Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Резюме

Здесь мы описываем протокол для общего импульса Чейз метод, который позволяет кинетический анализ складывания, транспорта и деградации белков в живых клеток.

Аннотация

Маркировки радиоактивных пульс Чейз является мощным инструментом для изучения конформационного созревания, транспорт до их функциональной сотовой местоположения и деградации белков-мишеней в живых клетках. С помощью коротких (пульс) radiolabeling раз (< 30 мин) и контролировались Чейз раз, можно пометить только небольшая часть общего белка бассейн и следовать его складывание. В сочетании с nonreducing/уменьшение электрофореза геля SDS-полиакриламид (SDS-PAGE) и иммунопреципитации с (конформация) антитела, складывающиеся процессы могут рассматриваться подробно. Эта система использовалась для анализа складывания белков с огромные различия в свойствах растворимые белки, единого и многоходовой трансмембранные белки, сильно N и O гликозилированного белки, и белков с и без обширных дисульфида склеивание. Пульс Чейз методы являются основой кинетических исследований в целый ряд дополнительных функций, включая co - Посттрансляционная модификации, олигомеризация и полимеризации, по существу позволяет анализ белка от рождения до смерти. Пульс Чейз исследования на сворачивание белков дополняют другие биохимические и биофизические методы для изучения белков в пробирке , обеспечивая увеличение временного разрешения и физиологической информации. Методы, как описано в этом документе приспособлены легко учиться, складывающиеся почти любой белок, который может быть выражен в системах млекопитающих и насекомых клеток.

Введение

Складные даже сравнительно простые белки включает в себя множество различных складной ферменты, молекулярные сопровождающих и ковалентный модификации¹. Полное восстановление этих процессов в vitro практически невозможно, учитывая огромное количество различных компонентов. Весьма желательно, таким образом, для изучения белков складывания в естественных условиях, в живых клетках. Радиоактивных пульс Чейз методики доказывают мощный инструмент для изучения синтеза, свертка, транспорта и деградации белков в их естественной среде.

Метаболические маркировки белков во время короткого импульса с ³⁵S-меченых метионина/цистеина, затем Чейз в отсутствие радиоактивных метку, позволяет отслеживания населения вновь синтезируемых белков в широкой клеточного окружения. Затем целевых белков может быть изолированным через иммунопреципитации и проанализированы через SDS-PAGE или других методов. Для многих белков их путешествие через ячейку характеризуется изменениями, которые видны на геля SDS-PAGE. Например перевозки гликозилированного белков от эндоплазменный ретикулум (ER) в комплекс Гольджи часто сопровождается изменения N-связаны гликанов или добавлением гликаны, связанный с O^2,3. Эти изменения вызывают значительное увеличение в очевидной молекулярной массы, которую можно увидеть изменения подвижности в SDS-PAGE. Созревания также может быть отмечен протеолитического расщепления, например сигнал пептид спайности или удаления pro пептиды, что привело к изменениям в очевидной молекулярной массы, которая может легко следовать на гель SDS-PAGE⁴. Радиоактивность имеет значительные преимущества перед сопоставимых методов, таких как циклогексимида погони, где предотвратить синтез новых белков, как длительного лечения токсичны для клеток и не исключает большинство старых, устойчивого состояния белков из анализ, как некоторые белки имеют периоды полураспада дней. Сравнение белков под оба nonreducing и уменьшение условий позволяет анализ формирования дисульфидными облигаций, важный шаг в сложенном многих выделительные протеины^{4,5,6, 7}.

Здесь мы описываем общий метод для анализа сворачивание белков и транспорта в нетронутым клеток, используя подход радиоактивных пульс Чейз. Хотя мы стремились представить этот метод как как можно более подробно протокол имеет почти безграничным потенциалом для адаптации и позволит оптимизации для изучения специфических белков каждого читателя.

Предоставляются две альтернативные пульс Чейз протоколов, один для адэрентных клеток (шаг 1.1 протокола, представленные здесь) и один для подвески клеток (шаг 1.2 протокола, представленные здесь). Условия здесь являются достаточными для визуализации белок с средне высокий выражение уровня. Если читатель работает с слабо выраженной белки или различных рентгенологическое условий, таких как несколько immunoprecipitations, необходимо увеличить размер блюдо или мобильный телефон надлежащим образом.

Для подвески пульс Чейз Чейз проб, взятых в каждый момент времени все взяты из одной трубки клеток. Мыть шаги после импульса опущены; Вместо этого дальнейшее включение ³⁵S предотвращается путем разбавления с высоким избыток немеченого метионина и цистеина.

Представлены протоколы используют радиоактивные ³⁵S-меченых цистеина и метионина следовать клеточных процессов, сворачивание белков. Используя соответствующие защитные меры для сведения к минимуму любого воздействия оператора и окружающей среды, радиоактивного излучения и выполняться в назначенной лаборатории следует выполнять все операции с радиоактивными реагентов. Как пульс Чейз маркировки техника относительно неэффективными порой короткого импульса (< 15 мин), меньше, чем 1% от начальной суммы радиоактивности включена в вновь синтезируемых белков. После обогащения целевого белка через иммунопреципитация образец для SDS-PAGE содержит меньше чем 0,05% от суммы начального радиоактивности.

Хотя ³⁵S метионина и цистеина, маркировки смеси стабилизируется, некоторые разложения, уступая летучих радиоактивных соединений, будет происходить. Чтобы защитить исследователь и аппарата, следует принять некоторые меры предосторожности. Исследователь всегда должен подчиняться правилам безопасности местных излучения и может носить уголь кормящих маски, кроме лаборатории пальто и перчатки (двойной). Складе флаконов с ³⁵S метионина и цистеина всегда должен быть открыт в вытяжной шкаф или под местной стремление точки. Пятна загрязнения известных лабораторных центрифуг, пипетки, водяные бани, инкубаторы и шейкеры. С помощью пипетки советы с угольный фильтр, положительный печать microcentrifuge трубки (см. Таблицу материалы), аквариум угольные губки в воды ванны, угольный фильтр документах склеены в пульс Чейз блюда, уменьшается загрязнение этих областей Древесный уголь гвардия в системы аспирации и размещение блюда, содержащие уголь зерна в инкубаторы и хранения контейнеров.

протокол

Все радиоактивные реагентов и процедуры были обработаны в соответствии с местными Утрехтского университета излучения правил и положений.

1. Пульс Чейз

1. Чейз импульса для адэрентных клеток
   Примечание: Приведенные объемы основаны на 60 мм ячейку культуры блюда. Для 35 мм или 100 мм блюда умножьте томов на 1/2 или 2, соответственно. Этот протокол использует время импульса 10 мин и Чейз времен 0, 15, 30, 60, 120 и 240 мин. Они могут варьироваться в зависимости от специфических белков, изучается (обсуждается ниже).
   1. Семя адэрентных клеток (например, ГЭС 293, HeLa, Чо) в шести блюд культуры клеток 60 мм, так что они будут subconfluent (80% - 90%), в день пульс Чейз. Используйте по крайней мере одно блюдо в момент времени и/или состояния.
   2. При необходимости, transfect клетки с коммерчески доступных трансфекции реагентов в соответствии с инструкциями производителя; или, как вирус передают⁸ клетки 1 день до пульс Чейз экспериментировать с соответствующей конструкции для выражения.
   3. Мыть посуду с 2 мл буфера мытья (Хэнк сбалансированного солевого раствора [HBSS]), добавить 2 мл среды голода (нормальной культуры среднего хватает метионина и цистеина и плода бычьим сывороточным [FBS], таких как минимум основных средних [мкм] без метионина и цистеина но с 10 мм HEPES, рН 7,4) и блюда в увлажненные инкубатора 37 ° C с 5% CO₂ за 15 мин.
   4. Блюда можно передать стойки в ванну воду подогретую 37 ° C тем, что они находятся в контакте с водой, но не плавают. Запустите таймер.
   5. В 40 s, аспирационная среднего голода, составить 600 мкл раствора импульса (голодания СМИ + 55 мм Μки/35 блюдо этикетка, см. Примечание предшествующих шаг 1.1.1) в пипетку и добавить его нежно центр блюдо на точно 1 мин повторить этот шаг с интервалом 1 мин t Он оставшиеся блюда. Начните с длинной Чейз образец, чтобы сэкономить время во время эксперимента.
      Примечание: При обработке радиоактивных материалов, крайне важно соблюдать надлежащие меры предосторожности и местные правила и правила для предотвращения случайного воздействия и/или загрязнения.
   6. В Ровно 11 мин для всех следующих блюд, за исключением 0 мин Чейз образца, добавить 2 мл Чейз среды непосредственно в блюдо, аспирационная его и снова, добавить 2 мл Чейз среды. Повторите этот шаг с интервалом 1 мин оставшиеся блюда. Передать все блюда инкубатора 37 ° C.
   7. В ровно 16 мин, добавить 2 мл среды Чейз (нормальной культуры среднего + 10 мм HEPES [рН 7,4], хвоща 5 мм и 5 мм метионина) непосредственно на 0 мин образец блюдо на вершине импульса среднего остановить маркировки; Аспирационная немедленно, передавать блюдо охлаждением алюминиевой пластине затем добавить 2 мл ледяной стоп буфера (HBSS + 20 мм N- ethylmaleimide [NEM]).
      Примечание: Это образец Чейз 0 мин. Для этого образца перейти непосредственно к шагу 1.1.9.
   8. Перевести каждое блюдо Чейз обратно на водяной бане 2 мин перед каждой Чейз время (например, 24 мин для Чейз 15 мин) и, в то время точное Чейз (например, 26 мин для 15 мин Чейз), аспирационная Чейз СМИ (или перенести его на пробки microcentrifuge, если после pr otein секреции) и передать охлаждением алюминиевой пластине блюдо. Добавьте 2 мл ледяной стоп буфера.
   9. Инкубируйте все блюда на льду в буфере стоп для ≥5 мин; затем аспирационная универсальное решение и мыть его с 2 мл раствора ледяной стоп. Аспирационная мыть и лизируют блюда с 600 мкл буфера lysis (фосфат амортизированное saline [PBS] + nondenaturing моющее средство [см. Таблицу материалы] ингибиторы протеазы + 20 мм NEM). Используйте скребок ячейки, чтобы количественно лизированы блюда.
   10. Передать lysate пробки microcentrifuge 1,5 мл и центрифуги для 10 мин на 15000-20000 x g и 4 ° C до Пелле ядер.
2. Чейз импульса для подвески клетки
   Примечание: Для обеспечения эффективности маркировки, клетки должны пульсирующий в концентрации 3 х 10⁶ -5 х 10⁶ клеток/мл, и Чейз тома должен быть 4 x объем импульса. В следующем примере мы пульсирующий 5 х 10⁶ клеток в объеме 1 мл в течение 10 мин, чтобы принести пять погони время точки (0, 15, 30, 60 и 120 мин) 1 мл, содержащие 1 х 10⁶ клеток на момент времени. Все решения являются так же, как и в разделе 1.1.
   1. Культура подвеска клетки (например, 3T3, Jurkat), согласно опубликованному ранее протокол⁹ , так что есть достаточное количество клеток во время эксперимента, по крайней мере 1 x 10⁶ клеток / время точки или условие.
   2. При необходимости, transfect клетки с коммерчески доступных трансфекции реагентов в соответствии с инструкциями производителя, или вирусно передают⁸ клетки 1 день до пульс Чейз экспериментировать с соответствующей конструкции для выражения.
   3. Пелле 5 х 10⁶ клеток / условие в 50 мл трубки 5 мин на 250 x g при комнатной температуре, мыть их 1 x с 5 мл голода СМИ, Пелле их снова и Ресуспензируйте их в 1 мл голода средств массовой информации.
   4. Передача клетки в ванну воды 37 ° C и инкубировать их на 10-25 мин агитировать трубы каждые 10-15 мин, чтобы не допустить урегулирования в нижней части клетки.
   5. Запустите таймер. На точно 1 мин добавить 275 Μки (55 Μки/1 x 10⁶ клеток) неразбавленной лейбла непосредственно в пробирку, содержащую клетки и взболтать.
      Примечание: При обработке радиоактивных материалов, крайне важно соблюдать надлежащие меры предосторожности и местные правила и правила для предотвращения случайного воздействия и/или загрязнения.
   6. В Ровно 11 мин прекратить маркировки путем добавления 4 мл Чейз средств массовой информации. Смешать образца и немедленно передать 1 мл 15 мл на льду, содержащий 9 мл раствора ледяной стоп.
      Примечание: Это образец Чейз 0 мин.
   7. Повторите эти шаги для каждой точки раз подряд. После того, как собраны все моменты времени, Пелле клетки для 5 мин на 250 x g при 4 ° C. Аспирационная среднего (или передать его на новой трубки 15 мл, если после секрецию белка). Вымыть клетки с 5 мл раствора стоп и Пелле клетки для 5 мин на 250 x g при 4 ° C.
   8. Аспирационная универсальное решение, полностью Лизируйте клетки с 300 мкл буфера lysis ледяной и проинкубируйте 20 мин на льду обеспечить полный лизис. Передать lysate пробки microcentrifuge 1,5 мл и центрифуги для 10 мин на 15000-20000 x g при 4 ° C до Пелле ядер.

2. иммунопреципитации

1. Объединить антитела (см. обсуждение) и 50 мкл иммунопреципитации бусины (например, белок А-Sepharose) (подвеска [v/v] 10% в буфера lysis + 0,25% альбумина bovine сыворотки [BSA]) в microcentrifuge трубки и инкубировать их в 4 ° C ~ 30 мин в шейкере.
2. Пелле бусы за 1 мин на 12000 x g при комнатной температуре и удалить супернатант. Добавить 200 мкл lysate смесь антител шарик и Инкубируйте на 4 ° C в шейкере за 1 ч или головка над если иммунопреципитации требует > 1 час.
3. Пелле бусы за 1 мин на 12000 x g при комнатной температуре. Аспирационная супернатант и добавьте 1 mL мыть буфера иммунопреципитации. Поместите образец в шейкере при комнатной температуре в течение 5 мин.
4. Пелле бисер, как описано в шаге 2.3 и повторите мыть 1 x. Затем аспирационная супернатант и Ресуспензируйте бисер в 20 мкл буфера TE, pH 6.8 (10 мм трис-HCl, ЭДТА 1 мм). Вихрь образца.
5. 20 мкл 2 x буфер образца без восстанавливающего агента, вихревые, тепло его за 5 мин при 95 ° C и вихрь снова.
   Примечание: если только Подготовка сокращение образцов, 2 мкл 500 мм DTT следует добавить в этот момент. Затем перейдите к шагу 2.7.
6. Пелле бисер, как описано в шаге 2.3. Перенесите 19 мкл nonreduced супернатант свежие microcentrifuge трубка, содержащая 1 мкл 500 мм DTT, центрифуга образца и вихрь его перед нагревом для 5 мин при 95 ° C снова.
7. Спин вниз образца за 1 мин на 12000 x g; Это сокращение образца. Остудить до комнатной температуры и 1.1 мкл 1 М NEM как уменьшение, так и nonreduced образца. Вортекс и спин вниз образцы.

3. SDS-PAGE

1. Во-первых определите соответствующие SDS-PAGE разрешая гель процент для протеина интереса. Например, gp120 ВИЧ-1, когда deglycosylated, работает на ~ 60 кДа и анализируется в 7,5% гель.
2. Подготовьте разрешая гель смесь без TEMED согласно инструкциям производителя (x % акриламида, 375 мм трис-HCl [рН 8,8,] 0,1% SDS [w/v] и 0,05% Аммония пероксодисульфат [APS] [w/v]) и Дега под вакуумом для > 15 мин. В то время как смесь гель дегазации, тщательно очистите стеклянные пластины гелем с 70% этанола и безворсовой ткани и поместите их в аппарат литья.
3. Добавьте TEMED разрешая гель смесь (в конечной концентрации 0,005% [v/v]), тщательно перемешать и Пипетка между пластинами стекла, оставляя ~1.5 см пространства для штабелируя гель. Тщательно overlay гель с дейонизированной H₂O или изопропанолом и оставьте его для полимеризации.
4. Как только разрешая Гель полимеризуется, подготовить укладки смеси гель (4% акриламида, 125 мм трис-HCl [pH 6.8], 0.1% SDS [w/v] и 0,025% APS [w/v]).
5. Промойте в верхней части разрешая гель с дейонизированной H₂O и затем удалите все воды.
   Примечание: Используйте фильтр бумага для удаления последние капли.
6. Добавьте TEMED укладки смеси гель (0,005% [v/v]), перемешать и наложение разрешая гель с штабелируя гель и вставить гребень 15-хорошо. После штабелируя гель полимеризуется, передача его в работающей камере и заполнить верхней и нижней палат с запуском буфера (25 мм трис-HCl, 192 мм глицин [рН 8.3] и 0,1% SDS [w/v]).
7. Загрузите 10 мкл образца за Лейн в пробирках 15-Лейн. Избежание загрузки образцов в первый и последний Лейн на геле и загрузить nonreducing буфер образца в все пустые полосы для предотвращения улыбаясь полос. Запустите гели при постоянном 25 мА/гель, до тех пор, пока краска фронт находится в нижней части геля.
8. Удаление гели из стеклянных пластин, пятно гели с белком окрашивание раствора (уксусной кислоты 10% и 30% метанола в H₂O + 0,25% блестящий синий R250 [w/v]) за 5 мин с перемешиванием и затем, Отмойте 30 мин с минигелей решение (окрашивание решение без блестящий синий R250).
9. Организовать гели лицом вниз на пластиковые wrap и, затем, место бумажной хроматографии 0,4 мм поверх них. Поместите гель сэндвич хроматографии бумаги стороной вниз на гель фен. Следуя инструкциям изготовителя сухие гели втечение 2 ч при температуре 80 ° C.
10. Передать кассету сушеные гели и обложи их с авторадиографии фильм или люминофора экрана. Если с помощью авторадиографии фильм, этот шаг должен выполняться в темной комнате.

Результаты

Складные и секрецию gp120 ВИЧ-1 от Чейз адэрентных пульс показан на рисунке 2. Nonreducing гель (клетки NR на рисунке) показывает окислительного складывания gp120. Сразу же после импульса маркировки gp120 5 мин (0 мин Чейз) появляется как диффузные группа выше в гель, и п?...

Обсуждение

Пульс Чейз методы имели важнейшее значение для понимания ученых белка, складывающиеся в нетронутым клеток. В то время как мы пытались обеспечить метод, который как можно больше общих, этот подход имеет потенциал для почти безграничные варианты для изучения различных процессов, которые...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.400
Acetic Acid	Sigma	A6283	glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20x25 cm	GE Life Sciences	28956475
Bromophenol Blue	Sigma	B8026	Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films	Kodak	Z350370-50EA
Cell-culture media	Various	N/A	Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine	Various	N/A	Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper	Whatman	1872047
Charcoal filtered pipette tips	Molecular bioproducts	5069B
Charcoal vacu-guard	Whatman	67221001
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma	112,553	for electrophoresis
Cysteine	Sigma	C7352	Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001	Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix	Perkin Elmer	NEG772014MC	Other size batches of label are available depending on useage
EDTA	Sigma	E1644	Molecular biology grade
Gel-drying equipment	Various	N/A
Glycerol	Sigma	G5516	Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper	GE Life Sciences	3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	24020117
Kimwipes delicate task wipes	VWR	21905-026
MES	Sigma	M3671	Molecular biology grade
Methanol	Sigma	MX0490
Methionine	Sigma	M5308	Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment	Various	N/A
NaCl	Sigma	S7653	Molecular biology grade
N-ethylmaleimide	Sigma	E3876	Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS	Sigma	P5368	Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads	GE health-care	17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma	L3771	Molecular biology grade
Triton X-100	Sigma	T8787	Molecular biology grade
Trizma base (Tris)	Sigma	T6066	Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager	Amersham	29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath	Nalgene	5970-0320PK