JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu yazıda hala, floresan görüntüler ve yüksek çözünürlüklü iletim elektron mikroskop görüntüleri kullanılarak incelenmiştir kripokal hücreler ve amipler bir ortak kültürü hazırlamak için bir protokol ayrıntıları. Burada gösterildiği gibi nicel veriler bu tür niteliksel bilgileri tamamlayabilir.

Özet

Kripokus enfeksiyonunu simüle etmek için, ortamdaki kripokal hücrelerin doğal yırtıcı olan Amoeba, makrofajlar için bir model olarak kullanılabilir. Bu yırtıcı organizma, makrofajlar benzer, dışkılmış hücreleri öldürmek için fagositoz istihdam. Konfeti lazer tarama mikroskobu yardımıyla, kripokal hücreler ve anipin arasındaki interaktif anları tasvir eden görüntüler yakalanır. Elektron mikroskobu çözünürlük gücü, aynı zamanda, amip gıda vakum içinde sıkışıp zaman kripokal hücrelerin ultrastran detay açığa yardımcı olur. Fagositoz sürekli bir süreçtir olduğundan, nicel veriler daha sonra bir görüntü yakalanır zaman noktasında ne olduğunu açıklamak için analiz entegre edilir. Spesifik olmak için, kripokal hücrelerde ayipliğin verimliliğini ölçmek için göreceli floresans üniteleri okunur. Bu amaçla, kriptozal hücreler onları bir kez gıda vakidinin asidik çevre içinde sıkışıp floresan kılan bir boya ile lekelenmiş. Birlikte kullanıldığında, bu tür teknikler aracılığıyla toplanan bilgiler, diğer fagositik hücreler tarafından, belki de, amip tarafından ve, muhtemelen, davranış ve hücrelerin kaderi üzerine sonuçlar çekmeye yardımcı olmak için kritik bilgiler sağlayabilir.

Giriş

Mikroplar, toprak ve suyun açık fiziksel sınırları gibi farklı ekolojik niceler içinde işgal ve gelişmek için zaman içinde evrimleşmiş, diğerleri arasında1. Bu niş, mikroplar genellikle sınırlı kaynaklar için doğrudan rekabet meşgul; önemlisi, onlar genişleyen nüfus2,3karşılamak için gereken onların büyüme veya boşluk, desteklemek için kullanılan besin için. Bazı durumlarda, amip gibi bazı holozotik organizmalar, biyokütle4,5' ten besin çıkarma yolu olarak kripokal hücrelerde bile öncesine olabilir. Buna göre, bu tür organizmaların avının nüfus numaralarını kontrol ederek toprak hakimiyeti kurmayı sağlar. Bu yırtıcı basınç nedeniyle, bazı av mikrobiyal faktörler üretmek için seçilebilir, örneğin kripokel kapsül6, basınç olumsuz etkilerini karşılaştırmak için. Ancak, bu basıncının istenmeyen bir sonucu olarak, bazı mikroplar türler bariyerini geçmek ve yeni niş aramak için izin faktörler elde 7, kolonize etmek içinyedi, besin zengin ve ideal olan insan vücudunun sınırlı alanlar gibi Koşul -ları. İkincisi nasıl bir karasal mikrobe gibi açıklamak olabilir Kripokus (C.) neoformanlar patojenik olmaya dönüşebilir.

Bu amaçla, kripokal hücrelerin amip ile olabilir ve bu onları patojen olmak için nasıl seçebilir ilk temas çalışması önemlidir. Daha spesifik olarak, bu kripokal hücrelerin enfeksiyon sırasında makrofajlar üzerine hareket ettiğinde nasıl davrandığını hakkında ipuçları verebilir. Bu nedenle, bir laboratuar8' de bir asit kültürünü korumak için nispeten ucuz ve kolay olduğu için, bu nedenle, burada makrofajlar için bir model olarak seçildi. Ayrıca nasıl kripokal ikincil metabolitleri incelemek için ilgi oldu. 3-hidroksi yağ asitleri9,10 amipler ve kripokal hücreler arasındaki etkileşimi etkiler.

Ayağın ve avının çıplak gözle arasındaki etkileşimi algılayanın basit bir yolu, bir agar plaka ve spot amip yüzeyinde avını kullanarak bir çim yaratmaktır. Agar plakasında plaklar veya net bölgelerin görselleştirilmesi, avında amoipin beslenmesi gereken alanları tasvir eder. Ancak, bu makro düzeyinde, yalnızca işlemin sonucu belirtilir ve fagositoz sürecinin mekanize edilmesi görülmez. Bu nedenle, hücre-hücre temelinde süreci takdir etmek için,11,12kullanılabilecek birkaç mikroskobik yöntemler vardır. Örneğin, bir inkübasyon odası ile ters bir mikroskop bir fagositik hücre ve hedef13arasındaki olayların zaman aşımı video kayıt için kullanılabilir. Ne yazık ki, bir zaman atlamalı işlevselliği ile mikroskop maliyeti nedeniyle, laboratuvarlar özellikle kaynak yoksul ayarları, böyle bir mikroskop satın almak için her zaman mümkün değildir.

Yukarıdaki sınırlamanın aşılması için, bu çalışmada c. neoformans , c. neoformans uofs Y-1378 ve c. neoformans Lmpe 046 ile Acanthamoeba Castellani ile etkileşimini değerlendiren sıralı bir araştırmacı tasarım sunulur. . İlk olarak, nicel bir yöntemin önündeki niteliksel bir yöntem kullanılır. Hala görüntüleri ters floresan mikroskop, yanı sıra bir iletim elektron mikroskop kullanarak yakalanır Amoeba-Kripoccus etkileşimleri tasvir. Bu, kripokal hücreleri içerize etmek için ayağın verimliliğini tahmin etmek için bir plaka okuyucusu kullanarak floresans ölçülerek izledi. Veri yorumlama aşamasında bu yöntemlerden gelen bulguları mutabakatın zaman, bu eşit bir fagositoz zaman atlamalı video perusing olarak çok kritik bilgi ortaya çıkabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Kripokus neoformans ve bazı Acanthamoeba castellanii suşları Biyogüvenlik seviyesi-2 (BSL-2) patojenler olarak kabul edilir; Böylece, araştırmacılar bu organizmalar ile çalışırken uygun önlemler almalısınız. Örneğin, laboratuar personeli özel eğitim ve kişisel koruyucu ekipman (PPE) gibi laboratuvar ceket, eldiven ve göz koruması olmalıdır. Enfeksiyona neden olabilecek prosedürler için biyolojik güvenlik dolabı (seviye-2) kullanılmalıdır14.

1. mantar hücrelerin ekimi ve standardizasyonu (Mine ve ark. 15 ' ten değiştirildi)

  1. Test mantar suşları (i.e., c. neoformans uofs Y-1378 ve c. neoformans lmpe 046) stok kültürlerinden (9 aydan büyük olmayan) Maya-peptone-Dextrose (YPD) agar plakaları üzerinde Streak. YPD agar 'ın malzemelerle ilgili bilgiler Tablo 1' de bulunabilir.
    Not: c. neoformans Uofs Y-1378, 3-hidroksi yağ asitleri üretmek için gösterildi, c. neoformans lmpe 046 3-hidroksi yağ asitleri üretemez. Bu moleküllerin varlığının nasıl belirlendiği hakkında bilgi için ek dosya 1 ' e bakın.
  2. 30 °C ' de 48 h için agar plakalarını inkük.
    Not: bir plaka, 4 °C ' de 2 aya kadar saklanabilir ve bir stok kültürü16yapmak için kullanılamaz.
  3. Bir loopful kripokal hücrelerin (c. neoformans uofs Y-1378 veya c. neoformans lmpe 046), 48 h-eski plaka ve aşılamak bir 250 ml konik Flask içine, kimyasal olarak tanımlanan YNB suyu (100 g/L),% 4 (ile tamamlayıcı olarak 6,7 ml ( w/v) glikoz. YNB suyunun malzemeleri hakkında bilgi Tablo 2' de bulunabilir.
  4. Bir Rotary Shaker üzerinde 160 RPM 'de ajitasyon ederken 24 saat için 30 °c ' de flsorlu kuluçat.
  5. 24 h kuluçk döneminden sonra, bir hemokytometer kullanarak mantar hücreleri saymak ve pH 7,4 PBS ile 1 x 106 hücreler/ml hücre numarasını ayarlayın.
    Not: hazırlanan c. neoformans uofs Y-1378 inokulumunu, 3,1 ve 3,2 adımda kullanıldı ve c. neoformans lmpe 046 inokulumunu sadece adım 3,2 ' de kullanıldı.

2. amip hücrelerinin ekimi ve standardizasyonu (Mine ve ark. 15 ' ten değiştirildi)

  1. Acanthamoeba castellanii 'nin bir hisse senedi kültürünü çözün ve oda sıcaklığına (RT) getirin.
    Not: Amoeba, Axelsson-Olsson ve al.8 ve Schuster17' nin değiştirilmiş protokollerine göre hazırlanmıştır.
  2. Çözülmüş kültürün 1 ml pipet ve 15 ml ATCC orta 712 içeren bir 50 ml Santrifüjlü tüp içine aşılamak. ATCC Medium 712 ' in malzemeler hakkında bilgi Tablo 3' te bulunabilir.
  3. Manuel olarak hafifçe sallayın ve hemen 400 x g ve 30 °c ' de 5 dakika santrifüjün.
  4. Süpernatant aspirate.
  5. Hücreleri 15 mL 'Lik ATCC orta 712 ' de yeniden resuspend ve 14 gün boyunca 30 °C ' de tüpü inkük etmek.
    Not: bir trophozoite durumunda olup olmadığını belirlemek için, basit bir ışık mikroskobu kullanarak hücreleri düzenli olarak kontrol edin. Bir kez onlar bir trophozoite devlet, yeni bir kültür başlatın.
  6. Pipet 1 ml bir trophozoite durumu hücreleri gösteren bir kültürden ve steril 50 ml Santrifüjü tüp 15 ml taze, steril ATCC orta 712 içeren aşılamak için kullanın.
  7. Bir Rotary Shaker üzerinde 160 RPM 'de ajitasyon ederken 1 hafta boyunca 30 °c ' de tüp inküye.
  8. Bir hafta sonra, bir hemokytometer kullanarak amip hücreleri saymak ve 1 x 107 hücreler/ml taze, steril ATCC orta 712 ile hücre numarasını ayarlayın.
  9. Strober18tarafından ayrıntılı olarak bir tripan mavi leke kullanarak bir canlılığı tahlil gerçekleştirin. En az 80% viability gösteren kültürler ile daha fazla devam edin.

3. phagositoz çalışması için hücrelerin floresan boyama (minik ve al. 15 ' ten değiştirildi)

  1. Floresan Mikroskobu kullanılarak niteliksel veri toplama
    Not: Acanthamoeba castellanii ve C. neoformans uofs Y-1378 ile bu tahlil gerçekleştirin.
    1. Standart amipler 'nin 200-μL süspansiyonunu (ATCC orta 712 'de 1 x 107 hücre/ml), yapışan bir kaydırakta bulunan oda kuyularına dağıtın ve hücrelerin yüzeye uyması için 30 °c ' de 2 saat boyunca inküye yapın.
    2. Amip hücreleri uyum için aşağı yerleşiyor iken, 1 x 106 hücreler/ml (999 μL PBS) için ayarlanmış standardize C. neoformans uofs Y-1378 hücreleri leke bir 1,5 ml plastik tüpte 1 μL fluorcein isothiocyanate.
      Not: 1 mL aseton içinde 1 mg florcein isothiocyanate çözünerek leke hazırlayın.
    3. C. neoformans Uofs Y-1378 hücrelerini, 50 RPM 'de, RT 'de ve karanlıkta 2 saat boyunca bir orbital Shaker üzerinde yavaşça karıştırır.
    4. 2 saat sonra, 30 °C ' de 5 dakika için 960 x g 'de santrifüjler hücreleri Pelet.
    5. Leke ile PBS kaldırmak için süpernatant aspirate.
    6. Hücre Pellet yıkamak için tüp PBS 1 mL ekleyin. Hücreleri hafifçe pipetleme ile yıkayın.
    7. 960 x g 'de hücreleri 30 °c ' de 5 dakika santrifüjler. Süpernatant atın. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
    8. 1 mL PBS içinde yıkanmış hücreleri resuspend.
    9. Lekeli C. neoformans uofs Y-1378 hücrelerinin 200 μL süspansiyonunu, lekelenmiş amip hücrelerini içeren oda kuyularına dağıtın.
    10. Hazırlanan Co-Culture ' ı 30 °C ' de 2 saat daha ek bir süre için kulbe etme.
      Not: ortak kültür, denemenin amacına uyacak şekilde farklı zaman noktaları için inkübe edilebilir.
    11. Co-inkübasyon döneminin sonunda, kuyuların içeriğini Aspire.
    12. Oda kuyularını yıkamak ve ilişkisiz ortak kültürlü hücreleri kaldırmak için kuyulara 300 μL PBS ekleyin. Bunu nazik pipetleme ile yapın. Kuyuların içeriğini aspirate. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
    13. 97 mL distile su için 3 mL glutaraldehit ekleyerek% 3 glutaraldehit solüsyonu hazırlayın.
    14. Oda kuyularına% 3 solüsyon 250 μL ekleyerek ve 1 saat boyunca kulyatan, Co-kültürlü hücreleri düzeltin.
    15. Fiktatif aspirate ve adım 3.1.13 ayrıntılı olarak oda kuyuları yıkayın.
    16. Oda kaydırakları ile sağlanan bir aracı kullanarak Oda kuyuları sökmek.
    17. Otomatik ağartma önlemek için slayt için antifade bileşik, 1, 4-diazabicyclo-[2.2.2]-oktan bir damla ekleyin. Bir lamel magazini ile kapak ve buharlaşma önlemek için bir oje ile kenarları mühürleyin.
    18. Konfetli lazer tarama mikroskobu 100 x objektif objektif (yağ ile) kullanarak Co-kültürlü hücreleri görüntüleyin.
      Not: ada ve kripokal hücreler arasındaki etkileşimi görmek için parlak alan ve floresans fotoğraf çekmek önemlidir. Mümkün olan her yerde, floresan parlak alan görüntüleri üzerine süper empoze edilebilir. Amoeba hücreleri genellikle boyutu büyüktür (örn. 45-60 μm) ve trophozoit hücrelerinin düzensiz bir şekli vardır. Kripokal hücreler 5-10 μm çapındadır ve oval şekle sahip bir globose vardır. Bir lazere maruz kaldığında, lekelenmeyen amip hücrelerinin otomatik floresans yayması mümkündür. Bkz. Beisker ve Dolbeare19 ve Clancy ve cauller20 autofluorescence azaltmak için yöntemler için.
  2. Floresans plaka okuyucusunun kullanımı ile nicel verileri edinme
    Not: Acanthamoeba castellanii ve c. neoformans uofs Y-1378 veya c. neoformans lmpe 046 ile bu tahlil gerçekleştirin.
    1. Standart amipler 'nin 100 μL süspansiyonunu (ATCC orta 712 'de 1 x 107 hücreye/ml 'ye ayarlanmış) siyah, yapışmaz 96 iyi mikrotiter plakaya dağıtın.
    2. 2 saat 30 ° c için plakayı inküt, amip hücrelerinin yüzeye uymasını sağlar.
    3. Amip hücreleri uyum için aşağı yerleşiyor iken, 1 x 106 hücreler/ml (999 μL PBS), 1 μL phrodo yeşil zymosan a bioparticles ile ayarlanmış olan standart C. neoformans uofs Y-1378 hücreleri leke bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüp. Leke C. neoformans lmpe 046 hücrelerin yanı sıra ayrı bir tüp.
      Not: boya, fitc aksine, seçici bir fagositik hücre21,22asidik çevre içinde sıkışmış hücreler lekeleri. Bu teknik için, nötr pH (ATCC orta 712) ile bir ortamda nötr pH (PBS) ve amip ile bir orta kripokal hücrelerin korunması önemlidir. Asidik bir ortama sahip bir orta, göreceli floresan birimlerinin yanlış pozitif okunmasına neden olur, daha fazla sayıda kripokal olduğunu ima ediyor.
    4. 50 RPM 'de, RT 'de ve karanlıkta 2 h 'lik bir orbital Shaker üzerinde kripokal hücreleri yavaşça karıştırın.
    5. 2 saat sonra, 960 x g 'de mikrosantrifüjün tüpünü 30 °c ' de 5 dakika boyunca santrifüjler. Leke ile PBS kaldırmak için süpernatant aspirate.
    6. Pelleted hücreleri yıkamak için tüp 1 mL PBS ekleyin. Hücreleri yumuşak pipetleme ile yıkayın.
    7. 960 x g 'de hücreleri 30 °c ' de 5 dakika santrifüjler. Süpernatant atın. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
    8. 1 ml PBS içinde yıkanan hücrelerin Pelet resuspend.
    9. Bir 100 μL, lekelenmiş kripokal hücrelerin lekelenmiş amip hücrelerini içeren kuyulara askıya alınmasını.
    10. Hazırlanan Co-Culture ' ı 30 °C ' de 2 saat daha ek bir süre için kulbe etme.
      Not: ortak kültür, denemenin amacına uyacak şekilde farklı zaman noktaları için inkübe edilebilir.
    11. Co-kuluçş döneminin sonunda, bir Mikroplaka okuyucuda floresans ölçmek. Logaritmik sinyalleri göreli floresan ünitelerinde dönüştürün.
      Not: boya 's uyarma 492 nm ve emisyon 538 nm de. Otomatik netleme azaltmak için Beisker ve Dolbeare19 ve Clancy ve cauller20 yöntemlerine danışın.

4. fagositoz (Van Wyk ve Wingfield 23 değiştirilmiş) çalışma şanzıman elektron mikroskobu kullanımı

  1. Amipler 5 ml süspansiyonu ekleyin (ATCC orta 712 'de 1 x 107 hücreye/ml 'ye ayarlanmıştır) 15 ml santrifüjler tüpüne ve 30 °c ' de 30 dakikaya yerleşmelerine izin verin.
  2. C. neoformans Uofs Y-1378 hücrelerinin 5 ml süspansiyonu ekleyin (PBS 'de 1 x 106 hücrelere/ml 'ye ayarlanır), 5 ml standartlaştırılmış hücresi içeren aynı santrifüj tüpüne ekleyebilirsiniz.
  3. Tüp standında 30 °C ' de 2 saat izin verin.
  4. 640 x g 'de tüpü 30 °c ' de 3 dakika boyunca Santrifüjüne atın. Süpernatant aspirate. Co-kültürlü hücreleri yıkayınız.
  5. 3 mL 1,0 M (pH = 7,0) sodyum fosfat-tamponlu 3% glutaraldehit 3 h için Pelet resuspending tarafından Co-kültürlü hücreleri düzeltin.
  6. Tüp Santrifüjü 1.120 x g Için 30 °c ' de 5 dak. Süpernatant aspirate.
  7. Pelleted hücreleri yıkamak için Santrifüjlü tüpüne 5 mL sodyum fosfat tamponu ekleyin. 20 s için tüpün içeriğini hafifçe pipetleme ile yıkayın.
  8. Tüp Santrifüjü 1.120 x g Için 30 °c ' de 5 dak.
  9. 4.8-4.10 arasındaki adımları yineleyin. Süpernatant aspirate.
  10. 1,0 M (pH = 7,0) sodyum fosfat-tampon 1% osmiyum tetrokid için 1,5 h 3 mL içinde Pelet resuspending tarafından yeniden Co-kültürlü hücreleri düzeltin.
  11. Üç% glutaraldehit kaldırmak için benzer bir şekilde Co-kültürlü hücreleri yıkayarak fiktatif (Osmium tetrokid) çıkarın.
  12. TEM malzemesi (aynı zamanda co-kültürlü hücreler olarak da bilinir)% 30,% 50,% 70,% 95 ve 15 dk her biri için% 100 iki değişiklik, sırasıyla bir dereceli acetoneseries içinde dehydrate. Bunu yapmak için, pelleted hücrelere 3 mL aseton çözeltisi ekleyin ve 15 dakika için stand izin. Daha sonra, RT 'de 10 dakika için 200 x g 'de santrifüjle süpernatant 'ı atın ve aseton çözeltisi yüksek yüzdesini ekleyin.
  13. Düz24ile protokole göre normal tutarlılık epoksi hazırlayın.
    Not: epoksi reçine, sekleme için kullanılır.
  14. TEM malzemesini taze hazırlanmış epoksi reçinesine gömün. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.
    1. Yeni hazırlanmış Epoksi 3 mL, 3 mL% 100 aseton çözeltisi içinde TEM malzeme resuspended içeren bir tüp ekleyin. Tüpün 1 saat boyunca durmasına izin verin.
    2. 30 °C ' de 10 dakika için 200 x g 'de tüpü Santrifüjü. Epoksi-aseton çözeltisi aspirate.
    3. Taze hazırlanmış epoksi 6 ml tüpteki Pelet ekleyin. Tüpün 1 saat boyunca durmasına izin verin.
    4. 200 x g 'de 30 °c ' de 10 dakika Santrifüjü. Tüm epoksi-aseton çözeltisi aspirate.
    5. Taze hazırlanmış Epoksi 3 mL tüp ekleyin. Tüpün 8 saat boyunca durmasına izin verin.
    6. 200 x g 'de 30 °c ' de 10 dakika Santrifüjü. Tüm epoksi çözeltisi aspirate
    7. Taze hazırlanmış Epoksi 3 mL tüp ekleyin. Bir vakum kurutucu içinde bir gecede epoksi çözeltisi TEM malzeme tutun.
      DIKKAT: epoksi reçine radyoaktif bir malzemedir. Epoksi reçine işlemek için KKD kullanın. Epoksi reçine de bir duman kaputu ele alınması gerekir. Araştırmacılar, her ülke tarafından belirtildiği gibi bu tür materyallerin atılması için güvenlik yönetmeliklerine uymalıdır25.
  15. 70 °C ' de 8 saat boyunca TEM malzemesi polimerize edilir.
  16. Ultraticrotome üzerinde, yaklaşık 0,1 mm x 0,1 mm ve 60 Nm kalınlığının küçük bölümlerini monte edilmiş cam bıçaklı epoksi gömülü malzemeden kırpın. Bir kılavuzdaki bölümleri birleştirin ve ızgaraları boya yapmadan önce bir TEM örnek tutucu kutusuna yerleştirin.
  17. Karanlıkta 10 dakika boyunca 6% uranyl asetat bir damla ile bölümler leke. Bölümler tamamen kaplıdır emin olun. |
    Not: 100 mL distile su içinde leke (6 g) yeniden oluşturur.
    DIKKAT: Uranyl asetat radyoaktif bir malzemedir. Uranyl asetat işlemek için KKD kullanın. Uranyl asetat da bir duman kaputu ele alınması gerekir. Araştırmacılar, her ülke tarafından belirtildiği gibi bu tür materyallerin atılması için güvenlik yönetmeliklerine uymalıdır25.
  18. 100 ml distile su içeren bir kabı içine beş kez daldırma ile bölümleri durulayın.
    Not: uranyl asetat izleri içerdiğinden distile su buna göre atılmalıdır.
  19. Karanlıkta 10 dakika kurşun sitrat bir damla ile bölüm leke. Bölümler tamamen kaplıdır emin olun.
    Not: Lead sitrat, Reynold26' nın protokolüne göre hazırlanmalıdır.
  20. 100 ml distile su içeren bir kabı içine beş kez daldırma ile bölümleri durulayın.
  21. Izgaraları, bir TEM örnek tutucu kutusuna lekelenmiş bölümlerle birleştirin.
  22. Şanzıman elektron mikroskobu ile bölümleri görüntüleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Mikroplar, çıplak gözle algılanamaz mikroskobik organizmalar vardır. Ancak, etkileri deri enfeksiyonları gibi gözlemlenebilir klinik olarak belirgin hastalıklar, neden olabilir. Mikropların belirli yönlerini okurken, morfoloji, yan ürünler ve etkileşimler arasında değişen, resim ve video kanıtı sağlamak mümkün olmak çok önemlidir.

İlk olarak kripokal hücreler ve Amoeba arasındaki etkileşimi görselleş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Gazetede, ayip kripokal hücrelerle etkileşirken ortaya çıkabilecek olası sonucu ortaya çıkarmak için farklı teknikler başarıyla kullanıldı. Ayrıca, biz kripto Occussonucu 3-hidroksi yağ asitleri etkilerini göstermek için ilgilendi-Amoeba etkileşimleri.

Kullanılan ilk tekniği, hala görüntüler işlenmiş Konfokal mikroskobu oldu. Bu tekniğin önemli dezavantajı, sadece bize belirli bir timepoint ile sınırlı bilgi veriyordu. Sonuçları dayalı çizilmiş olab...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar, rakip finansal çıkarların olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Çalışma Güney Afrika Ulusal Araştırma Vakfı (Grant numarası: UID 87903) ve serbest Devlet Üniversitesi 'nden bir hibe tarafından destekleniyordu. Ayrıca mikroskopi çalışmalarımız sırasında Pieter Van Wyk ve Hanlie Grobler tarafından sunulan hizmetler ve yardımlar için minnettarız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octaneSigma-AldrichD27802-
1.5-mL plastic tube Thermo Fisher Scientific69715-
15-mL Centrifuge tube Thermo Fisher Scientific7252018-
50-mL Centrifuge tube Thermo Fisher Scientific1132017-
8-Well chamber slideThermo Fisher Scientific1109650-
AcetoneMerckSAAR1022040LC-
Amoeba strainATCCÒ30234TM-
ATCC medium 712ATCCÒ712TMAmoeba medium
Black 96-well microtiter plateThermo Fisher Scientific152089-
CentrifugeHermle--
ChloroformSigma-AldrichC2432-
Confocal microscopeNikonNikon TE 2000-
Epoxy resin:
[1] NSA[1] ALS[1] R1054-
[2] DER 736[2] ALS[2] R1073-
[3] ERL Y221 resin[3] ALS[3] R1047R-
[4] S1 (2-dimethylaminoethanol)[4] ALS [4] R1067-
Fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichF4274-
Formic AcidSigma-Aldrich489441-
Fluoroskan Ascent FLThermo Fisher Scientific374-91038CMicroplate reader
GlucoseSigma-AldrichG8270-
GlutaraldehydeALSR1009-
HemocytometerBoeco--
Lead citrateALSR1209-
Liquid Chromatography Mass SpectrometerThermo Fisher Scientific-
MethanolSigma-AldrichR 34,860-
Orbital shakerLasec --
Osmium tetroxideALSR1015-
pHrodo Green Zymosan A BioParticlesLife TechnologiesP35365This is the pH-sensitive dye
Physiological buffer solutionSigma-AldrichP4417-50TAB-
Rotary shakerLabcon--
Sodium phosphate buffer:
[1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate [1] Merck[1] 106580-
[2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate[2] Merck [2] 106345
Transmission electron microscopePhilipsPhilips EM 100 -
Trypan blue Sigma-AldrichT8154-
UltramicrotomeLeicaEM UC7-
Uranyl acetateALSR1260A-
Vacuum dessicatorLasec --
VialSigma-Aldrich29651-U-
YNBLasec 239210-
YPD agarSigma-AldrichY-1500-

Referanslar

  1. Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
  2. Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
  3. Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629(2014).
  4. Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality? Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
  5. Khan, N. A. Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , Caister Academic Press. Nottingham. (2014).
  6. Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
  7. Casadevall, A., Perfect, J. R. Cryptococcus Neoformans. , ASM Press. Washington D.C. (1998).
  8. Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
  9. Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
  10. Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
  11. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1(2015).
  12. Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
  13. Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196(2013).
  14. Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
  15. Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351(2015).
  16. Smith, D., Onions, A. H. S. The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , CAB International. Wallington. (1994).
  17. Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
  18. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
  19. Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
  20. Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
  21. Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Unit 9, 31 (2010).
  22. Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric Imaging of pH Probes. MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).
  23. van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
  24. Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
  25. Department of Minerals and Energy. Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , Department of Minerals and Energy. Pretoria. (2005).
  26. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
  27. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
  28. Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , Garland Science. New York. (2001).
  29. Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
  30. Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
  31. Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765(2017).
  32. Hayes, B. K., Heit, E. Inductive reasoning 2.0. , Wiley Interdisciplinary Review: Cognitive Science. e1459(2018).
  33. Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonSay 148Kripokusfloresansetkile imlermikroskobikmodelfagositoz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır