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Resumen

Este artículo detalla un protocolo para preparar un cocultivo de células criptocócicas y amebas que se estudia utilizando imágenes fijas fluorescentes e imágenes de microscopio electrónico de transmisión de alta resolución. Aquí se ilustra cómo los datos cuantitativos pueden complementar esa información cualitativa.

Resumen

Para simular la infección por Cryptococcus, la ameba, que es el depredador natural de las células criptocócicas en el entorno, se puede utilizar como modelo para macrófagos. Este organismo depredador, similar a los macrófagos, emplea fagocitosis para matar las células internalizadas. Con la ayuda de un microscopio de exploración láser confocal, se capturan imágenes que representan momentos interactivos entre las células criptocócicas y la ameba. La potencia de resolución del microscopio electrónico también ayuda a revelar el detalle ultraestructural de las células criptocócicas cuando están atrapadas dentro de la vacuola de alimentos de la ameba. Dado que la fagocitosis es un proceso continuo, los datos cuantitativos se integran en el análisis para explicar lo que sucede en el momento en que se captura una imagen. Para ser específicos, se leen unidades de fluorescencia relativa para cuantificar la eficiencia de la ameba en la internalización de las células criptocócicas. Para este propósito, las células criptocócicas se tiñen con un tinte que las hace fluorescencia una vez atrapadas dentro del ambiente ácido de la vacuola alimentaria. Cuando se utiliza en conjunto, la información recopilada a través de estas técnicas puede proporcionar información crítica para ayudar a sacar conclusiones sobre el comportamiento y el destino de las células cuando se internalizan por la ameba y, posiblemente, por otras células fagocíticas.

Introducción

Los microbios han evolucionado con el tiempo para ocupar y prosperar en diferentes nichos ecológicos como los límites físicos abiertos del suelo y el agua, entre otros1. En estos nichos, los microbios a menudo participan en la competencia directa por recursos limitados; importante, para los nutrientes que utilizan para apoyar su crecimiento o espacio,que necesitan para acomodar a la población en expansión 2,3. En ciertos casos, algunos organismos holozoicos como la ameba pueden incluso ser anteriores a las células criptocócicas como una forma de extraer nutrientes de su biomasa4,5. A su vez, esto permite a estos organismos establecer el dominio territorial mediante el control del número de población de su presa. Debido a esta presión depredadora, algunas presas pueden ser seleccionadas para producirfactores microbianos, como la cápsula criptocócica 6, para conciliar los efectos negativos de la presión. Sin embargo, como consecuencia involuntaria de esta presión, algunos microbios adquieren factores que lespermiten cruzar la barrera de las especies y buscar nuevos nichos para colonizar 7, como los espacios confinados del cuerpo humano que son ricos en nutrientes y tienen ideal Condiciones. Este último puede explicar cómo un microbio terrestre como Cryptococcus (C.) neoformans pueden transformarse para convertirse en patógenos.

Con este fin, es importante estudiar el contacto inicial que las células criptocócicas pueden tener con la ameba y cómo esto puede seleccionarlas para convertirse en patógenas. Más específicamente, Esto puede dar pistas sobre cómo se comportan las células criptocócicas cuando se actúa sobre los macrófagos durante la infección. Es por esta razón que la ameba fue elegida como modelo para macrófagos aquí, ya que es relativamente barato y fácil de mantener un cultivo de ameba en un laboratorio8. De interés era también examinar cómo los metabolitos secundarios criptococcales viz. 3-hidroxi ácidos grasos9,10 influyen en la interacción entre las amebas y las células criptocócicas.

Una forma sencilla de percibir la interacción entre la ameba y su presa a simple vista es crear un césped usando su presa en la superficie de una placa de agar y ameba plana. La visualización de placas o zonas claras en la placa de agar representa áreas donde la ameba puede haberse alimentado de su presa. Sin embargo, a este nivel macro, sólo se observa el resultado del proceso, y el proceso de fagocitosis se mecaniza no se puede observar. Por lo tanto, para apreciar el proceso de célula a célula, hay varios métodos microscópicos que se pueden utilizar11,12. Por ejemplo, un microscopio invertido con una cámara de incubación se puede utilizar para grabar en vídeo un lapso de tiempo de eventos entre una célula fagocítica y su objetivo13. Desafortunadamente, debido al costo de un microscopio con una funcionalidad de lapso de tiempo, no siempre es posible que los laboratorios compren un microscopio de este tipo, especialmente en entornos de recursos deficientes.

Para eludir la limitación anterior, este estudio presenta un diseño exploratorio secuencial que evalúa la interacción de C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 y C. neoformans LMPE 046 con Acanthamoeba castellani . En primer lugar, se utiliza un método cualitativo que precede a un método cuantitativo. Las imágenes fijas se capturan utilizando un microscopio de fluorescencia invertida, así como un microscopio electrónico de transmisión para representar interacciones de ameba-Cryptococcus. Esto fue seguido por la cuantificación de la fluorescencia utilizando un lector de placas para estimar la eficiencia de la ameba para internalizar las células criptocócicas. Al conciliar los hallazgos de estos métodos durante la etapa de interpretación de datos, esto puede revelar tanta información crítica como la de la aplicación de un vídeo de lapso de tiempo de fagocitosis.

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Protocolo

Cryptococcus neoformans y algunas cepas de Acanthamoeba castellanii se consideran patógenos de nivel 2 de bioseguridad (BSL-2); por lo tanto, los investigadores deben tomar las precauciones adecuadas al trabajar con estos organismos. Por ejemplo, el personal de laboratorio debe tener capacitación específica y equipo de protección personal (EPP) como abrigos de laboratorio, guantes y protección ocular. Se debe utilizar un armario de seguridad biológico (nivel 2) para procedimientos que puedan causar infección14.

1. Cultivo y estandarización de células fúngicas (modificadas a partir de Madu et al. 15 )

  1. Saca las cepas de hongos de prueba (es decir, C. neoformans UOFS Y-1378 y C. neoformans LMPE 046) de cultivos de stock (no mayores de 9 meses) en placas de agar levadura-peptona-dextrosa (YPD). La información sobre los ingredientes del agar YPD se puede encontrar en la Tabla1.
    NOTA: C. neoformans UOFS Y-1378 ha demostrado producir ácidos grasos 3-hidroxi, mientras que C. neoformans LMPE 046 no produce 3-hidroxi ácidos grasos. Consulte el archivo suplementario 1 para obtener información sobre cómo se determina la presencia de estas moléculas.
  2. Incubar las placas de agar durante 48 h a 30oC.
    NOTA: Una placa se puede almacenar durante un máximo de 2 meses a 4 oC antes de que se pueda desechar o utilizar para hacer un cultivo de stock16.
  3. Raspar un bucle lleno de células criptocócicas (C. neoformans UOFS Y-1378 o C. neoformans LMPE 046) de la placa de 48 h de edad e inocular en un matraz cónico de 250 ml que contiene 100 ml del caldo YNB definido químicamente (6,7 g/L) complementado con 4% ( w/v) glucosa. La información sobre los ingredientes del caldo YNB se puede encontrar en la Tabla2.
  4. Incubar los matraces a 30oC durante 24 h mientras agita a 160 rpm en una coctelera rotativa.
  5. Después de un período de incubación de 24 h, cuente las células fúngicas usando un hemocitómetro y ajuste el número de células a 1 x 106 células/ml con PBS a pH 7.4.
    NOTA: El inóculo Preparado C. neoformans UOFS Y-1378 se utilizó en los pasos 3.1 y 3.2, mientras que C. neoformans LMPE 046 inóculo sólo se utilizó en el paso 3.2.

2. Cultivo y estandarización de células de ameba (modificadas a partir de Madu et al. 15 )

  1. Descongelar un cultivo de acanthamoeba castellanii y llevarlo a temperatura ambiente (RT).
    NOTA: Ameba se preparó sobre la base de los protocolos modificados de Axelsson-Olsson et al.8 y Schuster17.
  2. Pipetear 1 ml del cultivo descongelado y inocularla en un tubo centrífugo de 50 ml que contenga 15 ml de ATCC medio 712. La información sobre los ingredientes del medio ATCC 712 se puede encontrar en la Tabla3.
  3. Agitar manualmente suavemente e inmediatamente centrifugar durante 5 min a 400 x g y 30 oC.
  4. Aspira al sobrenadante.
  5. Resuspender las células en 15 ml de ATCC medio 712 e incubar el tubo a 30 oC durante 14 días.
    NOTA: Revise periódicamente las células, utilizando un microscopio de luz simple, para determinar si están en un estado de trofozoíto. Una vez que estén en un estado de trophozoita, comience una nueva cultura.
  6. Pipetear 1 ml de un cultivo que muestra las células en estado de trophozoita y utilizarla para inocular un tubo de centrífuga estéril de 50 ml que contiene 15 ml de medio ATCC fresco y estéril 712.
  7. Incubar el tubo a 30 oC durante 1 semana mientras agita a 160 rpm en una coctelera rotativa.
  8. Después de una semana, cuente las células de la ameba usando un hemocitómetro y ajuste el número de celda a 1 x 107 células/ml con medio ATCC fresco y estéril 712.
  9. Realice un ensayo de viabilidad utilizando una mancha azul trypan como se detalla en Strober18. Continúe con las culturas que muestran al menos un 80% de viabilidad.

3. Tinción de fluorescencia de células para estudiar fagocitosis (modificada de Madu et al. 15 )

  1. Recopilación de datos cualitativos mediante el uso del microscopio de fluorescencia
    NOTA: Realice este ensayo con Acanthamoeba castellanii y C. neoformans UOFS Y-1378.
    1. Dispensar una suspensión de 200-L de amebae estandarizada (1 x 107 células/ml en el medio ATCC 712) en los pozos de cámara de una diapositiva adherente e incubar durante 2 h a 30 oC para que las células se adhieran a la superficie.
    2. Mientras que las células de ameba se están asentando para adherirse, mancha las células estandarizadas de C. neoformans UOFS Y-1378 que se ajustaron a 1 x 106 células/ml (en 999 l de PBS) con 1 l de isotiocianato de fluoresceína en un tubo de plástico de 1,5 ml.
      NOTA: Preparar la mancha disolviendo 1 mg de isotiocianato de fluoresceína en 1 ml de acetona.
    3. Agitar suavemente las células UOFS Y-1378 de C. neoformans en un agitador orbital a 50 rpm durante 2 h en RT y en la oscuridad.
    4. Después de 2 h, centrífuga a 960 x g durante 5 min a 30 oC para peletizar las células.
    5. Aspirar el sobrenadante para quitar el PBS con la mancha.
    6. Añadir 1 ml de PBS al tubo para lavar el pellet celular. Lave las células pipeteando suavemente.
    7. Centrifugar las células a 960 x g durante 5 min a 30 oC. Descarta el sobrenadante. Repita el paso de lavado una vez más.
    8. Resuspenda las células lavadas en 1 ml de PBS.
    9. Dispensar una suspensión de 200 l de las células teñidas de C. neoformans UOFS Y-1378 a los pozos de la cámara que contienen las células de ameba no manchadas.
    10. Incubar el cocultivo preparado a 30oC durante un período adicional de 2 h.
      NOTA: El cocultivo se puede incubar para diferentes puntos de tiempo para adaptarse al propósito del experimento.
    11. Al final del período de co-incubación, aspirar el contenido de los pozos.
    12. Añadir 300 sl de PBS a los pozos para lavar los pozos de la cámara y eliminar las células co-cultivadas sin ataduras. Haz esto con un suave pipeteo. Aspirar el contenido de los pozos. Repita el paso de lavado una vez más.
    13. Preparar la solución de glutaraldehído al 3% añadiendo 3 ml de glutaraldehído a 97 ml de agua destilada.
    14. Fijar las células co-cultivadas añadiendo 250 sl de solución del 3% a los pozos de la cámara e incubando durante 1 h.
    15. Aspirar el fijador y lavar los pozos de la cámara como se detalla en el paso 3.1.13.
    16. Desmontar los pozos de la cámara utilizando una herramienta que se proporcionó con las diapositivas de la cámara.
    17. Agregue una gota del compuesto antifade, 1,4-diazabicyclo-[2.2.2]-octanano a la diapositiva para evitar el autoblanqueo. Cubra con un cubreobjetos y cierre los lados con un esmalte de uñas para evitar la evaporación.
    18. Vea las células co-cultivadas utilizando la lente objetivo 100x (con aceite) de un microscopio de exploración láser confocal.
      NOTA: Es importante tomar fotografías en campo brillante y fluorescencia para ver la interacción entre la ameba y las células criptocócicas. Siempre que sea posible, la fluorescencia puede ser superimpuesta a las imágenes de campo brillante. Las células de ameba son típicamente más grandes en tamaño (es decir, 45-60 m), y las células trofozoítas tienen una forma irregular. Las células criptocócicas tienen un diámetro de 5-10 m y tienen una forma globosa a ovoide. Cuando se exponen a un láser, es posible que las células de ameba no manchadas emitan autofluorescencia. Consulte Beisker y Dolbeare19 y Clancy y Cauller20 para obtener métodos para reducir la autofluorescencia.
  2. Adquisición de datos cuantitativos mediante el uso del lector de placas de fluorescencia
    NOTA: Realice este ensayo con Acanthamoeba castellanii y C. neoformans UOFS Y-1378 o C. neoformans LMPE 046.
    1. Dispensar una suspensión de 100 l de amebae estandarizada (ajustada a 1 x 107 células/ml en el medio ATCC 712) en una placa microtíter negra de 96 pocillos.
    2. Incubar la placa durante 2 h a 30 oC para permitir que las células de ameba se adhieran a la superficie.
    3. Mientras que las células de ameba se están asentando para adherirse, mancha las células estandarizadas de C. neoformans UOFS Y-1378 que se ajustaron a 1 x 106 células/ml (en 999 l de PBS) con 1 l de pHrodo Green Zymosan A BioParticles en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mancha C. neoformans LMPE 046 células también en un tubo separado.
      NOTA: El tinte, a diferencia de FITC, tiñe selectivamente las células que están atrapadas dentro del ambiente ácido de una célula fagocítica21,22. Para esta técnica, es importante mantener las células criptocócicas en un medio con un pH neutro (PBS) y ameba en un medio con un pH neutro (medio ATCC 712). Un medio con un ambiente ácido dará lugar a una lectura falsa positiva de las unidades de fluorescencia relativa, lo que implica que se ha interiorizado un mayor número de criptococos.
    4. Agitar suavemente las células criptocócicas en un agitador orbital a 50 rpm durante 2 h en RT y en la oscuridad.
    5. Después de 2 h, centrifugar el tubo de microcentrífuga a 960 x g durante 5 min a 30 oC para peletizar las células. Aspirar el sobrenadante para eliminar PBS con la mancha.
    6. Agregue 1 ml de PBS al tubo para lavar las células peletadas. Lave las células con un pipeteo suave.
    7. Centrifugar las células a 960 x g durante 5 min a 30 oC. Descarta el sobrenadante. Repita el paso de lavado una vez más.
    8. Resuspenda el pellet de células lavadas en 1 ml de PBS.
    9. Dispensar una suspensión de 100 l de células criptocócicas manchadas a pozos que contienen células ameba no manchadas.
    10. Incubar el cocultivo preparado a 30oC durante un período adicional de 2 h.
      NOTA: El cocultivo se puede incubar para diferentes puntos de tiempo para adaptarse al propósito del experimento.
    11. Al final del período de co-incubación, mida la fluorescencia en un lector de microplacas. Convierta señales logarítmicas en unidades de fluorescencia relativas.
      NOTA: La excitación del tinte es de 492 nm y la emisión es de 538 nm. Consulta a Beisker y Dolbeare19 y Clancy y Cauller20 para conocer los métodos para reducir la autofluorescencia.

4. Uso de la microscopía electrónica de transmisión para estudiar la fagocitosis (modificada de van Wyk y Wingfield 23)

  1. Añadir una suspensión de 5 ml de amebae (ajustada a 1 x 107 células/ml en el medio ATCC 712) a un tubo centrífugo de 15 ml y permitir que se asienten durante 30 minutos a 30 oC.
  2. Agregue una suspensión de 5 ml de células UOFS Y-1378 de C. neoformans (ajustadas a 1 x 106 células/ml en PBS) al mismo tubo de centrífuga que contiene 5 ml de células de ameba estandarizadas.
  3. Deje reposar el soporte del tubo durante 2 h a 30 oC.
  4. Centrifugar el tubo a 640 x g durante 3 min a 30 oC para peletizar las células co-cultivadas. Aspira al sobrenadante. No lave las células co-cultivadas.
  5. Corrija las células co-cultivadas resuperando el pellet en 3 ml de 1,0 M (pH a 7,0) con fosfato sódico con un tampón de fosfato sódico del 3% de glutaraldehído durante 3 h.
  6. Centrifugar el tubo a 1.120 x g durante 5 min a 30 oC para peletizar las células co-cultivadas. Aspira al sobrenadante.
  7. Añadir 5 ml de tampón de fosfato sódico al tubo centrífugo para lavar las células peletadas. Lavar pipeteando suavemente el contenido del tubo durante 20 s.
  8. Centrifugar el tubo a 1.120 x g durante 5 min a 30 oC para peletizar las células co-cultivadas.
  9. Repita los pasos 4.8-4.10. Aspira al sobrenadante.
  10. Corrija de nuevo las células co-cultivadas resuperando el pellet en 3 ml de 1,0 M (pH a 7,0) con fosfato sódico con tampón del 1% de tetróxido de osmio durante 1,5 h.
  11. Retire el fijador (tetróxido de osmio) lavando las células co-cultivadas de manera similar a la eliminación del 3% de glutaraldehído.
  12. Deshidratar el material TEM (también conocido como células co-cultivadas) en una serie de acetona saltona calificada de 30%, 50%, 70%, 95% y dos cambios de 100% para 15 min cada una, respectivamente. Para ello, añadir 3 ml de la solución de acetona a las células peletadas y dejar reposar durante 15 minutos. A continuación, centrífuga a 200 x g durante 10 minutos en RT Desechar el sobrenadante y añadir el mayor porcentaje de la solución de acetona.
  13. Preparar el epoxi de la consistencia normal de acuerdo con el protocolo de Spur24.
    NOTA: La resina epoxi se utiliza para la sección.
  14. Incruste el material TEM en la resina epoxi recién preparada. Para ello, siga los pasos que se indican a continuación.
    1. Añadir 3 ml del epoxi recién preparado a un tubo que contenga el material TEM resuspendido en 3 ml de solución de acetona al 100%. Deje reposar el tubo durante 1 h.
    2. Centrifugar el tubo a 200 x g durante 10 min a 30oC. Aspirar la solución de epoxi-acetona.
    3. Añadir 6 ml del epoxi recién preparado al pellet en el tubo. Deje reposar el tubo durante 1 h.
    4. Centrífuga a 200 x g durante 10 min a 30oC. Aspirar toda la solución de epoxi-acetona.
    5. Añadir 3 ml del epoxi recién preparado al tubo. Deje que el tubo se quede de pie durante 8 h.
    6. Centrífuga a 200 x g durante 10 min a 30oC. Aspirar toda la solución epoxi
    7. Añadir 3 ml del epoxi recién preparado al tubo. Mantenga el material TEM en la solución epoxi durante la noche en un desecador al vacío.
      ADVERTENCIA: La resina epoxi es un material radiactivo. Utilice PPE para manipular la resina epoxi. La resina epoxi también debe manipularse en una campana de humo. Los investigadores deben seguir las normas de seguridad para desechar dicho material según lo especificado por cada país25.
  15. Polimerizar el material TEM durante 8 h a 70 oC.
  16. En el ultramicrotome, recorte pequeñas secciones de aproximadamente 0,1 mm x 0,1 mm y 60 nm de espesor del material incrustado en epoxi con un cuchillo de vidrio montado. Ensamble las secciones en una rejilla y coloque las rejillas en una caja de soporte de muestra TEM antes de la tinción.
  17. Mancha las secciones con una gota de 6% de acetato de ursionlo durante 10 min en la oscuridad. Asegúrese de que las secciones estén completamente cubiertas.
    NOTA: Reconstituir la mancha (6 g) en 100 ml de agua destilada.
    ADVERTENCIA: El acetato de urano es un material radiactivo. Use EPI para manipular el acetato de ursionl. El acetato de uranyl también debe manipularse en una campana de humo. Los investigadores deben seguir las normas de seguridad para desechar dicho material según lo especificado por cada país25.
  18. Enjuague las secciones sumergiéndolas cinco veces en un vaso de precipitados que contenga 100 ml de agua destilada.
    NOTA: El agua destilada debe desecharse en consecuencia, ya que contiene trazas de acetato de ursionl.
  19. Mancha la sección con una gota de citrato de plomo durante 10 minutos en la oscuridad. Asegúrese de que las secciones estén completamente cubiertas.
    NOTA: El citrato de plomo debe prepararse de acuerdo con el protocolo de Reynold26.
  20. Enjuague las secciones sumergiéndolas cinco veces en un vaso de precipitados que contenga 100 ml de agua destilada.
  21. Montar individualmente las rejillas con secciones manchadas en una caja de soporte de muestra TEM.
  22. Ver secciones con un microscopio electrónico de transmisión.

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Resultados

Los microbios son organismos microscópicos que no se pueden percibir a simple vista. Sin embargo, su impacto puede resultar en enfermedades observables clínicamente evidentes, como infecciones de la piel. Al estudiar ciertos aspectos de los microbios, que van desde su morfología, subproductos e interacciones, ser capaz de proporcionar evidencia pictórica y de vídeo es de suma importancia.

Primero buscamos visualizar la inte...

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Discusión

En el documento, se emplearon con éxito diferentes técnicas para revelar el posible resultado que puede surgir cuando la ameba interactúa con las células criptocócicas. También, estábamos interesados en mostrar los efectos de los ácidos grasos 3-hidroxi en el resultado de las interacciones Cryptococcus-amoeba.

La primera técnica utilizada fue la microscopía confocal, que representaba imágenes fijas. El principal inconveniente de esta técnica aquí fue que sólo nos dio inf...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

El trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Sudáfrica (número de subvención: UID 87903) y la Universidad del Estado Libre. También estamos agradecidos con los servicios y la asistencia ofrecidos por Pieter van Wyk y Hanlie Grobler durante nuestros estudios de microscopía.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octaneSigma-AldrichD27802-
1.5-mL plastic tube Thermo Fisher Scientific69715-
15-mL Centrifuge tube Thermo Fisher Scientific7252018-
50-mL Centrifuge tube Thermo Fisher Scientific1132017-
8-Well chamber slideThermo Fisher Scientific1109650-
AcetoneMerckSAAR1022040LC-
Amoeba strainATCCÒ30234TM-
ATCC medium 712ATCCÒ712TMAmoeba medium
Black 96-well microtiter plateThermo Fisher Scientific152089-
CentrifugeHermle--
ChloroformSigma-AldrichC2432-
Confocal microscopeNikonNikon TE 2000-
Epoxy resin:
[1] NSA[1] ALS[1] R1054-
[2] DER 736[2] ALS[2] R1073-
[3] ERL Y221 resin[3] ALS[3] R1047R-
[4] S1 (2-dimethylaminoethanol)[4] ALS [4] R1067-
Fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichF4274-
Formic AcidSigma-Aldrich489441-
Fluoroskan Ascent FLThermo Fisher Scientific374-91038CMicroplate reader
GlucoseSigma-AldrichG8270-
GlutaraldehydeALSR1009-
HemocytometerBoeco--
Lead citrateALSR1209-
Liquid Chromatography Mass SpectrometerThermo Fisher Scientific-
MethanolSigma-AldrichR 34,860-
Orbital shakerLasec --
Osmium tetroxideALSR1015-
pHrodo Green Zymosan A BioParticlesLife TechnologiesP35365This is the pH-sensitive dye
Physiological buffer solutionSigma-AldrichP4417-50TAB-
Rotary shakerLabcon--
Sodium phosphate buffer:
[1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate [1] Merck[1] 106580-
[2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate[2] Merck [2] 106345
Transmission electron microscopePhilipsPhilips EM 100 -
Trypan blue Sigma-AldrichT8154-
UltramicrotomeLeicaEM UC7-
Uranyl acetateALSR1260A-
Vacuum dessicatorLasec --
VialSigma-Aldrich29651-U-
YNBLasec 239210-
YPD agarSigma-AldrichY-1500-

Referencias

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  6. Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
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