Analyse de repliement des protéines, des transports et dégradation dans les cellules vivantes par radioactifs Pulse Chase

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour une méthode de chasse générale qui permet l’analyse cinétique de pliage, le transport et la dégradation des protéines qui doivent être suivies dans des cellules vivantes.

Résumé

Marquage radioactif pulse-chase est un outil puissant pour l’étude de la maturation conformationnelle, le transport vers leur localisation cellulaire fonctionnelle et la dégradation des protéines cibles dans des cellules vivantes. En utilisant les radiolabeling temps courts (impulsion) (< 30 min) et étroitement contrôlé fois chase, il est possible d’étiqueter seulement une petite fraction de la piscine de protéines totales et suivre son pliage. Lorsqu’il est combiné avec non-réducteurs/réduire l’électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) et immunoprécipitation avec des anticorps (conformation spécifique), processus de pliage peut être examiné en détail. Ce système a été utilisé pour analyser le repliement des protéines avec une énorme variation de propriétés telles que des protéines solubles, des protéines transmembranaires simples et multi-pass, fortement protéines N - et O-glycosylées et des protéines avec ou sans une vaste disulfure collage. Méthodes de chasse sont à la base des études cinétiques dans une gamme de fonctionnalités supplémentaires, notamment des co - et des modifications post-traductionnelles oligomérisation et polymérisation, essentiellement en permettant l’analyse d’une protéine de la naissance à la mort. Études de Pulse-chase sur le repliement des protéines sont complémentaires avec d’autres méthodes biochimiques et biophysiques pour l’étude des protéines in vitro en offrant une résolution temporelle accrue et des informations physiologiques. Les méthodes décrites dans cet article sont facilement adaptés pour étudier le repliement des presque toute protéine qui peut être exprimé dans les systèmes de mammifères ou des insectes-cellule.

Introduction

Le repliement des protéines de même relativement simple implique plusieurs différentes enzymes pliants, chaperons moléculaires et modifications covalentes¹. Une reconstitution complète de ces processus in vitro est pratiquement impossible, étant donné le grand nombre de différents composants impliqués. Par conséquent, il est hautement souhaitable, pour étudier le repliement in vivo, dans des cellules vivantes des protéines. Techniques de chasse radioactifs s’avérer un outil puissant pour l’étude de la synthèse, pliage, transport et la dégradation des protéines dans leur environnement naturel.

Le métabolisme d’étiquetage de protéines au cours d’une brève impulsion avec ³⁵S-labeled méthionine/cystéine, suivie d’une course-poursuite en l’absence d’un marqueur radioactif, permet un suivi spécifique d’une population de protéines nouvellement synthétisées dans le milieu cellulaire la plus large. Ensuite les protéines cibles peuvent être isolée par immunoprécipitation et analysés par SDS-PAGE ou autres techniques. Pour beaucoup de protéines, leur périple à travers la cellule est marquée par des modifications visibles sur gel SDS-PAGE. Par exemple, le transport des protéines glycosylées du réticulum endoplasmique (ER) à l’appareil de Golgi est souvent accompagné par des modifications de N-glycanes ou l’addition de O-glycanes^2,3. Ces modifications provoquent des augmentations importantes dans la masse moléculaire apparente, qui peut être vu par les changements de mobilité en SDS-PAGE. Maturation peut également être marquée par des clivages protéolytiques, tels que le clivage du peptide signal ou l’enlèvement de pro-peptides, entraînant des changements dans la masse moléculaire apparente que l'on peut suivre facilement sur de gel SDS-PAGE⁴. La radioactivité a des avantages considérables sur des techniques comparables tels que les poursuites de cycloheximide, où elle empêche la synthèse de nouvelles protéines, comme les traitements plus longs sont toxiques pour les cellules et n’excluent pas la majorité des protéines âgées, équilibre de la analyse, que certaines protéines ont des demi-vies de jours. La comparaison des protéines sous les deux non réductrice et conditions réductrices permet l’analyse de formation de la liaison disulfure, une étape importante dans le pliage de nombreuses protéines sécrétoires^{4,5,6, 7}.

Nous décrivons ici une méthode générale d’analyse de repliement des protéines et de transport dans les cellules intactes, en utilisant une approche radioactifs pulse-chase. Alors que nous avons visant à assurer l’application de la méthode détaillée que possible, le protocole a un potentiel presque illimité pour adaptabilité et permettra l’optimisation pour l’étude des protéines spécifiques de chaque lecteur.

Deux protocoles alternatifs pulse-chase, un pour les cellules adhérentes (étape 1.1 du protocole présenté ici) et l’autre pour les cellules en suspension (étape 1.2 du protocole présenté ici) sont fournis. Les conditions prévues ici suffisent visualiser une protéine exprimée avec moyen - à haut-niveau d’expression. Si le lecteur ne fonctionne pas avec les protéines mal exprimées ou diverses conditions après le traitement, comme plusieurs d’immunoprécipitation, il est nécessaire d’augmenter la taille du plat ou le nombre de cellules de façon appropriée.

Pour chase de suspension de pouls, les échantillons de chase prélevés à chaque instant sont tirées d’un seul tube de cellules. Les étapes de lavage après l’impulsion sont omises ; au lieu de cela, plus l’incorporation de ³⁵S est empêchée par dilution avec un excès élevé de non étiqueté méthionine et la cystéine.

Les protocoles présentés utilisent radioactifs ³⁵S-labeled cystéine et méthionine pour suivre le processus de repliement des protéines cellulaires. Toutes les opérations avec des réactifs radioactifs doivent être effectuées à l’aide de mesures de protection appropriées afin de minimiser toute exposition de l’opérateur et l’environnement aux rayonnements radioactifs et être effectuée dans un laboratoire désigné. Comme le pulse-chase étiquetage technique est relativement inefficace en temps de pulsation courte (< 15 min), moins de 1 % du montant de départ de la radioactivité est incorporé dans les protéines nouvellement synthétisées. Après l’enrichissement de la protéine par immunoprécipitation de la cible, l’échantillon pour SDS-PAGE contient moins de 0,05 % du montant de départ de la radioactivité.

Bien que le ³⁵S méthionine et la cystéine étiquetage mix est stabilisé, une décomposition, produisant des composés radioactifs volatils, se produira. Pour protéger le chercheur et l’appareil, certaines précautions doivent être prises. Le chercheur doit toujours obéir aux règles de sécurité de rayonnement local et peut porter un charbon masque, outre une blouse et des gants (doubles) de soins infirmiers. Flacons stocks avec ³⁵S méthionine et la cystéine devraient toujours être ouvert dans une hotte aspirante ou sous un point d’aspiration locale. Taches de contamination connue de laboratoire sont centrifugeuses, pipettes, bains-marie, incubateurs et dispositifs trembleurs. La contamination de ces zones est réduite à l’aide de pointes de pipette avec un filtre à charbon actif, positif-seal microtubes à centrifuger (voir Table des matières), éponges aquarium charbon de bois dans l’eau bains, charbon filtre papiers collés dans les plats de chasse, renfort en charbon de bois dans le système d’aspiration et le placement des plats contenant des grains de charbon de bois dans des incubateurs ou des récipients de stockage.

Protocole

Tous les réactifs radioactifs et les procédures ont été traitées conformément aux règlements et les règles locales de rayonnement de l’Université d’Utrecht.

1. pulse Chase

1. Pulse-Chase pour les cellules adhérentes
   NOTE : Les volumes donnés ici sont basées sur les boîtes de culture cellulaire 60 mm. Pour 35 mm ou 100 mm plats, multiplier les volumes de 1/2 ou 2, respectivement. Ce protocole utilise un temps d’impulsion des temps 10 min et chase de 0, 15, 30, 60, 120 et 240 min. Ceux-ci peuvent varier selon les protéines spécifiques à l’étude (voir ci-dessous).
   1. Semences de cellules adhérentes (p. ex., HEK 293, HeLa, CHO) dans six boîtes de culture cellulaire de 60 mm afin qu’ils soient subconfluent (80-90 %) le jour de la chasse de l’impulsion. Utilisez au moins un plat par point dans le temps et/ou condition.
   2. Si nécessaire, transfecter les cellules avec des réactifs disponibles dans le commerce de transfection selon les instructions du fabricant ; ou bien, virally transduce⁸ cellules 1 jour avant le pulse-chase expérimentent la construction appropriée pour l’expression.
   3. Laver la vaisselle avec 2 mL de tampon de lavage (Hank équilibré de solution saline [HBSS]), ajouter 2 mL de milieu (milieu normal de culture dépourvu de méthionine et de cystéine et de sérum de veau fœtal [BF], comme un milieu minimal essentiel [MEM] sans la méthionine et la cystéine de la famine mais avec 10 mM HEPES, pH 7,4) et placer les capsules dans une étuve à 37 ° C humidifié avec 5 % de CO₂ pendant 15 min.
   4. Placer les boîtes dans les paniers dans un bain d’eau préchauffée 37 ° C, afin qu’elles soient en contact avec l’eau mais ne pas flotter. Démarrer un minuteur.
   5. À 40 s, aspirer le milieu de la famine, aspirer 600 µL de solution d’impulsion (médias de famine + 55 µCi/35 mm plat label, voir la note qui précède l’étape 1.1.1) dans la pipette et ajoutez-la délicatement au centre du plat à exactement 1 min. répéter cette étape à intervalles de 1 min pour t plats reste he. Commencez avec l’échantillon de chasse plus longue pour gagner du temps lors de votre expérience.
      Remarque : Lors de la manipulation de matières radioactives, il est essentiel de suivre les précautions d’usage et règlements pour éviter toute exposition accidentelle et/ou de contamination locale.
   6. À 11 min exactement et pour tous les plats suivants, à l’exception de l’échantillon de chase 0 min, ajouter 2 mL de milieu de chasse directement sur le plat, il aspirer et encore une fois, ajouter 2 mL de milieu de chase. Répétez cette opération à des intervalles de 1 min pour les autres plats. Placer toutes les boîtes dans un incubateur à 37 ° C.
   7. À exactement 16 minutes, ajouter 2 mL de milieu de chase (milieu de culture normal + 10 mM HEPES [pH 7,4], 5 mM cystéine et méthionine de 5 mM) directement dans le plat d’échantillon de 0 min sur le milieu de l’impulsion pour arrêter l’étiquetage ; Ensuite, aspirez immédiatement, placer la capsule à une plaque d’aluminium refroidi et ajouter 2 mL de tampon d’arrêt glacee (HBSS + 20 mM N- éthylmaléimide [NEM]).
      NOTE : Ceci est l’échantillon de chase 0 min. Pour cet exemple, passez directement à l’étape 1.1.9.
   8. Transférer chaque plat de chasse à l’eau du bain 2 min avant chaque fois que chase (p. ex., 24 min pour une poursuite de 15 min) et, au moment exact chase (p. ex., 26 min pour une poursuite de 15 min), aspirer les médias chase (ou les transférer dans un tube de microcentrifuge si pr la suite la sécrétion d’otein) et placer la capsule à une plaque d’aluminium refroidi. Ajouter 2 mL de tampon d’arrêt glacée.
   9. Incuber tous les plats sur la glace dans le tampon de butée pour ≥ 5 min ; Ensuite, aspirer la solution de l’arrêt et le laver avec 2 mL de solution d’arrêt glacée. Aspirer le lavage et la lyse des plats avec 600 µL de tampon de lyse (solution saline tamponnée au phosphate [PBS] + détergent non dénaturant [voir la Table des matières] + inhibiteurs de la protéase + 20 mM NEM). Utilisez un grattoir de cellules pour s’assurer que les plats sont lysées quantitativement.
   10. Transférer le lysat dans un tube de microtubes de 1,5 mL et centrifuger pendant 10 min à 15 000-20 000 x g et 4 ° C pour granuler les noyaux.
2. Pulse-Chase pour cellules en Suspension
   NOTE : Afin d’assurer un étiquetage efficace, les cellules doivent être pulsés à une concentration de 3 x 10⁶ à 5 x 10⁶ cellules/mL, et chase volumes devraient être 4 x le volume de l’impulsion. Dans l’exemple suivant, nous avons pulsé 5 x 10⁶ cellules dans un volume de 1 mL pour 10 min, à céder cinq courir après le temps des points (0, 15, 30, 60 et 120 min) de 1 mL, contenant 1 x 10⁶ cellules par point dans le temps. Toutes les solutions sont les mêmes qu’à l’article 1.1.
   1. Culture les cellules en suspension (p. ex., 3 t 3, Jurkat) selon un protocole déjà publiées⁹ afin qu’il y a un nombre suffisant de cellules au moment de l’expérience, au moins 1 x 10⁶ cellules / temps point et/ou conditionnent.
   2. Si nécessaire, transfecter de cellules avec des réactifs disponibles dans le commerce de transfection selon les instructions du fabricant, ou transduce virally⁸ cellules 1 jour avant le pulse-chase expérimentent la construction appropriée pour l’expression.
   3. 5 x 10⁶ cellules / condition dans un tube de 50 mL pour 5 min à 250 g à la température ambiante de granule, lavez-les 1 x 5 ml des médias de la famine, pellets eux encore une fois et les remettre en suspension dans 1 mL de médias de famine.
   4. Transférer les cellules dans un bain-marie à 37 ° C et les incuber pendant 10-25 min. agiter les tubes chaque 10-15 min pour empêcher les cellules de se déposer au fond.
   5. Démarrer la minuterie. À exactement 1 min, ajouter 275 µCi (55 µCi/1 x 10⁶ cellules) du label non dilué directement dans le tube contenant des cellules et agiter pour mélanger.
      Remarque : Lors de la manipulation de matières radioactives, il est essentiel de suivre les précautions d’usage et règlements pour éviter toute exposition accidentelle et/ou de contamination locale.
   6. À 11 min exactement, arrêter l’étiquetage par l’ajout de 4 mL de médias de chase. Mélanger l’échantillon et immédiatement transférer 1 mL dans un tube de 15 mL sur la glace, contenant 9 mL de solution d’arrêt glacée.
      NOTE : Ceci est l’échantillon de chase 0 min.
   7. Répétez ces étapes pour chaque point de temps successifs. Une fois que tous les points dans le temps sont collectés, granules des cellules pendant 5 min à 250 x g à 4 ° C. Aspirer le médium (ou transférer dans un nouveau tube de 15 mL si après la sécrétion de protéines). Laver les cellules avec 5 mL de solution d’arrêt et les granules des cellules pendant 5 min à 250 x g à 4 ° C.
   8. Aspirer la solution de l’arrêt, totalement lyser les cellules avec 300 µL de tampon de lyse glacée et les incuber pendant 20 min sur la glace pour s’assurer une lyse complète. Transférer le lysat dans un tube de microtubes de 1,5 mL et la centrifugation pendant 10 min à 15 000-20 000 x g à 4 ° C pour granuler les noyaux.

2. immunoprécipitation

1. Combiner des anticorps (voir la discussion) et 50 µL de perles immunoprécipitation (par exemple, la protéine A-sépharose) (suspension à 10 % [v/v] dans le tampon de lyse + 0,25 % d’albumine sérique bovine [BSA]) dans une micro-centrifugeuse tube et les incuber à 4 ° C pendant environ 30 min dans un shaker.
2. Les perles pendant 1 min à 12 000 x g à la température ambiante de granule et aspirer le surnageant. Ajouter 200 µL de lysat dans le mélange d’anticorps-perle et incuber à 4 ° C dans un agitateur pendant 1 h ou plus-chef-chef si l’immunoprécipitation nécessite > 1 h.
3. Pellet les perles pendant 1 min à 12 000 x g à la température ambiante. Aspirer le surnageant et ajouter 1 mL de tampon de lavage d’immunoprécipitation. Placer l’échantillon dans un shaker à température ambiante pendant 5 min.
4. Les perles de granule comme indiqué au point 2.3 et répéter le lavage 1 x. Ensuite, aspirer le surnageant et remettre en suspension les perles dans 20 µL de tampon de TE, pH 6,8 (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM). Vortex de l’échantillon.
5. Ajouter 20 µL de 2 x tampon échantillon sans l’agent réducteur, vortex, chauffez-la à nouveau pendant 5 min à 95 ° C et vortex.
   Remarque : si une seule préparation d’échantillons réductrices, 2 µL de 500 mM TNT doivent être ajoutés à ce stade. Ensuite, passez à l’étape 2.7.
6. Les perles de granule comme indiqué au point 2.3. Transférer 19 µL du liquide surnageant étudiée dans un tube de microcentrifuge frais contenant 1 µL de 500 mM DTT, centrifuger l’échantillon et vortex avant il chauffer pendant 5 min à 95 ° C.
7. Tournez en bas de l’échantillon pendant 1 min à 12 000 x g; Il s’agit de l’échantillon réduit. Refroidir à température ambiante et ajouter µL 1,1 mètre NEM à la fois la réduction et l’échantillon non. Vortex et la centrifuger les échantillons.

3. SDS-PAGE

1. Tout d’abord, déterminer le SDS-PAGE resolving gel pourcentage approprié pour la protéine d’intérêt. Par exemple, les gp120 du VIH-1, quand déglycosylée, tourne à ~ 60 kDa et est analysé dans un gel de 7,5 %.
2. Préparer un mélange de gel de résoudre sans TEMED selon les instructions du fabricant (x % d’acrylamide, 375 mM Tris-HCl [pH 8,8,] SDS 0,1 % [p/v] et le persulfate d’ammonium 0,05 % [APS] [w/v]) et dégazer sous vide pour > 15 min. Alors que le mélange de gel est dégazage, nettoyez les plaques de verre de gel avec l’éthanol à 70 % et tissus pelucheux et placez-les dans un appareil de coulage.
3. Ajouter TEMED au mélange gel résolution (à une concentration finale de 0,005 % [v/v]), bien mélanger et pipette entre les plaques de verre, laissant ~1.5 cm d’espace pour le gel de concentration. Soigneusement le gel avec désionisée H₂O ou isopropanol de superposition et laisser polymériser.
4. Une fois le gel résolution a polymérisé, préparer le mélange de gel d’empilement (4 % d’acrylamide, 125 mM Tris-HCl [pH 6,8], SDS 0,1 % [p/v] et 0,025 % APS [w/v]).
5. Vider la partie supérieure du gel résolution avec désionisée H₂O et, ensuite, enlever toute l’eau.
   Remarque : Utilisez du papier filtre pour éliminer les dernières gouttes.
6. Ajouter TEMED au gerbage mélange gel (0,005 % [v/v]), mélanger soigneusement et superposer le gel résolution avec gel de concentration et insérer un peigne 15 puits. Une fois que le gel de concentration a polymérisé, transférer dans une chambre en cours d’exécution et remplissez les compartiments supérieurs et inférieurs avec tampon (25 mM Tris-HCl, glycine 192 mM [pH 8,3] et 0,1 % SDS [w/v]).
7. Charger de 10 µL de l’échantillon par voie dans un minigel 15 voies. Éviter de charger les échantillons dans la première et la dernière voie sur le gel et charger le tampon échantillon non réductrices dans toutes les voies vides afin d’empêcher le sourire des bandes. Exécuter les gels à température constante un mA/gel 25 jusqu'à ce que l’avant de la teinture se trouve au bas du gel.
8. Enlevez les gels les plaques de verre, détachant les gels avec solution de coloration protéine (acide acétique à 10 % et 30 % de méthanol en H₂O + 0,25 % brillant bleu R250 [w/v]) pendant 5 min en agitant et ensuite, décolorer pendant 30 min avec solution (taches de décoloration solution sans R250 bleu brillant).
9. Organiser les gels face vers le bas sur un plastique enveloppent et, ensuite, placent le papier pour chromatographie 0,4 mm au-dessus d’eux. Placer le gel "sandwich" chromatographie sur papier-côté vers le bas sur un gel sèche. Suivant les instructions du fabricant, sécher les gels pendant 2 h à 80 ° C.
10. Transférer les gels séchées dans une cassette et tu les couvriras d’écran de film ou de phosphore autoradiographie. Si l’utilisation du film autoradiographie, cette étape doit être exécutée dans une pièce sombre.

Résultats

Le repliement et la sécrétion de la gp120 du VIH-1 d’un chase impulsion adhérentes est illustré à la Figure 2. Le gel non réductrice (NR de cellules dans la figure) montre le repliement oxydatif de gp120. Immédiatement après la pulsion d’étiquetage de gp120 5 min (0 min chase) apparaît comme une bande diffuse plus élevée dans le gel, et à mesure que progresse la chase, la bande migre vers le bas le gel grâce à encore plus diffus pliage inte...

Discussion

Les méthodes Pulse-chase ont été essentiels pour développer la compréhension des scientifiques de protéine pliage dans les cellules intactes. Alors que nous avons tenté de fournir une méthode qui est aussi générale que possible, cette approche a le potentiel pour des variations presque infinies étudier les divers processus qui se produisent pendant le pliage, le transport et la vie des protéines à l’intérieur de la cellule.

Lors d’une poursuite de l’impulsion à l’aide de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.400
Acetic Acid	Sigma	A6283	glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20x25 cm	GE Life Sciences	28956475
Bromophenol Blue	Sigma	B8026	Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films	Kodak	Z350370-50EA
Cell-culture media	Various	N/A	Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine	Various	N/A	Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper	Whatman	1872047
Charcoal filtered pipette tips	Molecular bioproducts	5069B
Charcoal vacu-guard	Whatman	67221001
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma	112,553	for electrophoresis
Cysteine	Sigma	C7352	Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001	Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix	Perkin Elmer	NEG772014MC	Other size batches of label are available depending on useage
EDTA	Sigma	E1644	Molecular biology grade
Gel-drying equipment	Various	N/A
Glycerol	Sigma	G5516	Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper	GE Life Sciences	3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	24020117
Kimwipes delicate task wipes	VWR	21905-026
MES	Sigma	M3671	Molecular biology grade
Methanol	Sigma	MX0490
Methionine	Sigma	M5308	Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment	Various	N/A
NaCl	Sigma	S7653	Molecular biology grade
N-ethylmaleimide	Sigma	E3876	Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS	Sigma	P5368	Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads	GE health-care	17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma	L3771	Molecular biology grade
Triton X-100	Sigma	T8787	Molecular biology grade
Trizma base (Tris)	Sigma	T6066	Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager	Amersham	29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath	Nalgene	5970-0320PK