小鼠表皮角质细胞的分离及其体外克隆培养物

摘要

该协议的目标是从成年小鼠的背皮中分离表皮角蛋白酶,用于各种下游应用,如分子生物学、生物化学、荧光活化细胞分类和主要体外用途(例如,克隆角质细胞)。

摘要

此处描述的协议是从成年雌性小鼠(54 ~ 2 天大)中采集原生角膜的可靠方法,每只小鼠产生大约 30 x 10⁶个活细胞。主要成年小鼠角蛋白细胞是从雌性小鼠的背皮中采集的。雄性小鼠(约6周大)可用于角蛋白细胞收获,具体取决于实验的要求。安乐死小鼠用波维酮碘和乙醇溶液(70%酒精)的连续洗液进行洗除了。对小鼠进行消毒后,去除背皮,用手术刀去除皮下脂肪和肌肉并丢弃。皮肤被切成小块,用温和的低温试穿处理,从表皮分离下真皮。刮伤的表皮以低速搅拌,过滤以去除毛发,计数,并在培养培养基中重新悬浮。该方法为许多下游应用提供了高培养细胞的优异单细胞悬浮液。

引言

哺乳动物皮肤覆盖整个身体,并服务于多种功能(例如,主要物理屏障、温度调节和保湿)。在过去的五十年里,对小鼠皮肤的基础研究已经产生了关于皮肤结构和功能的新信息。小鼠皮肤模型极大地有助于理解化学或紫外线辐射诱发致癌的复杂分子机制背后的基本生物学。这些小鼠皮肤模型为了解人类皮肤病及其缓解提供了重大贡献。为了进一步探索毛囊发育生物学、干细胞研究、致癌和表皮遗传探索中原发角蛋白细胞的进一步分子解剖,经常需要分离和培养原发上皮从小鼠皮肤的角质细胞与体内实验并行使用。开发这种方法的激励因素是需要对克隆表皮和毛囊干细胞1、2进行体外测定。还迫切需要表皮细胞的单细胞悬浮,适合克隆测定3、荧光活化细胞分选和流式细胞测定3、4。这种方法的优点是,与其他方法5、6、包括毛囊的上皮部分和收获细胞的高可栽培性时,收获量增加一个数量级。在20世纪80年代,没有已知的方法可以满足这些要求。在随后的几年中,这种方法被改进以提高细胞产量。这种方法的主要局限性是掩盖一些胰蛋白酶敏感抗体,这将损害免疫反应6。

这些小鼠根据特定无病原体指南接受饲养。获得1至5只54~2天年龄的雌性小鼠。在年龄较大的小鼠中,角蛋白细胞的生存能力将由于头发周期的阿氏相(生长)而降低。此外,与幼鼠相比,胰蛋白酶化的过程更加困难。收获程序已经成功地针对雌性小鼠比雄性更薄的皮肤进行了优化。雄性小鼠通常不用于角蛋白细胞收获,因为它们有在住房期间相互争斗的倾向,因此可能在皮肤上留下划痕或伤口。

研究方案

所有脊椎动物使用协议均已获得明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会的批准,符合推荐的NIH和政府指南。

1. 进纸层初始化和子培养

1. 将小瓶放入37°C水浴中1-2分钟,从液氮罐中解冻一个含有冷冻瑞士小鼠3T3的细胞小瓶。小瓶中的细胞数量约为1 x10 6。
2. 当最后一片冰融化时,取出3T3细胞小瓶。用70%的酒精拭子擦拭管子。然后,将小瓶转移到生物安全柜。
3. 缓慢地将细胞转移到T-150瓶中,用1mL的CGM培养液冲洗3T3小瓶。缓慢地向细胞中加入30 mL的预加热 3T3 完整生长介质 (CGM)。轻轻摇动烧瓶,均匀地铺开3T3成纤维细胞。用细胞线详细信息、日期和通道号适当标记烧瓶。
4. 在37°C下孵育细胞,CO₂为5%,湿度为95%。
   注:根据ATCC,瑞士鼠标3T3的翻倍时间是18小时;当汇入(接触抑制),密度约为40,000细胞每厘米2。初始化后,我们在 10-15 个通道内使用特定的 3T3 线。更快速的生长或主轴状细胞的存在可能发生在更高的通道,通常是一个迹象,3T3将不作为成人小鼠角蛋白细胞的馈料细胞。如果发生快速生长,最好从下通道单元启动一条新线。
5. 24小时后更换介质以去除死细胞和剩余的DMSO(冷冻保存剂),此后每周两次。允许细胞增殖约80%汇合,并使用T-150烧瓶进行培养启动。初始化后,使用 T-225 烧瓶进行亚培养。
6. 亚培养3T3成纤维细胞,从细胞培养箱中取出烧瓶,用冷无菌PBS(1x)用温霉素洗涤两次。预加热(37°C 水浴)胰蛋白酶溶液(0.25%)进入每个T-225烧瓶。
   1. 将烧瓶放在加热板上3-8分钟,取出烧瓶,轻轻用手掌敲打烧瓶壁,分离细胞,并在倒置显微镜下确认细胞分离。胰蛋白酶溶液在分离的3T3细胞中可能呈多云。
7. 将胰蛋白酶溶液3⁄4x移至烧瓶的细胞生长表面,在50 mL锥形管中将胰蛋白酶化细胞转移到30 mL的CGM。用 50 mL 锥形管中 10 mL 的 CGM-胰蛋白酶 -细胞混合物重新清洗烧瓶 3⁄5x。
   注:两个烧瓶内容物的内容可添加到50 mL管中;如果只使用一个烧瓶,则将10 mL的胰蛋白酶/细胞放入20 mL的CGM管中。
8. 在 4°C 下将 50 mL 锥形管在 160 x g下离心 7 分钟。
9. 现在吸出上清液,用5 mL的CGM重新悬浮细胞颗粒,轻轻移液+10倍,完全破坏细胞颗粒。加入 10 mL 的 CGM,使 50 mL 锥形管的总体积达到 15 mL。
   1. 再次混合 +10x,将 5 mL 的电池悬架放入 3 个单独的 T-150 瓶中。T-225 烧瓶中的亚培养比为 1:3,T-150 烧瓶中的亚培养比为 1:4。在每个烧瓶中加入 30 mL 的预加热 3T3 CGM。
10. 用细胞线名称、细胞播种日期和通道编号标记烧瓶。
11. 要在亚培养步骤离心后冻结 3T3 细胞,请从离心机中取出 50 mL 管,并放置在冰桶上。吸进上清液,用1 mL的5%DMSO-DMEM混合物重新悬浮细胞颗粒(见表1),用于收获的每个烧瓶。
12. 将1 mL的DMSO-DMEM混合物与细胞悬浮液放入每个冷冻室(每3T3烧瓶收获一个冷冻液)。用通道号、细胞线名称 (3T3) 和细胞被冻结的日期标记小瓶。
13. 将这些 3T3 电池小瓶放入电池冷冻罐(参见材料表),并转移到 -70°C 冷冻室,时间超过 5 小时。 小心地从电池冷冻罐中取出并转移小瓶,并放入液氮储存罐中,以便长期存放,直到下次使用.在实验室液氮库存表中输入有关细胞系名称、罐中位置和日期的信息。

2. 为 X 射线辐照和播种准备 3T3 进料层

1. 在3T3细胞照射前一周制备,并允许它们生长+100%汇合。3T3 细胞通常在 120 到 130 的通道内。
2. 为了成功进行原发性角膜细胞的克隆化检测,在播种3T3细胞之前,表面涂上60毫米培养物,涂上胶原蛋白。
   1. 将胶原涂层溶液移至60 mm培养皿中,以覆盖底面并去除多余的胶原蛋白涂层液体(见表1)。将培养皿转移到 37°C 的培养箱中,其中 5% CO₂至少 1 小时。不要让盘子在培养箱中干燥。
3. X 射线照射步骤:按照步骤 1.4_1.6 操作。使用 50 mL 的新鲜 CGM 重新悬浮细胞颗粒,关闭锥形管,并使用石蜡密封膜密封。为避免任何污染,请使用塑料袋将含有管的石蜡密封电池翻倍,并放在冰上。基于线霉素的替代进纸层可用于角蛋白细胞培养7。
4. 用生物X射线机照射50 mL锥形管中的成纤维细胞3T3细胞,剂量为5,000 rads(50 Cgy)。与 CGM 介质一起照射这些细胞。
   1. X射线照射后,在160 x g下,离心细胞在4°C下7分钟。吸出上清介质,用 5 mL 的 CGM 三聚物轻轻悬浮细胞颗粒 ,轻轻悬浮 ±10 倍。现在,将最终体积增加到 30 mL,增加 25 mL 的介质和三聚位 10 倍。这些三元测定步骤对于统一的3T3成纤维细胞层进行克隆性测定至关重要。
5. 活细胞计数:使用常规玻璃血细胞计计算角蛋白细胞。取取约0.5 mL的细胞,放入1.5 mL管中。去除200μL的细胞混合物,加入0.4%的等量试胰蓝溶液和混合物3-4倍。使用血细胞计转移细胞,并将所有成核细胞(小金和粉红色细胞)计数为活细胞。计算活的金细胞的最终浓度。
6. 移液器 1 x 10⁶ 3T3 细胞 (最少 7 x 10⁵) 细胞可用于 60 毫米胶原蛋白涂层培养皿 (步骤 2.2) 并轻轻地添加 4 mL 的改性高钙威廉姆斯 E 介质 (见表 1)。允许新播种的 3T3 细胞连接 24 小时。第二天,收获新鲜的原色角膜细胞,并将其播种在附着的3T3成纤维细胞层之上,用于克隆测定,如下所示。

3. 初级角膜细胞收获和播种

1. 根据批准的动物设施/IACUC标准,通过CO2吸入对4至5只成年雌性小鼠进行安乐死。然而,此协议也可用于单雌性/雄性小鼠。
   1. 用电动动物夹子夹住大约9^厘米的背毛,将所有被夹住的老鼠放入一个500 mL的罐子中,用足够的povidone碘防腐剂溶液(不擦洗),以覆盖它们1⁄2分钟。 摇匀罐子,均匀地涂覆防腐剂解决小鼠。
   2. 倒出溶液,用清水冲洗,直到液体变清。重复相同的防腐剂洗涤,然后进行水冲洗。用碘溶液进行防腐洗涤后,将所有小鼠浸泡在70%乙醇中5-10分钟。
      注:有浅色毛皮的小鼠(例如BALB/c)在消毒碘洗液中会保留轻微的黄色,而较暗的小鼠(例如C57BL/6)则不会。值得注意的是,细胞活力或培养生长不受黄色影响。
2. 用拇指钳和剪刀在层流罩中小心地去除被夹住的背肌皮肤。将切除的背皮放入充满PBS/2x根霉素的锥形管中。避免使用腹侧皮肤,以防止乳腺细胞污染在培养。
3. 使用高压灭子和手术刀,将一个背皮,一次毛茸茸的一面下到一个薄的培养皿。开始刮下所有皮下组织,包括皮肤组织腹侧脂肪,直到它半半透明。尝试去除皮下组织的最大痕迹,而不会撕裂皮肤(毛囊部分)。此外,不要刮很长一段时间,避免皮肤干燥。
   1. 在 PBS 溶液中保留刮伤的皮肤,直到处理所有其他剩余皮肤。使用手术刀,将皮肤切成 0.5 厘米 x 1⁄1.5 厘米的条,并将毛茸茸的一侧向上放在无菌培养皿上。
4. 小心移液器 20 mL 的 PBS/2x Gentamicin 溶液与胰蛋白酶混合 (0.25%)成100毫米×20毫米塑料培养皿。使用无菌钳子,转移皮肤,并在32°C培养箱中将毛多的一面浮在胰蛋白酶溶液表面2小时。
   注:胰蛋白酶化时间和温度对于高培养原皮质的优良产量至关重要。虽然其他方法可能提供良好的活细胞产量,但角蛋白细胞的可培养性却不太令人满意。
   1. 在这 2 h 的孵育时间内,用胶原蛋白涂层覆盖菜肴,并将其置于 37°C 1 小时(参见步骤 3.1.2)。对于克隆测定,60 mm 培养皿在角蛋白粒收获前 24 小时已涂覆,使辐照的 3T3 进料层附着在底部并均匀分布。
      注:为克隆培养物涂覆培养皿对于小鼠表皮角质细胞的正确附着、菌落形成和最终生长/增殖非常重要。
5. 表皮刮削步骤:在 30° 倾斜处布置无菌塑料方形培养皿,在 30° 斜坡处创建表面,以 15 mL 的收获介质进行适当的表皮刮擦(见表 1)。小心地从胰蛋白酶溶液中取出浮动的皮条,用弯曲的钳子。使用新的手术刀刀片,刮掉表皮和毛发到介质。
   1. 不要过度用力,但要用足够的力刮毛,否则会影响细胞的生存能力。
   2. 在表皮刮擦过程中,保持刀片垂直于皮肤片。如果刀片向刀片的运动倾斜,则有更多皮肤撕裂的机会。如果刀片离刀片运动较远,则更有可能去除表皮不足。
6. 小心地将含有刮擦表皮细胞的收获培养基倒入无菌的 60 mL 罐中(可高压灭和可重复使用),并带有 1.5 英寸的磁搅拌棒。用额外的收获培养基冲洗培养皿,以收集剩余的表皮细胞,并将最终体积至30 mL。使用磁力搅拌器,在室温下以 100 rpm 搅拌 20 分钟。此过程将从头发上去除被困的表皮细胞。
7. 将无菌的 70 μm 细胞滤网放在 50 mL 锥形管的顶部。细胞滤网适合在 50 mL 锥形管的顶部。
   1. 把罐子放在生物安全罩里取出搅拌棒,将内容物倒入连接到 50 mL 锥形管上的滤网过滤器中。应变出不需要的头发和角质层片。
   2. 按下头发与滤网内的角质层材料,并操纵它们释放被困的头发细胞。使用 5 mL 的收获介质,让剩余的被困细胞释放并流入管中。在锥形管中使总体积达到 50 mL。
8. 将50 mL锥形管与细胞滤光剂盖住,在 4°C 下以 160 x g将离心机盖 7 分钟。接下来吸出上清液,并加入5 mL的收获介质。用 5 mL 移液器轻轻三聚 ±20x,重新悬浮细胞颗粒。
   1. 在此步骤中,将单元格保存在冰箱中以避免任何聚合。再次添加 25 mL 的收获介质和三聚酯(20–25x)。
   2. 为确保在此步骤中准确计数角蛋白细胞,请采用 1 mL 的细胞悬浮液并添加 19 mL 收获介质。现在细胞稀释是1:20在50 mL锥形管。如果角蛋白细胞是从单个鼠标中采集的,则调整细胞悬浮液的体积。而不是30 mL,使用15 mL,并作出1:10稀释计数细胞。
9. 从50 mL锥形管(1:20稀释)中移液0.5 mL的稀释细胞,并转移到1.5 mL的高压灭菌微离心管中。将0.2 mL(200 μL)的细胞混合物取出至另一根1.5 mL微离心管中,并加入0.4%试管蓝色溶液的等量(200μL)。轻轻地将溶液混合3倍,并将细胞转移到血细胞计,以计数成核角蛋白细胞。
   1. 将Trypan蓝色的所有深蓝色细胞打分为非活的死细胞,并将小金细胞和粉红细胞打为活细胞。每只小鼠的最终角蛋白细胞产量应约为3000万个活细胞。
10. 在 4°C 下,在 160 x g下将原 50 mL 锥形管(从步骤 3.8 起)离心 7 分钟。在此步骤中,将细胞重新悬浮在所需的培养基中,并进行种子化细胞所需的稀释。
    1. 对于大众培养,种子2至400万活金细胞在每个35毫米培养基培养皿(KGM型培养基 + 单层培养物补充剂)(见表1)。对于克隆(细胞形成)测定,种子1000细胞每60毫米培养皿在X射线辐照瑞士小鼠3T3进料层与胶原蛋白涂层和修改威廉的E介质与补充剂和血清。
    2. 分别使用 2 至 4 mL 培养基,分别用于 35 mm 和 60 mm 培养皿。此外,从ATCC采购的DMEM和Williams E介质,碳酸氢钠含量降低,用于5%的CO2。
11. 在32°C、95%湿度下用5%CO₂生长培养细胞(大质量或克隆细胞)。在首次播种大众文化后一天更改媒体,然后每周更换 3 次。然而,对于克隆测定,第一次介质变化是细胞播种后2天,之后每周3次。
12. 对于克隆培养,每隔两周和四周培养细胞。完成克隆培养(2 或4 周)后,吸气介质。在室温下将菌落固定在10%缓冲形式中过夜,并在高压灭菌水中用0.5%的红胺B染色1小时。然后,用移液器从盘子边缘去除罗达明B染色。
    1. 用冷高压水冲洗盘子,直到盘子变清。把盘子放在盘子的盖子上,让它们干燥,以便最终进行聚居计数。值得注意的是,在进行克隆培养测定时,切勿移液<1 mL的细胞。如果细胞浓缩,连续稀释细胞浓度。

结果

通常,每只小鼠的表皮角质细胞的产量范围从20 x 10⁶到 30 x 10⁶试青蓝(不包括细胞)获得^8,9。生存能力范围为80%-90%。典型的播种效率在24小时时附着率约为30%。 辐照3T3进料层上的菌落形成是每1000个为C57BL/6小鼠播种的活细胞中大约60个菌落,瑞士型小鼠每1000个细胞中大约30个菌^落10个。,11 .菌群形成测定的典型结果如图1所示。 毛囊干细胞的数量约为9%CD34 +/CD49f+C57BL/6小鼠12的干细胞。 流式细胞学的典型结果如图2所示。

图3说明了四种不同介质的生长特性。测试的介质包括KGM-Gold、SFM、威廉的E介质和莫里斯-2(一种基于威廉姆斯E的莫里斯实验室开发的钙减少介质)。

图1:成年小鼠克隆角蛋白细胞测定的代表性示例。这张照片显示角蛋白细胞群落的形成从CD-1雌性小鼠54天治疗主题1)无治疗,2丙酮后一个星期后丙酮每周两次两周,3)DMBA后,一个星期后丙酮每周两次两周后,4)丙酮随TPA一周两周,TPA每周两周,5)DMBA在一周后由TPA每周两次,为期两周。在体内治疗后,角蛋白细胞被收获,每道菜1000个细胞播种到辐照3T3的喂食层上,并培养两周,之后用缓冲形式固定菜肴,并沾染罗达明B。每列中的菜肴从每个小鼠处理组复制。请注意,使用DMBA治疗后,较大的菌落数量增加,在角蛋白细胞收获之前,菌落总数增加了小鼠的TPA治疗。缩写: DMBA: 7,12-二甲基苯甲酸苯甲酸;TPA: 12-O-tradecanphorbol-13-醋酸酯。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:成年小鼠毛囊干细胞流动细胞测定的代表性示例。简单地说,从背鼠皮肤中分离出分离的原发性角膜,并使用细胞过滤器过滤细胞碎片。分离的角膜细胞悬浮液标有CD49f或+6-整酸(PE)和CD34(FITC)抗体以及活死染料和其他对照。FITC和PE等型控制抗体(Rat IgG2akappa)用于补偿目的(见材料表)。干细胞通过CD49f(PE通道)进行选择,该通道可识别基底表皮和毛囊细胞上发现的血吸虫体的外部成分,以及识别毛囊干细胞的CD34(FITC通道)的外部成分(即CD34-FITC^|和 a6-PE⁼ (右上列,总计 5%))。右侧列显示不同的角蛋白细胞群,即仅CD34-FITC、CD34-FITC和a6-PE细胞(双阳性干细胞群)、仅6-PE和未染色细胞。请注意,有两个CD34⁺干细胞群已经报告6,14。请点击此处查看此图的较大版本。

图3:成年雌性小鼠表皮细胞原培养物的四种不同介质的比较。从背鼠皮肤中分离出原发性角质细胞,并使用四种不同的介质(KGM、SFM、威廉的E和莫里斯-2)进行播种。角蛋白细胞的模数相等,并遵循其一般形态和生长模式。请注意,增殖角蛋白细胞的形态略有不同。KGM、SFM 和 Morris-2 均减少钙介质,在 14 天后增长最为强劲。相反,在Williams E培养基中培养1.4 mM钙和高钾与钠比例时,细胞不会持续。令人惊讶的是,威廉姆斯E培养基与补充剂和20%的胎儿牛血清支持角蛋白细胞克隆培养远远优于任何其他介质测试,可能是因为丰富的威廉姆斯E介质帮助3T3进料细胞更好地"喂养"。请点击此处查看此图的较大版本。

解决方案和媒体	评论
收获解决方案
2.5% 胰蛋白酶 (5 mL)
杜尔贝科的 PBS (500 mL)
根塔霉素 (2 mL)
带 2x 根霉素 (45 mL) 的 PBS
磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 与 2x 根霉素
胰蛋白酶溶液
细胞培养解决方案
纯纤维化盘涂层溶液:
1 米 HEPES (1 mL)
116 mM CaCl2 (1 mL)
牛血清白蛋白 1.0 毫克/mL (10 mL)
细胞培养基(100 mL)
纤维奈丁 (1 毫克)
纯胶原蛋白 (1 mL)
细胞冷冻溶液
DMSO (2 mL)
具有 10% BCS 和笔链的 DMEM
收获介质	需要不含钙
2x 根霉素 (1 mL)
FBS (50 mL)
SMEM (500 mL)
高钙威廉姆斯的E媒体与:
EGF (5 μg/mL) 1 mL
谷氨酰胺 14.5 mL
氢皮质酮 (1 毫克/升) 0.5 mL
胰岛素 1 mL
利诺酸-BSA (0.1 毫克/升) 0.5 mL
MEM Ess 氨基酸 4 mL
MEM 维生素 5 mL
青霉素-链霉素 5 mL
转移剂 (5mg/mL) 1 mL
维特 A (1 毫克/1,000 μL) 57.5 μL
维特 E 1 毫克/升 (4°C) 3.5 μL
维特 D2 (10 毫克/升) 50 μL
3T3成纤维细胞完整生长介质(CGM)
BCS (100 mL)
DMEM (900 mL)
青霉素-链霉素 (10 mL)
克克姆	用于大众培养的介质是一种减少钙介质
莫里斯 2 中等与威廉姆斯的 E 相同的补充剂	威廉姆斯E与补充剂的钙变异减少

表 1:解决方案和媒体配方。

讨论

此处描述的角蛋白收割方法旨在从成年雌性小鼠的背上产生高可栽培的原发性表皮角质细胞的高产量。这些角蛋白细胞适用于流细胞学、分子生物学应用和原细胞培养,包括此处报告的克隆测定。这种角蛋白细胞采集方法也可用于研究其他下游方面,皮质化学致癌和肿瘤促进1,13。

协议中有几个关键步骤。首先,为了严格和可重复性,使用54~2天的雌性小鼠。这使我们能够从小鼠的多个菌株中执行敏感和定量的菌落测定,并在连杆分析中将它们用作表型,从而识别至少一种新的干细胞调控基因10,11。其次,将皮肤切成小块是有帮助的,因为胰蛋白酶化比试图保持皮肤完整更有效。第三,胰蛋白酶浮选的时间和温度对后续的可培养性非常重要。此外,需要"大量"地在过滤器上残留的毛发处,以去除附着的细胞。这一步对于获得高产量的细胞非常重要。此外,培养箱的32°C温度对于成年小鼠角蛋白细胞的长期培养非常重要。最后,在本协议中,体外和体内^实验1的并行读出基于原始培养物,而不是亚培养或细胞系。值得注意的是,如果首次使用此协议采集原发角膜,则通过组织病理学观察,保留刮伤后剩余的真皮,以确认毛囊与表皮的完全去除。

该协议用于收获成年小鼠角蛋白细胞的主要强度是,它产生适用于许多下游应用的高产可培养细胞。主要限制是,一些细胞表面表位可能对胰蛋白酶化敏感,因此免疫染色可能受到损害。因此,在测试新的细胞表面抗体时,谨慎使用基于消^用6或热解酶5的方法进行收获进行比较。该协议的意义是,它经过严格的测试,量化,并应用于各种应用,如检测的克隆干细胞1,9,10,11,为大规模培养在生物化学8,用于FACS分类干细胞分析3,4,分子生物学3,12,和正在进行的RNA和DNA测序。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue 1X in 0.9% saline	Life Technologies Gibco	15250-061
1 M HEPES Buffer	Sigma	H0887	Sterile
1.5-inch magnetic stir bar with pivot ring	Bel-Art, Wayne	371101128	in 2 oz Nalgene jar
10 mL disposable pipettes	BD Falcon	357551
15 mL sterile conical tube	BD Falcon	352097
150 cm2 (T-150) culture flask	Corning	430825
2 mL Screw Cap Micro Tube Conical	Sarstedt	72.608
2 oz Nalgene jar	Thermo Fisher Scientific	2118-0002	60 mL
2.5% Trypsin solution 10X	Life Technologies Gibco	15090-046
225 cm2 (T-225) culture flask	Corning	431082
32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG	Thermo Fisher Scientific	2019-1000	1000 mL
35-mm sterile culturing dish	Corning	430165
5 mL disposable pipets	BD Falcon	357543
50 mL sterile conicle tube	BD Falcon	352098
60-mm sterile culturing dish	Corning	430166
70% ethanol
90-mm diameter Spectra Mesh filter, 74-µm pore size	Spectrum Laboratories	145956
Antibiotics (penicillin-streptomycin)	Life Technologies Gibco	15140-122
Bovine calf serum (BCS)	Thermo Fisher Scientific Hyclone	SH30073.03
Bovine serum albumin	BD Biosciences	354331
CD34 Ram34 FITC conjugated antibody	BD Pharmingen	553733
CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody	BD Pharmingen	555736
Cell Strainer, 70-µm sterile	BD Discovery Labware	352350
Collagen, Bovine, Type I, 30mg	BD Biosciences	354231
CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials	Biocison	BCS-136PK
Corning 2mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom	Corning	430659
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Distilled Milli-Q water			made fresh; twice distilled reverse osmosis water
Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1X, Ca2+ and Mg2+ free	Life Technologies Gibco	14190-144	Sterile
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Hyclone	SH 300070.03
Fibronectin	Sigma	F1141-5MG
Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container	Fisher Scientific	16-320-730
Gentamicin 50 mg/mL 10	Life Technologies Gibco	15750-060
KGM	Lonza	CC-3103
Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16oz	Thermo Fisher Scientific	2116-0500
No. 22 sterile stainless-steel blades	BD Bard-Parker	371222
No. 4 scalpel handles	Biomedical Research Instruments	26-1200	In a cup with 70% ethanol
One pair of full-curve eye dressing forceps	Militex	18-784	In a cup with 70% ethanol
One pair of scissors	Biomedical Research Instruments	25-1050	In a cup with 70% ethanol
One pair of thumb dressing forceps	Militex	6-4	In a cup with 70% ethanol
Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade	Jarden Consumer Solutions/Oster	78997-010
Plastic Petri dish 100 mm X 20 mm sterile	Corning	430167
Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel	Corning	6240-75
Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody	BD Pharmingen	553929
Rat IgG2akappa PE isotype control antibody	BD Pharmingen	555844
SFM	Life Technologies Gibco	10725-018
SMEM	Life Technologies Gibco	11380-037
SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture	Life Technologies Gibco	11380-037
Square sterile plastic Petri dishes	BD Falcon	351112
Swiss mouse 3T3 fibroblasts	ATCC	CCL-92	used within 10 passages
Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16oz	Triad Group	10-8216
VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 X 10	VWR	25384-324
Williams E Medium	Life Technologies Gibco	12551-032
Ziploc bag