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Resumo

Este papel detalha um protocolo para preparar uma cocultura de pilhas e de amebas criptocócica que é estudado usando imagens imóveis, fluorescentes e imagens de alta resolução do microscópio de elétron da transmissão. Ilustrados aqui é como os dados quantitativos podem complementar tais informações qualitativas.

Resumo

Para simular a infecção por Cryptococcus , a ameba, que é o predador natural das células criptocócicas no ambiente, pode ser usada como um modelo para macrófagos. Este organismo predatório, semelhante aos macrófagos, emprega fagocitose para matar células internalizadas. Com o auxílio de um microscópio confocal da laser-exploração, as imagens que descrevem momentos interativos entre pilhas e ameba criptocócica são capturadas. O poder da definição do microscópio de elétron igualmente ajuda a revelar o detalhe ultrastructural de pilhas criptocócica quando prendido dentro do vacuole do alimento do ameba. Como a fagocitose é um processo contínuo, os dados quantitativos são então integrados na análise para explicar o que acontece no momento em que uma imagem é capturada. Para ser específico, as unidades relativas da fluorescência são lidas a fim quantificar a eficiência do ameba em internalizantes pilhas criptocócica. Para esta finalidade, as pilhas criptocócica são manchadas com um corante que os faça fluorescência uma vez prendido dentro do ambiente ácido do vacuole do alimento. Quando utilizados em conjunto, as informações recolhidas através de tais técnicas podem fornecer informações críticas para ajudar a tirar conclusões sobre o comportamento e o destino das células quando internalizada pela ameba e, possivelmente, por outras células fagocíticas.

Introdução

Os micróbios evoluíram ao longo do tempo para ocupar e prosperar em diferentes nichos ecológicos, como os limites físicos abertos do solo e da água, entre outros1. Nesses nichos, os micróbios muitas vezes se envolvem na concorrência direta por recursos limitados; importante, para os nutrientes que eles usam para apoiar o seu crescimento ou espaço, que eles precisam para acomodar a população em expansão2,3. Em certos casos, alguns organismos holozoicos como a ameba podem até mesmo antecedem em células criptocócicas como uma forma de extrair nutrientes de sua biomassa4,5. Por sua vez, isso permite que tais organismos estabeleçam a dominância territorial através do controle dos números populacionais de suas presas. Devido a essa pressão predatória, algumas presas podem ser selecionadas para produzir fatores microbianos, como a cápsula criptocócica6, para conciliar os efeitos negativos da pressão. No entanto, como consequência não intencional desta pressão, alguns micróbios adquirem fatores que lhes permitem atravessar a barreira das espécies e procurar novos nichos para colonizar7, como os espaços confinados do corpo humano que são ricos em nutrientes e têm o ideal Condições. Este último pode explicar como um micródon terrestre como Cryptococcus (C.) neoformans pode se transformar para se tornar patogénico.

Para este fim, é importante estudar o contato inicial que as células criptocócicas podem ter com ameba e como isso pode selecioná-los para se tornarem patogênicos. Mais especificamente, isso pode dar pistas sobre como as células criptocócicas se comportam quando agiram por macrófagos durante a infecção. É por esta razão que a ameba foi escolhida como um modelo para os macrófagos aqui, pois é relativamente barata e fácil manter uma cultura de ameba em um laboratório8. Do interesse era examinar igualmente como Metabolites secundário criptocócica viz. os ácidos graxos 3-hydroxy9,10 influenciam a interação entre amebas e pilhas criptocócica.

Uma maneira simples de perceber a interação entre a ameba e sua presa a olho nu é criar um gramado usando sua presa na superfície de uma placa de ágar e ameba local. A visualização de placas ou zonas claras na placa de agar retrata áreas onde a ameba pode ter alimentado sua presa. No entanto, neste nível macro, apenas o resultado do processo é observado, e o processo de fagocitose é mecanizado não pode ser observado. Portanto, para apreciar o processo em uma base célula a célula, existem vários métodos microscópicos que podem ser usados11,12. Por exemplo, um microscópio invertido com uma câmara de incubação pode ser usado para gravar um lapso de tempo de eventos entre uma célula fagocítica e seu alvo13. Infelizmente, devido ao custo de um microscópio com uma funcionalidade de lapso de tempo, nem sempre é possível para os laboratórios para comprar tal microscópio, especialmente em recursos pobres-configurações.

Para contornar a limitação acima, este estudo apresenta um delineamento exploratório sequencial que avalia a interação de c. neoformans Viz c. neoformans uofs Y-1378 e c. neoformans Lmpe 046 com Acanthamoeba Castellani . Em primeiro lugar, é utilizado um método qualitativo que precede um método quantitativo. As imagens ainda são capturadas usando um microscópio de fluorescência invertido, bem como um microscópio eletrônico de transmissão para descrever ameba-interaçõesCryptococcus . Isto foi seguido quantificando a fluorescência usando um leitor da placa para estimar a eficiência do ameba para internalizar pilhas criptocócica. Ao reconciliar os achados desses métodos durante a fase de interpretação de dados, isso pode revelar igualmente tanta informação crítica quanto a utilização de um vídeo de lapso temporal de fagocitose.

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Protocolo

Cryptococcus neoformans e algumas cepas de Acanthamoeba Acanthamoeba são consideradas patógenos de nível 2 de biossegurança (BSL-2); assim, os investigadores devem tomar precauções apropriadas ao trabalhar com estes organismos. Por exemplo, o pessoal de laboratório deve ter treinamento específico e equipamentos de proteção individual (EPI), como casacos de laboratório, luvas e proteção ocular. Um armário de segurança biológico (Level-2) deve ser usado para os procedimentos que podem causar a infecção14.

1. cultivo e padronização de células fúngicas (modificada de Madu et al. 15 )

  1. Estica as cepas fúngicas de teste (i.e., c. neoformans Uofs Y-1378 e c. neoformans lmpe 046) de culturas de estoque (não mais de 9 meses) em placas de agar de levedura-peptona-dextrose (YPD). As informações sobre os ingredientes do agar YPD podem ser encontradas na tabela 1.
    Nota: c. neoformans Uofs Y-1378 foi mostrado para produzir 3-hydroxy ácidos graxos, enquanto C. neoformans lmpe 046 não produz 3-hidroxi ácidos graxos. Refira o arquivo suplementar 1 para obter informações sobre de como a presença destas moléculas é determinada.
  2. Incubar as placas de agar para 48 h a 30 ° c.
    Nota: uma placa pode ser armazenada por até 2 meses a 4 ° c antes de poder ser descartada ou usada para fazer uma cultura de estoque16.
  3. Raspar um alçada de células criptocócicas (c. neoformans uofs Y-1378 ou c. neoformans lmpe 046) da placa 48 h-Old e inoculado em um balão cônico de 250 ml contendo 100 ml do caldo ynb quimicamente definido (6,7 g/L) suplementado com 4% ( w/v) glicose. As informações sobre os ingredientes do caldo YNB podem ser encontradas na tabela 2.
  4. Incubar as garrafas a 30 ° c durante 24 h enquanto agitando a 160 RPM em um agitador rotativo.
  5. Após um período de incubação de 24 h, contar as células fúngicas usando um hemociômetro e ajustar o número da célula para 1 x 106 células/ml com PBS em pH 7,4.
    Nota: o inoculante c. neoformans Uofs Y-1378 preparado foi utilizado nas etapas 3,1 e 3,2, enquanto o inuso de c. neoformans lmpe 046 foi utilizado apenas na etapa 3,2.

2. cultivo e padronização de células de ameba (modificadas de Madu et al. 15 )

  1. Descongelar uma cultura de estoque de Acanthamoeba Acanthamoeba e trazê-lo para a temperatura ambiente (RT).
    Nota: a Amoeba foi preparada com base nos protocolos modificados de Axelsson-Olsson et al.8 e Schuster17.
  2. Pipetar 1 mL da cultura descongelada e inoculá-lo num tubo de centrifugação de 50 mL contendo 15 mL de meio ATCC 712. As informações sobre os ingredientes do ATCC Medium 712 podem ser encontradas na tabela 3.
  3. Agitar manualmente suavemente e imediatamente centrifugar por 5 min a 400 x g e 30 ° c.
  4. Aspirar o sobrenadante.
  5. Ressuspender as células em 15 mL do meio ATCC 712 e incubar o tubo a 30 ° c durante 14 dias.
    Nota: periodicamente verificar as células, usando um simples microscópio de luz, para determinar se eles estão em um estado trophozoite. Uma vez que eles estão em um estado trophozoite, iniciar uma cultura fresca.
  6. Pipetar 1 mL de uma cultura que mostre células em um estado de trophozoite e use-a para inocular um tubo de centrífuga estéril de 50 mL contendo 15 mL de meio ATCC fresco e estéril 712.
  7. Incubar o tubo a 30 ° c durante 1 semana enquanto agitando a 160 RPM em um agitador rotativo.
  8. Após uma semana, conte as células da ameba usando um hemocitômetro e ajuste o número da pilha a 1 x 107 Cells/ml com o meio fresco, estéril ATCC 712.
  9. Realize um ensaio de viabilidade usando uma mancha azul de Tripan conforme detalhado por Strober18. Prosseguir com as culturas que mostram pelo menos 80% de viabilidade.

3. coloração por fluorescência de células para estudo da fagocitose (modificada de Madu et al. 15 )

  1. Coleta de dados qualitativos através do uso de microscópio de fluorescência
    Nota: realize este ensaio com Acanthamoeba Acanthamoeba e C. neoformans uofs Y-1378.
    1. Dispensar uma suspensão de 200 μL de amebas padronizadas (1 x 107 células/ml em meio atcc 712) em poços de câmara de um slide aderente e incubar por 2 h a 30 ° c para as células aderirem à superfície.
    2. Enquanto as células da ameba estão se estabelecendo para aderir, manchar as células C. neoformans Uofs Y-1378 padronizadas que foram ajustadas para 1 x 106 células/ml (em 999 μL de PBS) com 1 μL de isotiocianato de fluoresceína em um tubo de plástico de 1,5 ml.
      Nota: Prepare a mancha dissolvendo 1 mg de isotiocianato de fluoresceína em 1 mL de acetona.
    3. Agitar suavemente as células C. neoformans Uofs Y-1378 em um agitador orbital fixado em 50 rpm por 2 h em RT e no escuro.
    4. Após 2 h, centrifugue em 960 x g por 5 min a 30 ° c para pellet as células.
    5. Aspirar o sobrenadante para remover o PBS com a mancha.
    6. Adicione 1 mL de PBS ao tubo para lavar o pellet celular. Lave as células introduzindo suavemente a pipetagem.
    7. Centrifugue as células a 960 x g durante 5 min a 30 ° c. Descarte o sobrenadante. Repita a etapa de lavagem mais uma vez.
    8. Ressuscitem as células lavadas em 1 mL de PBS.
    9. Dispensar uma suspensão de 200 μL das células C. neoformans Uofs Y-1378 manchadas para poços de câmara contendo as células de ameba não manchadas.
    10. Incubar a cocultura preparada a 30 ° c por um período adicional de 2 horas.
      Nota: a cocultura pode ser incubada para diferentes pontos de tempo para atender à finalidade do experimento.
    11. No final do período de coincubação, aspirar o conteúdo dos poços.
    12. Adicione 300 μL de PBS aos poços para lavar os poços da câmara e para remover todas as células cocultivadas não acopladas. Faça isso por pipetagem suave. Aspirar o conteúdo dos poços. Repita a etapa de lavagem mais uma vez.
    13. Prepare a solução de glutaraldeído a 3% adicionando 3 mL de glutaraldeído a 97 mL de água destilada.
    14. Fixar as células cocultivadas adicionando 250 μL de solução de 3% aos poços da câmara e incubando por 1 h.
    15. Aspirar o fixador e lavar os poços da câmara como detalhado da etapa 3.1.13.
    16. Desmontar os poços de câmara usando uma ferramenta que foi fornecida com as lâminas da câmara.
    17. Adicione uma gota do composto de Antifade, 1,4-diazabicyclo-[2.2.2]-octano à corrediça para impedir o auto-branqueamento. Cubra com uma lamínula e sele os lados com um esmalte para evitar a evaporação.
    18. Veja as células cocultivadas usando a lente objetiva 100x (com óleo) de um microscópio de varredura de laser confocal.
      Nota: é importante tirar fotos em campo brilhante e fluorescência para ver a interação entre ameba e células criptocócicas. Sempre que possível, a fluorescência pode ser superimposta para as imagens de campo brilhante. As pilhas de Amoeba são tipicamente maiores no tamanho (isto é, 45-60 μm), e as pilhas do trophozoite têm uma forma irregular. Células criptocócicas são 5-10 μm de diâmetro e têm uma forma globosa a ovóide. Quando exposto a um laser, é possível que as células de ameba não manchadas podem emitir fluorescência automática. Refira Beisker e Dolbeare19 e Clancy e cauller20 para métodos para reduzir o autofluorescence.
  2. Aquisição de dados quantitativos através do uso de leitor de placas de fluorescência
    Nota: realize este ensaio com Acanthamoeba Acanthamoeba e c. neoformans uofs Y-1378 ou c. neoformans lmpe 046.
    1. Dispensar uma suspensão de 100 μl de amebas padronizadas (ajustadas a 1 x 107 células/ml em meio ATCC 712) em uma placa de de microtitulação bem preta, aderente 96.
    2. Incubar a placa por 2 h a 30 ° c para permitir que as células da ameba aderem à superfície.
    3. Enquanto as células da ameba estão se estabelecendo para aderir, manchar o padronizado C. neoformans Uofs Y-1378 células que foram ajustadas para 1 x 106 células/ml (em 999 μL de PBS) com 1 ΜL de Phrodo verde Zymosan a biopartículas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mancha C. neoformans lmpe 046 células, bem como em um tubo separado.
      Nota: a tintura, ao contrário de FITC, seletivamente mancha as pilhas que são prendidas dentro do ambiente ácido de uma pilha fagocitária21,22. Para esta técnica, é importante manter as células criptocócicas em um meio com um pH neutro (PBS) e ameba em um meio com um pH neutro (ATCC médio 712). Um meio com um ambiente ácido resultará em uma leitura falsa positiva das unidades de fluorescência relativa, implicando que um maior número de criptococos foram internalizados.
    4. Agitar suavemente as células criptocócicas em um agitador orbital fixado em 50 rpm por 2 h em RT e no escuro.
    5. Após 2 h, centrifugue o tubo do microcentrifugador em 960 x g por 5 minutos em 30 ° c para aglomerar as pilhas. Aspirar o sobrenadante para remover PBS com a mancha.
    6. Adicione 1 mL de PBS ao tubo para lavar as células peletizadas. Lave as células por pipetagem suave.
    7. Centrifugue as células a 960 x g durante 5 min a 30 ° c. Descarte o sobrenadante. Repita a etapa de lavagem mais uma vez.
    8. Ressuscitem o pellet de células lavadas em 1 mL de PBS.
    9. Dispensar uma suspensão de 100 μL de células criptocócicas manchadas a poços contendo células de ameba não manchadas.
    10. Incubar a cocultura preparada a 30 ° c por um período adicional de 2 horas.
      Nota: a cocultura pode ser incubada para diferentes temporais para atender à finalidade do experimento.
    11. No final do período de coincubação, meça a fluorescência em um leitor de microplacas. Converta sinais logarítmicos em unidades de fluorescência relativa.
      Nota: a excitação do corante está em 492 nm e a emissão é de 538 nm. Consulte Beisker e Dolbeare19 e Clancy e cauller20 para métodos para reduzir a autofluorescência.

4. uso da microscopia eletrônica de transmissão para estudo da fagocitose (modificada de Van Wyk e Wingfield 23 )

  1. Adicione uma suspensão de 5 ml de amebas (ajustada a 1 x 107 Cells/ml no meio ATCC 712) a um tubo de centrifugação de 15 ml e permita-os de estabelecer-se por 30 minutos em 30 ° c.
  2. Adicione uma suspensão de 5 mL de células C. neoformans Uofs Y-1378 (ajustadas a 1 x 106 células/ml em PBS) ao mesmo tubo de centrifugação que contenha 5 ml de células de ameba padronizadas.
  3. Deixe o suporte do tubo para 2 h a 30 ° c.
  4. Centrifugue o tubo em 640 x g por 3 min a 30 ° c para pellet as células cocultivadas. Aspirar o sobrenadante. Não lave as células cocultivadas.
  5. Fixar as células cocultivadas por ressuscita o pellet em 3 mL de 1,0 M (pH = 7,0) fosfato de sódio-tamponado 3% glutaraldeído por 3 h.
  6. Centrifugue o tubo em 1.120 x g por 5 min a 30 ° c para pellet as células cocultivadas. Aspirar o sobrenadante.
  7. Adicionar 5 mL de tampão fosfato de sódio ao tubo de centrifugação para lavar as células peletizadas. Lave suavemente a pipetagem do tubo durante 20 s.
  8. Centrifugue o tubo em 1.120 x g por 5 min a 30 ° c para pellet as células cocultivadas.
  9. Repita os passos 4.8-4.10. Aspirar o sobrenadante.
  10. Fixar as células cocultivadas novamente por ressuscita o pellet em 3 mL de 1,0 M (pH = 7,0) fosfato de sódio-tampão de ósmio 1% tetroxida para 1,5 h.
  11. Remova o fixador (tetroxida do ósmio) lavando as pilhas cocultivadas em uma maneira similar a remover o glutaraldehyde de 3%.
  12. Desidratar o material TEM (também conhecido como as células cocultivadas) em um acetoneseries classificados de 30%, 50%, 70%, 95% e duas alterações de 100% para 15 min cada, respectivamente. Para isso, adicione 3 mL da solução de acetona às células peletizadas e deixe-a ficar por 15 min. Em seguida, centrifugue a 200 x g por 10 min em RT descarte o sobrenadante e acrescente a maior porcentagem da solução de acetona.
  13. Prepare o epóxi de consistência normal de acordo com o protocolo por Spur24.
    Nota: a resina epóxi é usada para seccionamento.
  14. Incorpore o material de TEM na resina de cola Epoxy recentemente preparada. Para fazer isso, siga as etapas abaixo.
    1. Adicionar 3 mL da epoxi recém-preparada a um tubo que contenha o material TEM ressuspensão em 3 mL de solução de 100% de acetona. Deixe o tubo ficar por 1 h.
    2. Centrifugue o tubo a 200 x g durante 10 min a 30 ° c. Aspirar a solução de epóxi-acetona.
    3. Adicione 6 mL da cola Epoxy recentemente preparada à pelota no tubo. Deixe o tubo ficar por 1 h.
    4. Centrifugar a 200 x g durante 10 min a 30 ° c. Aspirar toda a solução de epóxi-acetona.
    5. Adicione 3 mL da cola Epoxy recentemente preparada ao tubo. Deixe o tubo ficar por 8 h.
    6. Centrifugar a 200 x g durante 10 min a 30 ° c. Aspirar toda a solução epóxi
    7. Adicione 3 mL da cola Epoxy recentemente preparada ao tubo. Mantenha o material de TEM na solução da cola Epoxy durante a noite em um dessecador do vácuo.
      Cuidado: a resina epóxi é um material radioativo. Use EPI para manusear a resina epóxi. A resina epóxi também deve ser tratada em uma capa de fumaça. Os pesquisadores devem seguir os regulamentos de segurança para descartar tal material, conforme especificado por cada país25.
  15. Polimerize o material de TEM para 8 h em 70 ° c.
  16. No ultramicrotome, corte seções pequenas de aproximadamente 0,1 milímetros x 0,1 milímetros e 60 de espessura do nanômetro do material epóxi-encaixado com uma faca de vidro montada. Monte seções em uma grade e coloc as grades em uma caixa do suporte da amostra do TEM antes de manchar.
  17. Manchar as secções com uma gota de 6% de acetato de uranilo por 10 min no escuro. Assegure-se de que as secções estão completamente cobertas. |
    Nota: reconstituir a mancha (6 g) em 100 mL de água destilada.
    PRECAUÇÃO: o acetato de Uranyl é um material radioactivo. Use EPI para manipular acetato de uranilo. O acetato de uranyl também deve ser manuseado numa capa de fumos. Os pesquisadores devem seguir os regulamentos de segurança para descartar tal material, conforme especificado por cada país25.
  18. Enxague as secções mergulhando-as cinco vezes numa taça que contenha 100 mL de água destilada.
    Nota: a água destilada deve ser eliminada em conformidade, pois contém vestígios de acetato de uranilo.
  19. Manchar a seção com uma gota de citrato de chumbo por 10 min no escuro. Assegure-se de que as secções estão completamente cobertas.
    Nota: o citrato de chumbo deve ser preparado de acordo com o protocolo de Reynold26.
  20. Enxague as secções mergulhando-as cinco vezes numa taça que contenha 100 mL de água destilada.
  21. Monte individualmente as grades com seções manchadas em uma caixa do suporte da amostra de TEM.
  22. Veja seções com um microscópio de elétron da transmissão.

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Resultados

Micróbios são organismos microscópicos que não podem ser percebidos a olho nu. No entanto, o seu impacto pode resultar em doenças observáveis clinicamente evidentes, tais como infecções cutâneas. Ao estudar certos aspectos dos micróbios, variando de sua morfologia, subprodutos e interações, ser capaz de fornecer evidências pictóricas e de vídeo é de extrema importância.

Primeiramente, procurou-se Visualizar a in...

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Discussão

No artigo, diferentes técnicas foram empregadas com sucesso para revelar o possível desfecho que pode surgir quando a ameba interage com células criptocócicas. Além disso, estávamos interessados em mostrar os efeitos dos ácidos graxos 3-hidroxi sobre o desfecho das interações Criptococcus-Amoeba.

A primeira técnica utilizada foi a microscopia confocal, que rendeu imagens ainda. A principal desvantagem desta técnica aqui foi que ele só nos deu informações que é limitada ...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

O trabalho foi apoiado por uma subvenção da Fundação Nacional de investigação da África do Sul (número de subvenção: UID 87903) e da Universidade do estado livre. Também estamos gratos aos serviços e assistência oferecidos por Pieter Van Wyk e Hanlie Grobler durante nossos estudos de microscopia.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octaneSigma-AldrichD27802-
1.5-mL plastic tube Thermo Fisher Scientific69715-
15-mL Centrifuge tube Thermo Fisher Scientific7252018-
50-mL Centrifuge tube Thermo Fisher Scientific1132017-
8-Well chamber slideThermo Fisher Scientific1109650-
AcetoneMerckSAAR1022040LC-
Amoeba strainATCCÒ30234TM-
ATCC medium 712ATCCÒ712TMAmoeba medium
Black 96-well microtiter plateThermo Fisher Scientific152089-
CentrifugeHermle--
ChloroformSigma-AldrichC2432-
Confocal microscopeNikonNikon TE 2000-
Epoxy resin:
[1] NSA[1] ALS[1] R1054-
[2] DER 736[2] ALS[2] R1073-
[3] ERL Y221 resin[3] ALS[3] R1047R-
[4] S1 (2-dimethylaminoethanol)[4] ALS [4] R1067-
Fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichF4274-
Formic AcidSigma-Aldrich489441-
Fluoroskan Ascent FLThermo Fisher Scientific374-91038CMicroplate reader
GlucoseSigma-AldrichG8270-
GlutaraldehydeALSR1009-
HemocytometerBoeco--
Lead citrateALSR1209-
Liquid Chromatography Mass SpectrometerThermo Fisher Scientific-
MethanolSigma-AldrichR 34,860-
Orbital shakerLasec --
Osmium tetroxideALSR1015-
pHrodo Green Zymosan A BioParticlesLife TechnologiesP35365This is the pH-sensitive dye
Physiological buffer solutionSigma-AldrichP4417-50TAB-
Rotary shakerLabcon--
Sodium phosphate buffer:
[1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate [1] Merck[1] 106580-
[2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate[2] Merck [2] 106345
Transmission electron microscopePhilipsPhilips EM 100 -
Trypan blue Sigma-AldrichT8154-
UltramicrotomeLeicaEM UC7-
Uranyl acetateALSR1260A-
Vacuum dessicatorLasec --
VialSigma-Aldrich29651-U-
YNBLasec 239210-
YPD agarSigma-AldrichY-1500-

Referências

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