放射性脉冲追逐对活细胞蛋白质折叠、迁移和降解的分析

摘要

在这里, 我们描述了一种一般脉冲追逐方法的协议, 该方法允许在活细胞中对蛋白质的折叠、迁移和降解进行动力学分析。

摘要

放射性脉冲追逐标记是研究活细胞中目标蛋白的构象成熟、向其功能细胞定位的迁移以及目标蛋白降解的有力工具。通过使用短 (脉冲) 无线电标记时间 (lt;30 分钟) 和严格控制的追逐时间, 可以只标记总蛋白质池的一小部分, 并跟随其折叠。当与非还原性 sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds-page) 和免疫沉淀与 (符合特异性) 抗体结合, 可以非常详细地检查折叠过程。该系统已被用来分析蛋白质的折叠, 其特性有巨大的差异, 如可溶性蛋白质、单通和多通道跨膜蛋白、重 n 和 o-糖基化蛋白以及具有和不具有广泛二硫醚的蛋白质粘 接。脉冲追逐方法是一系列附加特征的动力学研究的基础, 包括共和后修饰、寡聚和聚合, 基本上允许分析从出生到死亡的蛋白质。通过提供更多的时间分辨率和生理信息, 对蛋白质折叠的脉冲追逐研究与其他生物生化和生物物理方法是相辅相成的。本文中描述的方法很容易适应于研究几乎任何蛋白质的折叠, 可以在哺乳动物或昆虫细胞系统中表达。

引言

即使是相对简单的蛋白质的折叠也涉及许多不同的折叠酶、分子伴侣和共价修饰¹。考虑到所涉及的大量不同成分,在体外完全重组这些过程实际上是不可能的。因此, 研究活细胞中的蛋白质折叠是非常可取的。放射性脉冲追逐技术被证明是研究蛋白质在自然环境中的合成、折叠、迁移和降解的有力工具。

蛋白质在带有³⁵s 标记的蛋氨酸标记的短脉冲中的代谢标记, 然后在没有放射性标签的情况下进行追逐, 从而可以在更广泛的细胞环境中对新合成的蛋白质群进行特定的跟踪。然后, 目标蛋白可以通过免疫沉淀分离, 并通过sds-page 或其他技术进行分析。对于许多蛋白质来说, 它们穿过细胞的旅程是由 sds-page 凝胶上可见的修饰所标记的。例如, 糖基化蛋白从内质网 (er) 传输到 golgi 复合物时, 往往会对 n-连锁的糖类进行修改, 或添加 o-连锁的糖基 2^,3。这些修饰会导致表观分子质量的大幅增加, 这可以从 sds-page 中的移动性变化中看出。成熟也可以表现为蛋白溶解裂解, 如信号肽裂解或去除亲肽, 导致表观分子质量的变化, 可以很容易地遵循 sds-page 凝胶⁴。与环己酰亚胺酶等可比技术相比, 放射性具有相当大的优势, 在这种技术中, 可以防止新的蛋白质合成, 因为较长的处理方法对细胞有毒, 并且不将大多数较旧的稳态蛋白质排除在分析, 因为一些蛋白质有半生的日子。蛋白质在非还原和还原条件下的比较可以分析二硫键的形成,这是许多分泌蛋白 4,^5,6折叠的一个重要步骤,⁷。

在这里, 我们描述了一个一般的方法来分析蛋白质折叠和运输在完整的细胞, 使用放射性脉冲追逐的方法。虽然我们的目标是提供尽可能详细的方法, 但该协议的适应性潜力几乎是无限的, 可以优化研究每个读者的特定蛋白质。

提供了两种可供选择的脉冲追逐协议, 一种用于粘附细胞 (此处介绍的协议的步骤 1.1) 和用于悬浮细胞的方案 (此处介绍的协议的步骤 1.2)。这里提供的条件足以想象用中高表达水平表达的蛋白质。如果读者使用的是表达不良的蛋白质或各种治疗后条件, 如多重免疫沉淀, 则有必要适当增加菜品大小或细胞数量。

对于悬架脉冲追逐, 在每个时间点采集的追逐样本都是从一管细胞中提取的。在脉冲被省去之后洗涤步;相反, 进一步加入^35s是通过稀释高过量的未标记蛋氨酸和半胱氨酸。

所提出的协议使用放射性³⁵s 标记半胱氨酸和蛋氨酸来跟踪细胞蛋白折叠过程。所有使用放射性试剂的操作都应使用适当的保护措施, 以尽量减少操作人员和环境受到放射性辐射的任何照射, 并在指定的实验室进行。由于脉冲追逐标记技术在短脉冲时间 (& lt;15 分钟) 下效率相对较低, 新合成的蛋白质中加入的放射性起始量不到1%。通过免疫沉淀浓缩目标蛋白后, sds-page 样品中放射性起始量的含量不到0.05%。

虽然³⁵s 蛋氨酸和半胱氨酸标记混合物是稳定的, 一些分解, 产生挥发性放射性化合物, 将发生。为了保护研究人员和仪器, 应采取一些预防措施。研究人员应始终遵守当地的辐射安全规则, 除了实验室外套和 (双手套) 外, 还可以佩戴木炭护理面罩。^{含有 35}s 蛋氨酸和半胱氨酸的股票瓶应始终在烟罩中打开, 或在局部抽吸点下打开。已知的实验室污染点是离心机、移液器、水浴、孵化器和振荡器。通过使用带有木炭过滤器的移液器尖端、正密封微离心管 (见材料表)、水浴中的水族馆木炭海绵、粘在脉冲追逐盘中的木炭滤纸, 减少了对这些地区的污染,在抽吸系统中设置木炭防护装置, 并将含有木炭颗粒的盘子放置在孵化器和储存容器中。

研究方案

所有放射性试剂和程序都是按照乌得勒支大学的当地辐射规则和条例处理的。

1. 脉冲追逐

1. 粘附细胞的脉冲追逐
   注: 此处给出的体积基于60毫米细胞培养皿。对于35毫米或100毫米的菜肴, 将体积分别乘以半或2个。此协议使用10分钟的脉冲时间和0、15、30、60、120和240分钟的追逐时间。这些可以根据正在研究的特定蛋白质而有所不同 (下文将讨论)。
   1. 种子粘附细胞 (如hek 293, hela, cho) 在 6个60毫米细胞培养皿中, 使它们在脉冲追逐当天被亚融合 (80%-90%)。每个时间点和/或条件至少使用一道菜。
   2. 如有需要, 请根据制造商的说明, 用市售的转染试剂对细胞进行转染;或者, 在脉追逐实验前1天用适当的表达结构对⁸细胞进行病毒化传递。
   3. 用2毫升洗碗 (汉克的平衡盐溶液 [hbss]) 清洗盘子, 加入2毫升饥饿培养基 (缺乏蛋氨酸和半胱氨酸和胎儿牛血清的正常培养基 [fbs], 如没有蛋氨酸和半胱氨酸的最低必要培养基 [mL]但使用 10 mm hepes, ph 7.4), 并将菜肴放入37°c 加湿孵化器中, 采用 5% co 2 15分钟.
   4. 将盘子放在预热的37°c 水浴中, 将其转移到机架上, 使其与水接触, 但不会漂浮。启动计时器。
   5. 在40秒时, 吸气饥饿介质, 绘制600μl 脉冲溶液 (饥饿介质 + 55μci/35 mm 的盘标签, 请参阅前面的说明 1.1.1) 到移液器中, 并在精确1分钟的时间内轻轻地将其添加到菜体的中心. 每隔 1分钟, 每隔1分钟重复一次他剩下的菜。从最长的追逐样本开始, 以节省实验期间的时间。
      注: 在处理放射性物质时, 必须遵循适当的预防措施和当地的规则和条例, 以防止意外接触和污染。
   6. 在整整 11分钟, 所有以下的菜, 除了0分钟追逐样品, 添加2毫升的追逐介质直接到菜品, 吸气, 再, 添加2毫升的追逐介质。对于剩余的菜肴, 每隔1分钟重复此步骤。将所有菜肴转移到37°c 的孵化器。
   7. 在正好 16分钟, 将追逐介质 (正常培养基 + 10 mm hepes [ph 7.4]、5 mm 半胱氨酸和 5 mm 蛋氨酸) 直接添加到脉冲介质顶部的0分钟样品盘上停止标记;然后, 立即吸气, 将盘子转移到冷却的铝板上, 并加入2毫升的冷停止缓冲液 (hbss + 20 mm n-乙基马来酰亚胺 [nem])。
      注: 这是0分钟追逐样本。对于此示例, 请直接转到步骤1.1.9。
   8. 在每次追逐前2分钟将每个追逐盘转移回水浴 (例如, 15分钟追逐为 24分钟), 并在确切的追逐时间 (例如, 15分钟追逐为 26分钟), 吸气追逐介质 (或将其转移到微离心管, 如果跟随 pr分泌物), 并将盘转移到冷却的铝板上。加入2毫升的冷停止缓冲液。
   9. 在停止缓冲液中将所有盘子用冰培养≥ 5分钟;然后, 吸气停止溶液, 用2毫升的冷停止溶液清洗。用600μl 的裂解缓冲液 (磷酸盐缓冲盐水 [pbs] + 非变性洗涤剂) 吸走洗碗和洗碗 [见材料表] + 蛋白酶抑制剂 + 20 mmem nem)。使用细胞刮刀, 以确保菜肴是定量的裂解。
   10. 将裂解液转移到 1.5 ml 微离心管和离心机中 10分钟, 在 150-20, 000xg 和 4°c 的情况下将其输送到核中。
2. 用于悬挂细胞的脉冲追逐
   注: 为确保有效的标记, 细胞应脉冲在 3 x 10 6 至 5 x ^{10 6} cellsl 的浓度下, 追逐体积应为脉冲体积的4倍。在下面的示例中, 我们将 1 ml 体积中的 5 x¹⁰ 6 单元脉冲 10分钟, 以产生 5个 1 ml 的追逐时间点 (0、15、30、60和 120分钟), 每个时间点包含 1个 x^-6个单元。所有解决方案都与第1.1 节中的相同。
   1. 根据先前公布的协议⁹培养悬浮细胞 (例如3t3, jurkat), 以便在实验时有足够数量的细胞, 每个时间点和/或条件至少有 1 x^{10 6个细胞}。
   2. 如果需要, 根据制造商的说明, 用市售的转染试剂转染细胞, 或在脉冲追逐实验前1天用适当的表达结构对^8个细胞进行病毒性转染。
   3. 颗粒 5 x 10⁶细胞在50毫升管中, 每一个条件在室温下, 在 250 x g 的情况下 5分钟, 用5毫升的饥饿介质清洗 1x, 再次颗粒, 并在饥饿介质中重新悬浮它们。
   4. 将细胞转移到37°c 的水浴中, 孵育 10-25分钟, 每10-15分钟搅拌一次管, 以防止细胞在底部沉淀。
   5. 启动计时器。在精确的1分钟内, 将 275μci (55μci/1 x¹⁰ 6 细胞) 直接添加到含有细胞和旋流的试管中混合。
      注: 在处理放射性物质时, 必须遵循适当的预防措施和当地的规则和条例, 以防止意外接触和污染。
   6. 在整整 11分钟, 停止标签添加4毫升的追逐介质。将样品混合, 立即将1毫升转移到冰上的15毫升管, 其中含有9毫升的冷停止溶液。
      注: 这是0分钟追逐样本。
   7. 对每个连续的时间点重复这些步骤。一旦收集到所有时间点, 在4°c 的 250 x g 下, 将细胞颗粒5分钟。吸气的培养基 (或转移到一个新的15毫升管, 如果遵循蛋白质分泌)。用5毫升的停止溶液清洗细胞, 在4°c 的 250 x g 下将细胞颗粒状 5分钟。
   8. 吸入停止溶液, 用300μl 的冰凉裂解缓冲液完全裂解细胞, 并在冰上孵育 20分钟, 以确保完全裂解。在 150-20, 000 x 克的4°c 下, 将裂解液转移到 1.5 ml 微离心管和离心机中 10分钟, 以团核。

2. 免疫沉淀

1. 将抗体 (见讨论) 和50μl 的免疫沉淀珠 (例如, 蛋白质 a-sepharose) (裂解缓冲液中的10% 悬浮液 + 0.25% 的牛血清白蛋白 [bsa]]) 结合在微离心管中, 在4°c 时孵育它们 ~ 30分钟。
2. 在室温下, 以 12, 000 x克的温度将珠子颗粒 1分钟, 并吸走上清液。如果免疫沉淀需要 & gt;1 h, 则在4°c 的振动台中孵育1小时或头头。
3. 在室温下, 以 12, 000 x克的速度将珠子颗粒1分钟。吸入上清液, 加入1毫升的免疫沉淀洗涤缓冲液。将样品放在室温下的振动台5分钟。
4. 按照步骤2.3 中的说明将珠子颗粒, 然后重复清洗1x。然后, 吸入上清液, 并在20μl 的 te 缓冲液中重新悬浮珠子, ph 值 6.8 (10 mm Tris-HCl, 1 mm edta)。将样品旋涡。
5. 在没有还原剂的情况下加入20μl 的2x 样品缓冲液, 对其进行涡流, 在95°c 下加热 5分钟, 然后再次产生涡流。
   注: 如果只准备还原样品, 此时应添加2微米 500 mm dtt。然后, 继续执行步骤2.7。
6. 按照步骤2.3 中的说明, 将珠子颗粒状。将未还原的上清液19μl 转移到含有1μl 的 500mm dtt 的新鲜微离心管中, 对样品进行离心, 然后再将其在95°c 加热5分钟。
7. 将样品向下旋转 1分钟, 在 12, 000 x g;这是减少的样品。将其冷却至室温, 并在减少的样品和不减少的样品中添加1.1μl 的 1 mm nem。涡旋和旋转下来的样本。

3. sds-page

1. 首先, 确定适当的 sds-page 解析凝胶百分比的蛋白质感兴趣的。例如, hiv-1 gp120 在脱糖时, 以 ~ 60 kda 的速度运行, 并以7.5% 的凝胶进行分析。
2. 根据制造商的说明 (x% 丙烯酰胺、375 mm Tris-HCl [ph 8.8、0.1% sds [w/v] 和0.05% 硫酸铵 [w/v]) 制备不含 temed 的溶解凝胶混合物, 并在真空下进行脱气, 以便 gt;15。当凝胶混合物脱气时, 用70% 的乙醇和无绒毛组织彻底清洁凝胶玻璃板, 并将其放入铸造设备中。
3. 将 temed 添加到解决凝胶混合物中 (最终浓度为 0.005% [v/v]), 在玻璃板之间彻底混合, 并在移液器之间混合, 为堆叠凝胶留下 ~ 1.5 厘米的空间。小心地将凝胶与去离子 h2o 或异丙醇覆盖, 并将其留给聚合.
4. 解析凝胶聚合后, 制备堆叠凝胶混合物 (4% 丙烯酰胺、125 mm Tris-HCl [ph 6.8]、0.1% sds [w/v] 和 0.025 aps [w/v])。
5. 用去离子化的 h2o 冲洗解析凝胶的顶部, 然后取出所有的水。
   注: 使用滤纸取出最后一滴。
6. 将 temed 添加到堆叠凝胶混合物 (0.005% [v/v]) 中, 彻底混合, 用堆叠凝胶覆盖溶解凝胶, 并插入15英寸梳子。堆叠凝胶聚合后, 将其转移到运行室, 并在上下腔内填充运行缓冲液 (25 mm Tris-HCl、192 mm 甘氨酸 [ph 8.3] 和 0.1% sds [w/v])。
7. 在15车道的小冰盖下, 每条车道加载10μl 的样品。避免在凝胶上的第一条和最后一条车道上加载样品, 并在所有空车道上加载不减少样品缓冲器, 以防止带的微笑。以恒定的 25 ma/凝胶运行凝胶, 直到染料前部处于凝胶的底部。
8. 将凝胶从玻璃板上取出, 用蛋白质染色溶液染色凝胶 (h2 o 中的10% 醋酸和30% 甲醇 + 0.25% 明亮的蓝色 r250 [w/v]), 搅拌 5分钟, 然后用去污液下 30分钟 (染色)解决方案, 没有灿烂的蓝色 r250)。
9. 将凝胶面朝下排列在塑料包装上, 然后在其顶部放置 0.4 mm 色谱纸。将凝胶夹心色谱纸侧放在凝胶干燥机上。按照制造商的说明, 在80°c 下将凝胶干燥2小时。
10. 将干凝胶转移到盒式磁带上, 并用自动成像胶片或荧光粉膜覆盖。如果使用自动摄影胶片, 则必须在黑暗的房间中执行此步骤。

结果

从粘连脉追逐中折叠和分泌 hiv-1 gp120 如图 2所示。非还原凝胶 (图中的细胞 nr) 显示了 gp120 的氧化折叠。在 5分钟 (0分钟追逐) gp120 的脉冲标记后, 立即显示为凝胶中更高的漫反射带, 随着追逐的进展, 带通过更分散的折叠中间体 (it) 向下迁移凝胶, 直到它在紧的带 (nt) 中积累表示本地折叠的 gp120。这发生的原因是二硫键的形成增加了蛋白质的致密性, 使...

讨论

脉冲追逐方法对于培养科学家对完整细胞中蛋白质折叠的理解至关重要。虽然我们试图提供一种尽可能通用的方法, 但这种方法有可能几乎无限的变化来研究细胞内蛋白质折叠、运输和生命过程中发生的各种过程。

在洗碗中使用粘附细胞进行脉冲追逐时, 必须尽可能多地处理每道菜, 因为在实验中的每个时间点和/或条件都使用单独的菜品。特别是对于短脉冲和追逐时间 (& lt;5 ?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.400
Acetic Acid	Sigma	A6283	glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20x25 cm	GE Life Sciences	28956475
Bromophenol Blue	Sigma	B8026	Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films	Kodak	Z350370-50EA
Cell-culture media	Various	N/A	Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine	Various	N/A	Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper	Whatman	1872047
Charcoal filtered pipette tips	Molecular bioproducts	5069B
Charcoal vacu-guard	Whatman	67221001
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma	112,553	for electrophoresis
Cysteine	Sigma	C7352	Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001	Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix	Perkin Elmer	NEG772014MC	Other size batches of label are available depending on useage
EDTA	Sigma	E1644	Molecular biology grade
Gel-drying equipment	Various	N/A
Glycerol	Sigma	G5516	Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper	GE Life Sciences	3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	24020117
Kimwipes delicate task wipes	VWR	21905-026
MES	Sigma	M3671	Molecular biology grade
Methanol	Sigma	MX0490
Methionine	Sigma	M5308	Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment	Various	N/A
NaCl	Sigma	S7653	Molecular biology grade
N-ethylmaleimide	Sigma	E3876	Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS	Sigma	P5368	Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads	GE health-care	17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma	L3771	Molecular biology grade
Triton X-100	Sigma	T8787	Molecular biology grade
Trizma base (Tris)	Sigma	T6066	Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager	Amersham	29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath	Nalgene	5970-0320PK