JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

נייר זה מפרט פרוטוקול להכנת תרבות שיתוף של תאים cryptococcal ו אמבות כי הוא למד באמצעות עדיין, תמונות פלורסנט ברזולוציה גבוהה שידור תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים. מומחש כאן היא הדרך שבה נתונים כמותיים יכולים להשלים מידע איכותי כזה.

Abstract

כדי לדמות זיהום קריפטוקוקוס , אמבה, אשר הוא טורף טבעי של תאים cryptococcal בסביבה, יכול לשמש כמודל עבור מקרופאגים. זה אורגניזם טורף, דומה מקרופאגים, מעסיקה phagocyציטוזה כדי להרוג תאים הפנימו. בעזרתו של מיקרוסקופ לייזר ממוקד סריקה, תמונות המתארים רגעים אינטראקטיביים בין תאים cryptococcal ו אמבה נלכדים. הכוח החלטה של מיקרוסקופ אלקטרון גם מסייע לחשוף את הפרטים בדיקת אולטרה מבנית של תאים cryptococcal כאשר לכודים בתוך מזון אמבה ולאחר. מאז phagocyציטוזה הוא תהליך רציף, נתונים כמותיים משולבים אז בניתוח כדי להסביר מה קורה בנקודת הזמן כאשר התמונה נלכדה. כדי להיות ספציפיים, יחידות הזריחה יחסית נקראים על מנת לכמת את היעילות של אמבה הפנמה תאים cryptococcal. למטרה זו, תאים cryptococcal מוכתמים בצבע שהופך אותם זרוח פעם לכודים בתוך הסביבה החומצית של המזון ולבולית. כאשר נעשה שימוש יחד, מידע שנאסף באמצעות טכניקות כאלה יכול לספק מידע קריטי כדי לעזור להסיק מסקנות על ההתנהגות ועל גורלם של תאים כאשר הפנפו על ידי אמבה, ואולי, על ידי תאי phagocytic אחרים.

Introduction

החיידקים התפתחו לאורך זמן כדי לכבוש ולשגשג נישות אקולוגיות שונות כגון הגבולות הפיזיים פתוח של הקרקע והמים, בין היתר1. בגומחות אלה, חיידקים לעתים קרובות לעסוק בתחרות ישירה עבור משאבים מוגבלים; חשוב מכך, עבור חומרים מזינים שהם משתמשים בהם לתמיכה בצמיחה או במרחב שלהם, שהם צריכים להתאים לאוכלוסיה המתרחבת2,3. במקרים מסוימים, כמה אורגניזמים הולואיקון כמו אמבה אולי אפילו קדומים על התאים cryptococcal כדרך לחילוץ חומרים מזינים מתוך ביומסה שלהם4,5. בתורו, זה מאפשר אורגניזמים כאלה להקים שליטה טריטוריאלית באמצעות שליטה על מספר האוכלוסייה של טרפו. בגלל הלחץ הטורף הזה, אפשר לבחור טרף כדי לייצר גורמים מיקרוביאלית, כמו כמוסה הקריפטוקוקאל6, כדי ליישב את ההשפעות השליליות של הלחץ. עם זאת, כתוצאה בלתי מכוונת של לחץ זה, כמה חיידקים לרכוש גורמים המאפשרים להם לחצות את מחסום המינים ולחפש נישות חדשות ליישב7, כמו חללים סגורים של גוף האדם כי הם עשירים בחומרים מזינים יש אידיאלי תנאים. האחרון עשוי להסביר כיצד חיידק יבשתי כמו קריפטוקוקוס (C.) נאופורמנים יכולים להפוך. להיות פתוגניים

לשם כך, חשוב ללמוד את הקשר הראשוני כי תאים cryptococcal עשוי להיות עם אמבה וכיצד זה יכול לבחור אותם להיות פתוגניים. באופן ספציפי יותר, זה עשוי לתת רמזים על איך תאים cryptococcal להתנהג כאשר פעלו על ידי מקרופאגים במהלך הזיהום. זה בגלל הסיבה כי אמבה נבחרה כמודל עבור מקרופאגים כאן, כפי שהוא זול יחסית קל לשמור על תרבות של אמבה במעבדה8. העניין היה גם לבדוק כיצד הקריפטוקותא משנית משני מטבוליטים. 3-חומצות שומן הידרורוקסי9,10 להשפיע על האינטראקציה בין אמבות ותאי cryptococcal.

דרך פשוטה של תפיסת האינטראקציה בין אמבה וטרפו עם עין בלתי היא ליצור מדשאה באמצעות טרפו על פני השטח של צלחת אגר ואמבה ספוט. ויזואליזציה של לוחיות או אזורים ברורים על צלחת אגר מתאר אזורים שבהם אמבה אולי ניזון טרף שלה. עם זאת, ברמת מאקרו זו, רק את תוצאת התהליך הוא ציין, והתהליך של phagocyציטוזה הוא ממוכן לא ניתן לצפות. לכן, כדי להעריך את התהליך על בסיס תא-לתא, ישנן מספר שיטות מיקרוסקופיים שניתן להשתמש בהן11,12. לדוגמה, מיקרוסקופ הפוך עם תא דגירה יכול לשמש להקליט וידאו לשגות זמן של אירועים בין תא phagocytic היעד שלה13. למרבה הצער, בשל העלות של מיקרוסקופ עם פונקציונליות זמן לשגות, זה לא תמיד אפשרי מעבדות לרכוש כזה מיקרוסקופ, במיוחד במשאבים עניים-הגדרות.

כדי לעקוף את המגבלה שלעיל, מחקר זה מציג עיצוב סדרתי שמעריך את האינטראקציה של ה- c. neoformans מק. נאופורמנים 1378 ו- c. neoformans Lmpe 046 עם הקואקאואמבה קסטאני . ראשית, נעשה שימוש בשיטה איכותית הקודמת לשיטה כמותית. תמונות סטילס לכוד באמצעות מיקרוסקופ הפוך מעין פלואורסצנטית, כמו גם מיקרוסקופ אלקטרון שידור לתאר את האינטראקציות אמבה-קריפטוקוקוס . זה היה לאחר מכן על ידי כימות זריחה באמצעות קורא צלחת להעריך את היעילות של אמבה להפנים תאים cryptococcal. כאשר ליישב ממצאים משיטות אלה בשלב פרשנות הנתונים, זה עשוי לחשוף באופן שווה את המידע הקריטי הרבה כמו pergocyציטוזה מעידה בזמן וידאו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הצפנת קריפטוקוקוס וכמה זנים קסטאנימה של הקואקאז נחשבים ברמה אבטחה טיחות 2 (bsl-2) פתוגנים; לכן, החוקרים חייבים לנקוט אמצעי זהירות נאותים כאשר עובדים עם אורגניזמים אלה. לדוגמה, על אנשי המעבדה להיות בעלי הכשרה מסוימת וציוד הגנה אישי (PPE) כגון מעילי מעבדה, כפפות והגנת עיניים. יש להשתמש בקבינט בטיחות ביולוגית (רמה 2) להליכים שעלולים לגרום לזיהום14.

1. טיפוח וסטנדרטיזציה של תאים פטרייתיים (השתנה ממדדו ואח ' 15 )

  1. החוצה את מבחן הזנים פטרייתי (כלומר, ג. neoformans Uofs Y-1378 ו -c. neoformans lmpe 046) מתרבויות מניות (לא יותר מ 9 חודשים) על שמרים-peptone-דקסטרוז (YPD) אגר צלחות. מידע על המרכיבים של YPD אגר ניתן למצוא בטבלה 1.
    הערה: c. neoformans uofs 1378 הוכח לייצר 3-הידרוxy חומצות שומן, בעוד C. neoformans lmpe 046 אינו מייצר 3-הידרוxy חומצות שומן. התייחס לקובץ משלים 1 לקבלת מידע אודות אופן הקביעה של נוכחות מולקולות אלה.
  2. מודטה את צלחות אגר עבור 48 h ב 30 ° c.
    הערה: ניתן לאחסן צלחת עד 2 חודשים ב -4 ° c לפני שניתן יהיה להיפטר ממנו או להשתמש בו כדי ליצור מלאי תרבות16.
  3. גרד את הloopful של תאים cryptococcal ( כולל של הצפנת מימן) מלוח 48 h-1378 או c. neoformans lmpe 046) מתוך הלוחית הישנה והנחסן ל-ml בקבוקון 250 משנת המכיל מתחת ל-ml (100 g/L) שיושלם עם 4% ( w/v) גלוקוז. בטבלה 2ניתן למצוא מידע על מרכיבי הציר של ynb.
  4. מודסת את מבחנות ב 30 ° צ' עבור 24 שעות בזמן השקיעה ב 160 סל ד על שייקר רוטרי.
  5. לאחר תקופת דגירה של 24 שעות, לספור את התאים פטרייתי באמצעות התקן הומוציטוטומטר ולהתאים את מספר התא ל 1 x 106 תאים/ML עם PBS ב-pH 7.4.
    הערה: השימוש ב- c. neoformans Uofs Y-1378 הוכנו בשלבים 3.1 ו 3.2, בעוד C. neoformans lmpe 046 בשימוש רק בשלב 3.2.

2. טיפוח וסטנדרטיזציה של תאים אמבה (משנת Madu et al. 15 )

  1. הפשרת תרבות מניות של הקואקאנאמבה קסטאניאני ולהביא אותו לטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: אמבה הוכנו על בסיס פרוטוקולים ששונו של Axelsson-אולסון ואח '8 ו שוסטר17.
  2. פיפטה 1 מ ל של התרבות המופשנת ומחסן אותו לצינור צנטריפוגה 50 mL המכיל 15 מ ל של ATCC בינוני 712. מידע על מרכיבי 712 בינונית של ATCC ניתן למצוא בטבלה 3.
  3. באופן ידני לנענע אותו בעדינות ומיד צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 400 x g ו 30 ° c.
  4. . ומכה את הסופרנטאנט
  5. השהה מחדש את התאים ב-15 מ ל של ATCC medium 712 והרכבת את הצינור ב -30 ° c למשך 14 ימים.
    הערה: בדוק מדי פעם את התאים, תוך שימוש במיקרוסקופ אור פשוט, כדי לקבוע אם הם נמצאים במצב של trophozoite. , ברגע שהם במצב של טרופוזוייט. תתחילו בתרבות טרייה
  6. פיפטה 1 מ ל מן התרבות המציגה תאים במצב trophozoite ולהשתמש בו כדי לחסן שפופרת צנטריפוגה 50 mL סטרילי המכיל 15 מ ל של טרי, סטרילי ATCC בינונית 712.
  7. מודסת את הצינור ב 30 ° צ' במשך 1 שבוע בזמן השקיעה ב 160 סל ד על שייקר רוטרי.
  8. לאחר שבוע, לספור את התאים אמבה באמצעות הומוציטוטומטר ולהתאים את מספר התא ל 1 x 107 תאים/mL עם טריים, סטרילי atcc בינוני 712.
  9. לבצע שיטת הכדאיות באמצעות הכתם הכחול כמפורט על ידי Strober18. המשיכו עוד עם התרבויות המציגות לפחות 80% יכולת הכדאיות.

3. כתמים פלואורסצנטית של תאים ללמוד phagocyציטוזה (השתנה מ-Madu et al. 15 )

  1. איסוף נתונים איכותניים באמצעות שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטית
    הערה: יש לבצע את הדבר הזה עם מחאקאנאמבה ו -C. neoformans uofs 1378.
    1. לוותר על 200-μL השעיה של אמבות סטנדרטיות (1 x 107 תאים/mL ב-atcc בינונית 712) לתוך בארות קאמרית של שקופית חסיד ו דגירה עבור 2 h ב 30 ° c עבור תאים לדבוק המשטח.
    2. בעוד תאים אמבה הם מתיישב כדי לדבוק, כתם מתוקננת C. neoformans Uofs Y-1378 תאים שהותאמו 1 x 106 תאים/ML (ב 999 μl של PBS) עם 1 μl של פלואורואסעין isothiocyanate ב שפופרת פלסטיק 1.5 mL.
      הערה: הכינו את הכתם על ידי המסת 1 מ"ג של fluorescein isothiocyanate ב 1 מ ל של אצטון.
    3. מתפרעים בעדינות את C. neoformans Uofs Y-1378 תאים על שייקר מסלולית להגדיר ב 50 rpm עבור 2 h ב RT ו בחושך.
    4. לאחר 2 h, צנטריפוגה ב 960 x g עבור 5 דקות ב 30 ° צ' כדי התאים גלולה.
    5. . להסיר את הערוץ עם הכתם
    6. הוסף 1 מ ל של PBS לצינור לשטוף את הגלולה תא. רוחצים את התאים על ידי ליטוף בעדינות.
    7. צנטריפוגה את התאים ב 960 x g עבור 5 דקות ב 30 ° c. . מחק את הסופרנטאנט חזור על השלב השוטף. עוד פעם אחת
    8. השהה מחדש את התאים הנשטפים. ב-100 מ ל של הערוץ
    9. מוותר על 200 μL השעיה של הוכתם C. neoformans Uofs Y-1378 תאים לבארות קאמרית המכיל את התאים אמבה הבלתי מוכתם.
    10. מודאת התרבות המוכנה ב -30 ° c לתקופה נוספת של 2 שעות.
      הערה: ניתן לשלב את התרבות המשותף בנקודות זמן שונות בהתאם למטרת הניסוי.
    11. בתום תקופת הדגירה השותפת, משבבת את תכולת הבארות.
    12. הוסף 300 μL של PBS אל הבארות כדי לשטוף את הבארות הקאמרית וכלה להסיר תאים מאוגדים משותפים. . תעשה את זה בעדינות . מחלק את תכולת הבארות חזור על השלב השוטף. עוד פעם אחת
    13. הכינו את התמיסה של 3% באמצעות הוספת 3 מ ל של גלוטארלדהיד ל 97 mL של מים מזוקקים.
    14. תקן את התאים שיתוף התרבותי על-ידי הוספת 250 μL של 3% פתרון לבארות קאמרית ו הדגירה עבור 1 h.
    15. מנושמים את הקיבעון ורוחצים את הבארות הקאמריים כמפורט משלב 3.1.13.
    16. לפרק את הבארות הקאמרית באמצעות כלי שסופק עם השקופיות הקאמרית.
    17. להוסיף טיפה של מתחם antifade, 1, 4-diazicy,-[2.2.2]-החזק את השקופית כדי למנוע הלבנת אוטומטית. מכסים עם שמיכות ולאטום את הצדדים עם לק ציפורניים כדי למנוע אידוי.
    18. להציג את התאים שיתוף תרבותי באמצעות עדשת היעד 100x (עם שמן) של מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד-סריקת.
      הערה: חשוב לצלם תמונות בשדה בהיר ובאמצעות קרינה פלואורסצנטית כדי להציג אינטראקציה בין תאי אמבה לבין הצפנה. הקרינה הפלואורסצנטית יכולה להיות. מוטלות על התמונות בשדה הבהיר תאים אמבה הם בדרך כלל גדולים יותר בגודל (כלומר, 45-60 μm), ואת התאים trophozoite יש צורה לא סדירה. תאים cryptococcal הם 5-10 יקרומטר בקוטר ולקבל בצורת globose כדי דמוי. כאשר הם חשופים ללייזר, ייתכן שתאי אמבה לא מוכתמים יכולים לפלוט אוטומטית באופן אוטומטי. התייחס לביקר ולדולבהן19 ו קלנסי ו-cauller20 עבור שיטות כדי להפחית את הקרינה האוטומטית.
  2. רכישת נתונים כמותיים באמצעות שימוש בקורא לוחית קרינה
    הערה: יש לבצע את הערך הזה עם כלאקקואמבה ו -c. neoformans uofs 1378 או c. neoformans lmpe 046.
    1. לוותר על 100 μL השעיה של מתקן אמבות (מותאם 1 x 107 תאים/ML ב atcc בינונית 712) לתוך שחור, חסיד 96 היטב microtiter לוחית.
    2. מודקת את הצלחת 2 h ב 30 ° צ' כדי לאפשר תאי אמבה לדבוק המשטח.
    3. בעוד תאים אמבה מתיישב לדבוק, כתם מתוקננת C. neoformans Uofs Y-1378 תאים שהותאמו 1 x 106 תאים/ML (ב 999 μl של PBS) עם 1 Μl של Phrodo ירוק Zymosan מאמרים בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL. כתם C. neoformans lmpe 046 תאים גם בצינור נפרד.
      הערה: הצבע, בניגוד fitc, כתמים בררנית תאים שנלכדו בתוך הסביבה חומצי של תא phagocytic21,22. עבור טכניקה זו, חשוב לשמור על התאים cryptococcal במדיום עם pH נייטרלי (PBS) ו אמבה במדיום עם pH נייטרלי (ATCC בינוני 712). בינונית עם סביבה חומצית תגרום לקריאה חיובית כוזבת של יחידות הזריחה היחסיות, ורומז כי מספר רב יותר של הצפנה הפנימו.
    4. בעדינות מתפרעים תאים cryptococcal על שייקר מסלולית להגדיר ב 50 rpm עבור 2 h ב RT ו בחושך.
    5. לאחר 2 h, צנטריפוגה את שפופרת מיקרוצנטריפוגה ב 960 x g עבור 5 דקות ב 30 ° צ' כדי גלולה התאים. . להסיר את הערוץ הPBS עם הכתם
    6. הוסף 1 mL של PBS לצינור לשטוף את התאים מפלטד. שטפו את התאים בעזרת מלטף עדין.
    7. צנטריפוגה את התאים ב 960 x g עבור 5 דקות ב 30 ° c. . מחק את הסופרנטאנט חזור על השלב השוטף. עוד פעם אחת
    8. השהה מחדש את הגלולה של תאים שנשטפו ב-1 מ ל של PBS.
    9. מוותר על 100 μL השעיה של תאים cryptococcal מוכתם לבארות המכילות תאים אמבה לא מוכתם.
    10. מודאת התרבות המוכנה ב -30 ° c לתקופה נוספת של 2 שעות.
      הערה: התרבות השותפת יכולה להיות מודערת לנקודות זמן שונות כדי להתאים למטרת הניסוי.
    11. בסוף תקופת הדגירה המשותף, למדוד את הזריחה על קורא מיקרופלייט. המר אותות לוגריתמי ליחידות זריחה יחסית.
      הערה: עירור של הצבע הוא ב 492 ננומטר ופליטה היא ב 538 nm. היוועץ בביקר ודולבהם19 וקלנסי וקולר20 לשיטות להפחתת הקרינה האוטומטית.

4. שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית לחקר פאיגוציטוזה (שונה מוואן ווינק ווינגפילד 23 )

  1. הוסף 5 מ"ל השעיה של אמבות (מותאם ל 1 x 107 תאים/ML ב atcc בינונית 712) לצינור הצנטריפוגה 15 מ"ל ולאפשר להם להתפשר על 30 דקות ב 30 ° c.
  2. הוסף 5 מ ל השעיה של C. neoformans Uofs Y-1378 תאים (מותאם 1 x 106 תאים/mL ב-PBS) לאותה צינורית צנטריפוגה המכילה 5 מ ל של תאים אמבה מתוקננת.
  3. אפשר לעמוד הרכבת התחתית ב -30 ° c.
  4. צנטריפוגה את הצינור ב 640 x g עבור 3 דקות ב 30 ° צ' כדי לצנפה את התאים השותפים בתרבית. . ומכה את הסופרנטאנט . אל תשטוף את התאים המתורבתות
  5. תקן את התאים שיתוף תרבותי על ידי השעיית הגלולה ב 3 מ ל של 1.0 M (pH = 7.0) נתרן פוספט באגירה 3% גלוטרלדהיד עבור 3 h.
  6. צנטריפוגה את הצינור ב 1,120 x g עבור 5 דקות ב 30 ° צ' כדי גלולה התאים שלנו תרבותי. . ומכה את הסופרנטאנט
  7. הוסף 5 מ ל של נתרן פוספט מאגר לצינור הצנטריפוגה כדי לשטוף את התאים הפלטאד. לשטוף בעדינות ללטף את תכולת הצינור עבור 20 s.
  8. צנטריפוגה את הצינור ב 1,120 x g עבור 5 דקות ב 30 ° צ' כדי גלולה התאים שלנו תרבותי.
  9. חזור על שלבים 4.8-4.10. . ומכה את הסופרנטאנט
  10. תקן את התאים שיתוף התרבותי שוב על ידי השעיית הגלולה ב 3 מ ל של 1.0 M (pH = 7.0) נתרן פוספט באגירה 1% אוסמיום tetroxide עבור 1.5 h.
  11. הסר את התיקונים (osmium tetroxide) על ידי שטיפת תאים שיתוף תרבותי באופן דומה להסרת 3% גלוטרלדהיד.
  12. מייבשים את החומר TEM (הידוע גם כתאים שיתוף תרבותי) בסדרה מדורגת של 30%, 50%, 70%, 95% ושני שינויים של 100% עבור 15 דקות כל אחד, בהתאמה. כדי לעשות זאת, להוסיף 3 מ ל של פתרון אצטון לתאי מפלטד ולתת לו לעמוד 15 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 200 x g עבור 10 דקות ב-RT להיפטר supernatant ולהוסיף את אחוז גבוה יותר של פתרון אצטון.
  13. הכינו את האפוקסי של עקביות נורמלית בהתאם לפרוטוקול באמצעות השלוחה24.
    הערה: שרף האפוקסי משמש להענשת האתרים.
  14. להטביע את החומר TEM לתוך שרף אפוקסי שהוכן טרי. לשם כך, בצע את השלבים שלהלן.
    1. הוסיפו 3 מ ל של אפוקסי המוכן טרי לצינור המכיל את חומר TEM מחדש ב 3 מ ל של 100% תמיסה של אצטון. . הניחו לצינור לעמוד בעוד 1 שעות
    2. צנטריפוגה את הצינור ב 200 x g עבור 10 דקות ב 30 ° c. . ומכה את תמיסת האפוקסי-אצטון
    3. הוסיפו 6 מ ל של אפוקסי המוכן טרי לגלולה שבצינור. . הניחו לצינור לעמוד בעוד 1 שעות
    4. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 10 דקות ב 30 ° c. מנושף את כל התמיסה. של האפוקסי-אצטון
    5. הוסיפו 3 מ ל של אפוקסי המוכן טרי לצינור. . הניחו לצינור לעמוד 8 שעות
    6. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 10 דקות ב 30 ° c. מנושף את כל תמיסת האפוקסי
    7. הוסיפו 3 מ ל של אפוקסי המוכן טרי לצינור. לשמור את החומר TEM בתמיסה האפוקסי לילה בdesiccator ואקום.
      התראה: שרף אפוקסי הוא חומר רדיואקטיבי. השתמש ב-PPE כדי לטפל שרף אפוקסי. יש לטפל גם בשרף האפוקסי בתוך מכסה המנוע. החוקרים צריכים לעקוב אחר תקנות בטיחות להשליך חומר כזה כפי שצוין על ידי כל מדינה25.
  15. החומר לצורך המשך 8 שעות ב70 ° c.
  16. על ultramicrotome, לקצץ קטעים קטנים של כ 0.1 מ"מ x 0.1 מ"מ ו 60 בעובי ננומטר מחומר אפוקסי מוטבע עם סכין זכוכית רכוב. להרכיב מקטעים על רשת ולמקם את הרשתות בתיבת מחזיק לדוגמה TEM לפני כתמים.
  17. כתם את הסעיפים עם טיפה של 6% uranyl אצטט עבור 10 דקות בחושך. ודא שהסעיפים מכוסים לחלוטין. |
    הערה: מרכיבים מחדש את הכתם (6 גר') ב-100 mL של מים מזוקקים.
    התראה: Uranyl אצטט הוא חומר רדיואקטיבי. השתמש ב-PPE כדי לטפל באצטט uranyl. גם אצטט uranyl צריך להיות מטופל בתוך מכסה. החוקרים צריכים לעקוב אחר תקנות בטיחות להשליך חומר כזה כפי שצוין על ידי כל מדינה25.
  18. לשטוף מקטעים על ידי טבילה חמש פעמים לתוך גביע המכיל 100 mL של מים מזוקקים.
    הערה: מים מזוקקים צריך להיות מושלך בהתאם, כפי שהוא מכיל שאריות של אצטט uranyl.
  19. הכתם את החלק עם טיפת עופרת ציטראט במשך 10 דקות בחושך. ודא שהסעיפים מכוסים כליל.
    הערה: יש להכין ציטראט עופרת בהתאם לפרוטוקול של ריינוld26.
  20. לשטוף מקטעים על ידי טבילה חמש פעמים לתוך גביע המכיל 100 mL של מים מזוקקים.
  21. הכנס בנפרד את הרשתות עם חלקים מוכתמים בתיבת מחזיק לדוגמה של TEM.
  22. הצגת מקטעים עם מיקרוסקופ אלקטרוני שידור.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

חיידקים הם אורגניזמים מיקרוסקופיים שאי אפשר להיתפס עם עין בעירום. עם זאת, ההשפעה שלהם עלולה לגרום למחלות קליניות מובנת, כגון דלקות עור. כאשר לומדים היבטים מסוימים של חיידקים, החל מורפולוגיה שלהם, תוצרי לוואי ואינטראקציות, להיות מסוגל לספק ראיות ציורית ווידאו הוא בעל חשיב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בעיתון, טכניקות שונות המועסקים בהצלחה כדי לחשוף את התוצאה האפשרית שעלולים להתעורר כאשר אמבה אינטראקציה עם תאים cryptococcal. כמו כן, היינו מעוניינים להראות את ההשפעות של חומצות שומן 3-הידרורוקסי על התוצאה של אינטראקציות של הקריפטוקוקוס-אמבה.

הטכניקה הראשונה שהייתה בשימוש ה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

העבודה נתמכת על ידי מענק מקרן המחקר הלאומי של דרום אפריקה (מספר המענק: UID 87903) והאוניברסיטה של המדינה החופשית. אנו גם אסירי תודה לשירותים ולסיוע המוצעים על ידי פיטר ואן ווינק והנלי גרובלר במהלך לימודי המיקרוסקופיה שלנו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octaneSigma-AldrichD27802-
1.5-mL plastic tube Thermo Fisher Scientific69715-
15-mL Centrifuge tube Thermo Fisher Scientific7252018-
50-mL Centrifuge tube Thermo Fisher Scientific1132017-
8-Well chamber slideThermo Fisher Scientific1109650-
AcetoneMerckSAAR1022040LC-
Amoeba strainATCCÒ30234TM-
ATCC medium 712ATCCÒ712TMAmoeba medium
Black 96-well microtiter plateThermo Fisher Scientific152089-
CentrifugeHermle--
ChloroformSigma-AldrichC2432-
Confocal microscopeNikonNikon TE 2000-
Epoxy resin:
[1] NSA[1] ALS[1] R1054-
[2] DER 736[2] ALS[2] R1073-
[3] ERL Y221 resin[3] ALS[3] R1047R-
[4] S1 (2-dimethylaminoethanol)[4] ALS [4] R1067-
Fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichF4274-
Formic AcidSigma-Aldrich489441-
Fluoroskan Ascent FLThermo Fisher Scientific374-91038CMicroplate reader
GlucoseSigma-AldrichG8270-
GlutaraldehydeALSR1009-
HemocytometerBoeco--
Lead citrateALSR1209-
Liquid Chromatography Mass SpectrometerThermo Fisher Scientific-
MethanolSigma-AldrichR 34,860-
Orbital shakerLasec --
Osmium tetroxideALSR1015-
pHrodo Green Zymosan A BioParticlesLife TechnologiesP35365This is the pH-sensitive dye
Physiological buffer solutionSigma-AldrichP4417-50TAB-
Rotary shakerLabcon--
Sodium phosphate buffer:
[1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate [1] Merck[1] 106580-
[2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate[2] Merck [2] 106345
Transmission electron microscopePhilipsPhilips EM 100 -
Trypan blue Sigma-AldrichT8154-
UltramicrotomeLeicaEM UC7-
Uranyl acetateALSR1260A-
Vacuum dessicatorLasec --
VialSigma-Aldrich29651-U-
YNBLasec 239210-
YPD agarSigma-AldrichY-1500-

References

  1. Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
  2. Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
  3. Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629(2014).
  4. Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality? Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
  5. Khan, N. A. Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , Caister Academic Press. Nottingham. (2014).
  6. Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
  7. Casadevall, A., Perfect, J. R. Cryptococcus Neoformans. , ASM Press. Washington D.C. (1998).
  8. Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
  9. Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
  10. Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
  11. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1(2015).
  12. Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
  13. Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196(2013).
  14. Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
  15. Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351(2015).
  16. Smith, D., Onions, A. H. S. The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , CAB International. Wallington. (1994).
  17. Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
  18. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
  19. Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
  20. Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
  21. Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Unit 9, 31 (2010).
  22. Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric Imaging of pH Probes. MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).
  23. van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
  24. Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
  25. Department of Minerals and Energy. Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , Department of Minerals and Energy. Pretoria. (2005).
  26. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
  27. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
  28. Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , Garland Science. New York. (2001).
  29. Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
  30. Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
  31. Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765(2017).
  32. Hayes, B. K., Heit, E. Inductive reasoning 2.0. , Wiley Interdisciplinary Review: Cognitive Science. e1459(2018).
  33. Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148phagocy

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved