mL 的 PBS 添加到管中,用于清洗细胞颗粒。通过轻轻移液清洗细胞。
   7. 在30°C下以960 x g将细胞离心5分钟。丢弃上清液。再重复一次洗涤步骤。
   8. 在1mL的PBS中重新悬浮洗涤的细胞。
   9. 将染色的C.新福曼SOFS Y-1378细胞的200μL悬浮液分到含有未染色阿米巴细胞的井中。
   10. 在30°C下孵育制备的共同培养,再育育2小时。
       注:可以针对不同的时间点孵育共体,以适应实验的目的。
   11. 在共同孵化期结束时,吸出井中的内容。
   12. 向井中加入 300 μL 的 PBS,以清洗腔室井并去除任何未结合的共培养细胞。通过温和的移液执行此操作。吸气井的内容。再重复一次洗涤步骤。
   13. 在97 mL蒸馏水中加入3 mL谷醛,制备3%谷醛溶液。
   14. 通过在腔室井中加入250μL的3%溶液并孵育1小时,修复共培养的细胞。
   15. 从步骤 3.1.13 中详细分析了固定剂并清洗室井。
   16. 使用与造型室幻灯片一起提供的工具拆卸造型室井。
   17. 在幻灯片中加入一滴抗褪色化合物,1,4-二甲酰亚克洛-[2.2.2]-辛烷,以防止自动漂白。盖上盖板,用指甲油密封两侧,防止蒸发。
   18. 使用共聚焦激光扫描显微镜的100x物镜(带油)查看共培养细胞。
       注:在明场和荧光中拍摄照片以查看阿米巴和隐球细胞之间的相互作用非常重要。只要有可能,荧光可以叠加到明亮的场图像上。阿米巴细胞通常尺寸较大(即45-60 μm),而营养动物细胞的形状不规则。隐球细胞直径为5-10μm,具有球状到卵形。当暴露于激光中时,未染色的阿米巴细胞可能会发出自动荧光。有关减少自荧光的方法,请参阅 Beisker 和 Dolbeare¹⁹以及克兰西和考勒^20。
2. 使用荧光板读取器获取定量数据
   注:使用Acanthamoeba castellanii和C. 新福曼UOFS Y-1378 或C. 新福曼LMPE 046 执行此测定。
   1. 将100μL的标准化阿米巴悬浮液(在ATCC介质712中调整至1 x 10⁷细胞/毫升)放入黑色粘附96孔微ititer板中。
   2. 在30°C下孵育板2小时,使阿米巴细胞粘附在表面。
   3. 当阿米巴细胞沉降以粘附时,在 1.5 mL 微离心管中用 1 μL 的 pHrodo 绿色 Zymosan A 生物颗粒染色标准化 C.新福曼UOFS Y-1378 细胞,这些细胞被调整为 1 x 10⁶细胞/mL(在 PBS 的 999 μL 中)。染色 C.新福曼LMPE 046 细胞以及单独的管。
      注:与FITC不同,染料选择性地染色被困在咽食^{细胞21、22}的酸性环境中的细胞。对于此技术,在中性pH (PBS) 和阿米巴的中性pH(ATCC介质712)介质中保持隐球菌细胞非常重要。具有酸性环境的介质将导致相对荧光单位的假阳性读数,这意味着更多的隐球已内化。
   4. 在 50 rpm 设置的轨道摇床上轻轻搅拌隐球细胞,在 RT 和黑暗中为 2 小时。
   5. 2小时后,在960 x g下将微离心管离心5分钟,在30°C下对细胞进行颗粒。吸出上清液,去除带有污渍的PBS。
   6. 将1 mL的PBS添加到管中,以洗涤颗粒细胞。通过温和的移液清洗细胞。
   7. 在30°C下以960 x g将细胞离心5分钟。丢弃上清液。再重复一次洗涤步骤。
   8. 在1mL的PBS中重新悬浮洗涤细胞的颗粒。
   9. 将染色的隐球菌细胞的100μL悬浮液分给含有未染色阿米巴细胞的井。
   10. 在30°C下孵育制备的共同培养,再育育2小时。
       注:可以针对不同的时间点孵育共文化,以适应实验的目的。
   11. 在共同孵育期结束时,测量微孔板读取器上的荧光。将对数信号转换为相对荧光单位。
       注:染料的激发在492nm,发射在538nm。有关减少自荧光的方法,请咨询 Beisker 和 Dolbeare¹⁹和克兰西和考勒^20。

4. 利用透射电子显微镜研究噬菌体(从范威克和温^菲尔德23修改)

1. 在ATCC培养基712中,将阿米巴悬浮液(调整至ATCC培养基712中为1 x 10⁷细胞/毫升)加入15 mL离心管,使其在30°C下沉淀30分钟。
2. 将5mL悬浮液的C.新福曼UOFS Y-1378细胞(在PBS中调整至1 x 10⁶细胞/mL)添加到含有5 mL的标准化阿米巴细胞的同一离心管中。
3. 在 30°C 下让管支架站立 2 小时。
4. 在640 x g下将管在30°C下离心3分钟,以颗粒共培养的细胞。吸气上清液。不要清洗共培养的细胞。
5. 将颗粒重新悬浮在3 mL的1.0 M (pH = 7.0) 磷酸钠缓冲3%谷醛3h,修复共培养细胞。
6. 在1,120 x g下将管在30°C下离心5分钟,以颗粒共培养的细胞。吸气上清液。
7. 在离心管中加入5 mL磷酸钠缓冲液,以清洗颗粒细胞。轻轻移液管内的物品20s。洗涤。
8. 在1,120 x g下将管在30°C下离心5分钟,以颗粒共培养的细胞。
9. 重复步骤 4.8-4.10。吸气上清液。
10. 再次修复共培养的细胞,将颗粒重新悬浮在3 mL的1.0 M (pH = 7.0) 磷酸钠缓冲1%的四氧化二铵1.5小时。
11. 通过以与去除 3% 谷醛类似的方式清洗共培养的细胞,去除固定性(四氧化二氮)。
12. 在30%、50%、70%、95%和两个100%的分级丙酮系列中脱水TEM材料(也称为共培养细胞),每次15分钟。为此,向颗粒细胞中加入3 mL的丙酮溶液,让它站立15分钟。然后,在RT丢弃上清液时以200 x g离心10分钟,并加入更高百分比的丙酮溶液。
13. 根据24号方案制备正常一致性的环氧树脂。
    注:环氧树脂用于切片。
14. 将 TEM 材料嵌入新鲜制备的环氧树脂中。为此,请按照以下步骤操作。
    1. 将3 mL的新鲜制备环氧树脂加入含有3 mL 100%丙酮溶液的TEM材料的管中。让管子站立 1 小时。
    2. 在 30°C 下将管在 200 x g下离心 10 分钟。吸气环氧丙酮溶液。
    3. 将6 mL的新鲜制备环氧树脂加入管中的颗粒中。让管子站立 1 小时。
    4. 在 200 x g下在 30°C 下离心 10 分钟。吸气所有环氧丙酮溶液。
    5. 将3 mL的新鲜制备的环氧树脂添加到管中。让管子站立 8 小时。
    6. 在 200 x g下在 30°C 下离心 10 分钟。吸气所有环氧溶液
    7. 将3 mL的新鲜制备的环氧树脂添加到管中。将 TEM 材料放在环氧溶液中过夜,放在真空干燥器中。
       注意:环氧树脂是一种放射性物质。使用 PPE 处理环氧树脂。环氧树脂也应在烟气罩中处理。研究人员应遵循安全规定,丢弃每个国家规定的^材料25。
15. 在70°C下聚合TEM材料8小时。
16. 在超微缩体上,使用安装的玻璃刀从环氧嵌入材料中修剪厚度约为 0.1 mm x 0.1 mm 和 60 nm 的小块。在网格上组装截面,在染色前将网格放在 TEM 样品保持框中。
17. 在黑暗中用6%的醋酸酸酯染色10分钟。确保完全覆盖各个部分。
    注:在100 mL蒸馏水中重新形成污渍(6 g)。
    注意:醋酸尿酸是一种放射性物质。使用 PPE 处理醋酸尿酸。乌兰醇醋酸酯也应处理在烟气罩。研究人员应遵循安全规定,丢弃每个国家规定的^材料25。
18. 将部分水浸入含有 100 mL 蒸馏水的烧杯中,冲洗部分。
    注:蒸馏水应相应地处理,因为它含有醋酸乙酯的微量。
19. 在黑暗中用铅酸盐染色10分钟。确保完全覆盖各部分。
    注:铅酸盐应按照^雷诺26号协议制备。
20. 将部分水浸入含有 100 mL 蒸馏水的烧杯中,冲洗部分。
21. 在 TEM 样品架盒上单独组装带有染色部分的网格。
22. 使用透射电子显微镜查看部分。

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结果

微生物是肉眼无法感知的微生物。然而,它们的影响可能导致可观察到的临床明显疾病,如皮肤感染。在研究微生物的某些方面时,从微生物的形态、副产品和相互作用,能够提供图片和视频证据至关重要。

我们首先试图可视化隐球细胞和阿米巴之间的相互作用。为此,首先研究了显示2小时共育细胞的明亮场图像。一张图片显示一?...

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讨论

在本文中,成功地使用了不同的技术来揭示当阿米巴与隐球菌细胞相互作用时可能出现的结果。此外,我们有兴趣展示3-羟基脂肪酸对隐球菌-阿米巴相互作用结果的影响。

第一种技术是共聚焦显微镜,它渲染静止图像。此处此技术的主要缺点是,它只为我们提供了仅限于特定时间点的信息。任何可以根据结果得出的结论都有助于归纳推理,其中人们可以根据一组观察

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane	Sigma-Aldrich	D27802	-
1.5-mL plastic tube	Thermo Fisher Scientific	69715	-
15-mL Centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	7252018	-
50-mL Centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	1132017	-
8-Well chamber slide	Thermo Fisher Scientific	1109650	-
Acetone	Merck	SAAR1022040LC	-
Amoeba strain	ATCCÒ	30234TM	-
ATCC medium 712	ATCCÒ	712TM	Amoeba medium
Black 96-well microtiter plate	Thermo Fisher Scientific	152089	-
Centrifuge	Hermle	-	-
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	-
Confocal microscope	Nikon	Nikon TE 2000	-
Epoxy resin:
[1] NSA	[1] ALS	[1] R1054	-
[2] DER 736	[2] ALS	[2] R1073	-
[3] ERL Y221 resin	[3] ALS	[3] R1047R	-
[4] S1 (2-dimethylaminoethanol)	[4] ALS	[4] R1067	-
Fluorescein isothiocyanate	Sigma-Aldrich	F4274	-
Formic Acid	Sigma-Aldrich	489441	-
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Fisher Scientific	374-91038C	Microplate reader
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	-
Glutaraldehyde	ALS	R1009	-
Hemocytometer	Boeco	-	-
Lead citrate	ALS	R1209	-
Liquid Chromatography Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific		-
Methanol	Sigma-Aldrich	R 34,860	-
Orbital shaker	Lasec	-	-
Osmium tetroxide	ALS	R1015	-
pHrodo Green Zymosan A BioParticles	Life Technologies	P35365	This is the pH-sensitive dye
Physiological buffer solution	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB	-
Rotary shaker	Labcon	-	-
Sodium phosphate buffer:
[1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate	[1] Merck	[1] 106580	-
[2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate	[2] Merck	[2] 106345
Transmission electron microscope	Philips	Philips EM 100	-
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154	-
Ultramicrotome	Leica	EM UC7	-
Uranyl acetate	ALS	R1260A	-
Vacuum dessicator	Lasec	-	-
Vial	Sigma-Aldrich	29651-U	-
YNB	Lasec	239210	-
YPD agar	Sigma-Aldrich	Y-1500	-