Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine allgemeine Puls-Jagd-Methode, die die kinetische Analyse der Faltung, Transport und Abbau von Proteinen in lebenden Zellen einzuhaltenden erlaubt.

Zusammenfassung

Kennzeichnung von radioaktiven Puls-Jagd ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Konformationsänderungen Reifung, den Transport zu ihrer zellulären Platzes und der Verschlechterung der Zielproteine in lebenden Zellen. Mit kurzen (Puls) enzymatische Zeiten (< 30 min) und streng kontrolliert Chase Zeiten, es ist möglich, beschriften Sie nur einen Bruchteil des gesamten Protein Pools und folgen seinen Falten. In Kombination mit nonreducing/Reduzierung der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Immunopräzipitation mit (Konformation) Antikörper kann Falten Prozesse im Detail untersucht werden. Dieses System wurde verwendet, um die Faltung von Proteinen mit eine große Variation in Eigenschaften wie lösliche Proteine, Einzel- und Multi-Pass transmembranen Proteine, stark N und O-glycosylierten Proteine und Proteine mit und ohne umfangreiche Disulfid analysieren die Verklebung. Puls-Jagd-Methoden sind die Basis für kinetische Untersuchungen in eine Reihe von zusätzlichen Funktionen, einschließlich Co- und posttranslationale Modifikationen, Oligomerisierung und Polymerisation, im wesentlichen erlaubt die Analyse eines Proteins von der Geburt bis zum Tod. Puls-Chase-Studien zur Proteinfaltung ergänzen sich mit anderen biochemischen und biophysikalischen Methoden für ein Studium Proteine in Vitro durch höhere zeitliche Auflösung und physiologische Informationen. Die Methoden, wie in diesem Dokument beschrieben sind leicht angepasst, zur Untersuchung der Faltung von fast jedem Protein, das in Säugetieren oder Insekt-Zelle Systeme ausgedrückt werden kann.

Einleitung

Die Faltung auch relativ einfache Proteine umfasst viele verschiedene klappbaren Enzyme, molekulare Chaperone und kovalente Modifikationen¹. Eine vollständige Wiederherstellung der diese Prozesse in Vitro ist praktisch unmöglich, angesichts die Vielzahl von verschiedenen Komponenten beteiligt. Es ist daher höchst wünschenswert, Proteinfaltung in Vivo, in lebenden Zellen zu studieren. Radioaktiven Puls-Jagd Techniken beweisen ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Synthese, Falten, Transport und Abbau von Proteinen in ihrer natürlichen Umgebung.

Die metabolische Kennzeichnung von Proteinen während eines kurzen Impuls mit ³⁵S-Label Methionin/Cystein, gefolgt von einer Verfolgungsjagd in Ermangelung eines radioaktiven Labels, können spezielle Tracking einer Bevölkerung der neu synthetisierten Proteine im weiteren zellulären Milieu. Dann können Zielproteine isoliert über Immunopräzipitation und analysiert per SDS-PAGE oder andere Techniken. Für viele Proteine zeichnet sich ihre Reise durch die Zelle durch Änderungen, die auf SDS-PAGE Gel sichtbar sind. Beispielsweise wird der Transport des glykosylierten Proteinen aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) an der Golgi-Komplex oft durch Modifikationen von Glykoproteinen N verbunden oder die Zugabe von O-linked Glykane^2,3begleitet. Diese Änderungen verursachen hohe Zuwächse in die scheinbare molekulare Masse, die durch Mobilität Veränderungen im SDS-PAGE zu sehen ist. Reifung kann auch gekennzeichnet werden, durch proteolytische Spaltungen, wie Signal-Peptid Spaltung oder die Entfernung von Pro-Peptide, was zu Veränderungen in der scheinbaren molekulare Masse, die SDS-PAGE Gel⁴leicht verfolgt werden können. Radioaktivität hat erhebliche Vorteile gegenüber vergleichbaren Techniken wie Cycloheximide jagt, wo wird Roman Proteinsynthese vorgebeugt, da längere Behandlungen giftig für Zellen sind und schließen nicht die Mehrheit der älteren, stationäre Proteine aus, die Analyse, wie einige Proteine haben Halbwertszeiten von Tagen. Der Vergleich der Proteine unter beide nonreducing und reduzierenden Bedingungen erlaubt die Analyse von Disulfid Bindung Bildung, ein wichtiger Schritt bei der Faltung von vielen Sekretorische Proteine^{4,5,6, 7}.

Hier beschreiben wir eine allgemeine Methode für die Analyse der Proteinfaltung und Transport in intakten Zellen mit einem radioaktiven Puls-Chase-Ansatz. Während wir haben die Methode als bereitstellen soll detailliert wie möglich, das Protokoll hat ein fast grenzenloses Potential für Anpassungsfähigkeit und ermöglicht die Optimierung des Lesers bestimmte Proteine zu studieren.

Zwei alternative Puls-Jagd-Protokolle, eine für adhärente Zellen (Schritt 1.1 des Protokolls, die hier vorgestellten) und eine für Aussetzung Zellen (Schritt 1.2 des hier vorgestellten Protokolls) stehen zur Verfügung. Die Bedingungen zur Verfügung gestellt, hier sind ausreichend, um ein Protein mit Medium-High Ausdruck Niveaus ausgedrückt zu visualisieren. Wenn der Leser mit schlecht ausgedrückten Proteine oder verschiedenen Behandlungsgruppen Bedingungen, z. B. mehrere Immunperoxidase funktioniert ist es notwendig zu Gericht vergrößern oder Handy-Nummer entsprechend.

Für Aufhängung Puls Chase sind Chase Proben, die zu jedem Zeitpunkt alle aus einem einzigen Rohr Zellen getroffen. Die Wäsche Schritte nach dem Puls der Zeit entfallen; Stattdessen wird weiter Aufnahme von ³⁵S durch Verdünnung mit einem hohen Überschuss der unbeschrifteten Methionin und Cystein verhindert.

Die vorgestellten Protokolle verwenden radioaktiven ³⁵S-Label Cystein und Methionin-Proteinfaltung Zellprozesse folgen. Alle Operationen mit radioaktiven Reagenzien sollten durchgeführt werden, über geeignete Schutzmaßnahmen zur Minimierung des Bedieners und der Umwelt gegenüber radioaktiver Strahlung ausgesetzt und in einem bestimmten Labor durchgeführt werden. Als der Puls-Chase Kennzeichnung Technik ist relativ ineffizient bei kurzen Impulszeiten (< 15 min), weniger als 1 % des Grundbetrags von Radioaktivität in die neu synthetisierte Proteine aufgenommen wird. Nach der Anreicherung von Ziel-Protein über Immunopräzipitation enthält die Probe für SDS-PAGE weniger als 0,05 % des Grundbetrags der Radioaktivität.

Obwohl die ³⁵S Methionin und Cystein Kennzeichnung Mischung wird stabilisiert, wird einige Zersetzung, nachgiebig flüchtige radioaktive Verbindungen auftreten. Um der Forscher und das Gerät zu schützen, sollten einige Vorkehrungen getroffen werden. Der Forscher sollte immer die lokalen Strahlung Sicherheitsregeln einhalten und kann eine Kohle Pflege Maske, neben einem Laborkittel und (Doppel-) Handschuhe tragen. Lager Fläschchen mit ³⁵S Methionin und Cystein sollte immer unter einem Abzug oder unter einem lokalen Aspiration Punkt geöffnet werden. Bekannte Labor Kontamination Spots sind Zentrifugen, Pipetten, Wasserbäder, Inkubatoren und Schüttele-Apparat. Die Kontamination von diesen Bereichen wird reduziert, indem Pipettenspitzen mit einem Aktivkohlefilter, Positive Dichtung Mikrozentrifugenröhrchen (siehe Tabelle der Materialien), Aquarium Holzkohle Schwämme in Wasser Bäder, Holzkohle Filterpapiere geklebt in der Puls-Chase-Gerichte, Holzkohle Wache in die Aspiration und die Platzierung der Speisen mit Holzkohle Körner in Inkubatoren und Lagerbehälter.

Protokoll

Alle radioaktiven Reagenzien und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit örtlichen Universität Utrecht Strahlung Regeln und Vorschriften gehandhabt.

1. Puls Chase

1. Puls-Chase für adhärente Zellen
   Hinweis: Die hier angegebenen Volumen basiert auf 60 mm Zelle Kultur Gerichte. Für 35 mm oder 100 mm Schalen die Bände mit 1/2 oder 2, jeweils multipliziert. Dieses Protokoll verwendet eine Taktzeit von 0, 15, 30, 60, 120 und 240 min. 10 min und Chase Zeiten. Diese können je nach den spezifischen Proteinen untersucht (unten besprochen) variiert werden.
   1. Samen adhärente Zellen (z. B.HEK 293, HeLa, CHO) in sechs 60 mm Zelle Kultur Gerichte, so dass sie Subconfluent (80-90 %) am Tag der Jagd Puls. Verwenden Sie mindestens ein Gericht pro Zeitpunkt und/oder Zustand.
   2. Bei Bedarf transfizieren Sie Zellen mit handelsüblichen Transfektion Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers; oder Viral transduzieren⁸ Zellen 1 Tag vor der Puls-Jagd mit dem entsprechenden Konstrukt für Ausdruck experimentieren.
   3. Den Abwasch mit 2 mL Waschpuffer (Hank es ausgeglichen Salzlösung [HBSS]), fügen Sie 2 mL Hunger Medium (normale Kulturmedium fehlt Methionin und Cystein und fötalen Rinderserum [FBS], wie minimale wesentliche Medium [MEM] ohne Methionin und Cystein aber mit 10 mM HEPES, pH 7,4) und legen Sie die Gerichte in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ für 15 Minuten.
   4. Übertragen Sie die Gerichte zu den Racks in eine vorgewärmte 37 ° C Wasserbad, so dass sie in Kontakt mit Wasser aber nicht schwimmen. Einen Timer gestartet wird.
   5. Bei 40 s, Aspirieren das Hunger-Medium, 600 µL Puls-Lösung (Hunger Medien + 55 µCi/35-Millimeter-Teller zu kennzeichnen, finden Sie im vorhergehenden Schritt 1.1.1 Hinweis) erarbeiten in der Pipette, und fügen Sie es sanft in die Mitte des Tellers genau 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt in 1 min Abständen für t He übrigen Gerichte. Starten Sie mit der längsten Chase Probe bei Ihrem Experiment Zeit sparen.
      Hinweis: Beim Umgang mit radioaktiven Stoffen ist es wichtig, entsprechende Vorsichtsmaßnahmen und lokale Regeln und Vorschriften, versehentliche Belichtung und/oder Kontamination zu verhindern.
   6. Fügen Sie bei genau 11 min und für alle folgenden Gerichte, außer für die 0 min Chase Probe 2 mL Chase Medium direkt auf den Teller hinzu, aspirieren Sie es, und wieder 2 mL Chase Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt in 1 min Abständen für die restlichen Gerichte. Übertragen Sie alle Gerichte auf einem 37 ° C Inkubator.
   7. Bei genau 16 min, fügen Sie 2 mL Chase Medium (normale Kulturmedium + 10 mM HEPES [pH 7.4], 5 mM Cystein und Methionin 5 mM) direkt an die 0 min Probenschale auf das Puls-Medium zu stoppen, Kennzeichnung; dann aspirieren Sie sofort, übertragen Sie das Gericht auf eine gekühlte Aluminiumplatte, und 2 mL eiskaltes Stop Puffer (HBSS + 20 mM N- Ethylmaleimide [NEM]).
      Hinweis: Dies ist die 0 min Chase Probe. In diesem Beispiel gehen Sie direkt zu Schritt 1.1.9.
   8. Jedes Gericht Chase ins Wasserbad 2 min vor jedem Chase (z. B.24 min für eine 15 min Chase) zu übertragen und, damals genaue Chase (z.B.26 min. für ein 15 min Chase) Aspirieren der Chase-Medien (oder zu einem Microcentrifuge Schlauch zu übertragen, wenn folgende Pr Otein Sekretion) und das Gericht auf eine gekühlte Aluminium-Platte übertragen. 2 mL eiskaltes Stop Puffer hinzugeben.
   9. Inkubieren Sie alle Gerichte auf dem Eis in der Stop-Puffer für ≥5 min; dann aspirieren Sie die Stop-Lösung und waschen Sie es mit 2 mL eiskalte Hand. Aspirieren Sie die Wäsche und lösen Sie Gerichte mit 600 µL Lyse Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung [PBS] + nondenaturing Waschmittel [siehe Tabelle der Materialien] Proteaseinhibitoren + 20 mM NEM). Verwenden Sie Zelle Schaber, um sicherzustellen, dass die Gerichte quantitativ lysiert werden.
   10. Übertragen Sie auf einer 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge für 10 min bei 15.000-20.000 X g und 4 ° C zu die Kernen Pellets die lysate.
2. Puls-Jagd nach Aussetzung Zellen
   Hinweis: Um effiziente Kennzeichnung zu gewährleisten, sollte die Zellen in einer Konzentration von 3 x 10⁶ , 5 x 10⁶ Zellen/mL gepulst werden und sollen Chase Mengen 4 x das Puls-Volumen. Im folgenden Beispiel, gepulst wir 5 x 10⁶ Zellen in einem Volumen von 1 mL für 10 min, weichen jagen fünf Mal Punkte (0, 15, 30, 60 und 120 min.) von 1 mL, 1 x 10⁶ Zellen pro Zeitpunkt. Alle Lösungen sind die gleichen wie in Abschnitt 1.1.
   1. Kultur der Aussetzung Zellen (z. B.3 t 3, Jurkat) gemäß einer zuvor veröffentlichten Protokoll⁹ so dass es eine ausreichende Anzahl von Zellen zum Zeitpunkt des Experiments, mindestens 1 x 10⁶ Zellen pro Zeiteinheit zeigen und/oder Zustand.
   2. Bei Bedarf transfizieren Sie Zellen mit handelsüblichen Transfektion Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers, oder Viral transduzieren Sie⁸ Zellen 1 Tag vor der Puls-Jagd mit dem entsprechenden Konstrukt für Ausdruck experimentieren.
   3. Pellet-5 x 10⁶ Zellen pro Zustand in ein 50 mL-Tube für 5 min bei 250 X g bei Raumtemperatur, waschen Sie sie 1 X mit 5 mL der Hunger Medien, pellet-sie wieder und Aufschwemmen ihnen in 1 mL der Hunger Medien.
   4. Übertragen Sie die Zellen auf 37 ° C Wasserbad und inkubieren sie für 10-25 min. rühren den Röhren alle 10-15 min zu verhindern, dass die Zellen unten absetzen.
   5. Der Timer gestartet wird. Bei genau 1 min 275 µCi (55 µCi/1 x 10⁶ Zellen) unverdünnt Beschriftung der Röhrchen mit Zellen direkt hinzufügen und wirbeln um zu mischen.
      Hinweis: Beim Umgang mit radioaktiven Stoffen ist es wichtig, entsprechende Vorsichtsmaßnahmen und lokale Regeln und Vorschriften, versehentliche Belichtung und/oder Kontamination zu verhindern.
   6. Vor genau 11 min Halt Kennzeichnung durch Zugabe von 4 mL Chase Medien. Mischen Sie die Probe und sofort übertragen Sie 1 mL auf eine 15 mL-Tube auf Eis, mit 9 mL eiskalte Hand.
      Hinweis: Dies ist die 0 min Chase Probe.
   7. Wiederholen Sie diese Schritte für jeden aufeinanderfolgenden Zeitpunkt. Sobald alle Zeitpunkte gesammelt sind, pellet-Zellen für 5 min bei 250 X g bei 4 ° C. Aspirieren Sie das Medium (oder an eine neue 15 mL Tube übertragen Sie, wenn Protein Sekretion nach). Waschen Sie die Zellen mit 5 mL Stopp-Lösung und pellet-Zellen für 5 min bei 250 X g bei 4 ° C.
   8. Aspirieren Sie die Stop-Lösung, komplett lösen Sie die Zellen mit 300 µL Puffer eiskalte lyse und inkubieren sie für 20 min auf Eis, um eine komplette Lyse zu gewährleisten. Übertragen Sie auf einer 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge für 10 min bei 15.000-20.000 X g bei 4 ° C zu die Kernen Pellets die lysate.

(2) Immunopräzipitation

1. Antikörper zu kombinieren (siehe die Diskussion) und 50 µL Immunopräzipitation Perlen (z. B. Protein A-Sepharose) (10 % Suspension [V/V] Lyse Puffer + 0,25 % Rinderserumalbumin [BSA]) in einem Microcentrifuge Rohr und inkubieren sie bei 4 ° C für ca. 30 min in einen Shaker geben.
2. Pellet-die Perlen für 1 min bei 12.000 X g bei Raumtemperatur und den Überstand abgesaugt. Die Antikörper-Korn-Mischung 200 µL lysate hinzu und brüten bei 4 ° C in einem Shaker für 1 h oder Kopf-über-Kopf verlangt die Immunopräzipitation > 1 h.
3. Pellet-die Perlen für 1 min bei 12.000 X g bei Raumtemperatur. Den Überstand abgesaugt und 1 mL Immunopräzipitation Waschpuffer. Legen Sie die Probe in einem Shaker für 5 min bei Raumtemperatur.
4. Pellet-Perlen wie unter Punkt 2.3 beschrieben, und wiederholen Sie die Wäsche 1 X. Dann Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Perlen in 20 µL TE-Puffer, pH 6,8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Wirbel der Probe.
5. Fügen Sie 20 µL 2 x Probenpuffer ohne das Reduktionsmittel, Wirbel, erhitzen Sie es wieder für 5 min bei 95 ° C und Wirbel.
   Hinweis: Wenn nur die Proben vorbereiten, 2 µL von 500 mM DTT sollte an dieser Stelle hinzugefügt werden. Dann fahren Sie mit Schritt 2.7.
6. Pellet-Perlen wie unter Punkt 2.3 beschrieben. 19 µL des Überstands nonreduced zu einem frischen Microcentrifuge Schlauch mit 1 µL von 500 mM DVB-t übertragen, Zentrifugieren der Probe und Wirbel es schon wieder für 5 min bei 95 ° C erhitzt.
7. Spin-down der Probe für 1 min bei 12.000 X g; Dies ist die reduzierte Stichprobe. Die reduzierte und die nonreduced Probe 1,1 µL 1 m NEM hinzufügen und auf Zimmertemperatur abkühlen. Wirbel und Spin-down der Proben.

(3) SDS-PAGE

1. Bestimmen Sie zuerst die entsprechende SDS-PAGE Lösung von Gel Prozentsatz für das Protein von Interesse. Zum Beispiel HIV-1 gp120, wenn Deglycosylated, läuft bei ~ 60 kDa und wird in einem 7,5 % Gel analysiert.
2. Bereiten Sie die Lösung von Gel-Mischung ohne TEMED gemäß den Anweisungen des Herstellers (x % Acrylamid, 375 mM Tris-HCl [pH 8,8,] 0,1 % SDS [w/V], und 0,05 % Ammonium bleichen [APS] [w/V]) und unter Vakuum für entgasen > 15 min. Während die Gel-Mischung Entgasung ist, gründlich reinigen Sie die Gel-Glasplatten mit 70 % Ethanol und fusselfreien Gewebe und legen Sie sie in einer Gießvorrichtung.
3. Die Lösung von Gel-Mischung (auf eine Endkonzentration von 0,005 % [V/V]) TEMED hinzu, mischen, und pipette zwischen Glasplatten, ~1.5 cm Freiraum für das Stapeln Gel. Sorgfältig überlagern Sie das Gel mit entionisiertem H₂O oder Isopropanol und lassen Sie es zu polymerisieren.
4. Sobald die Lösung von Gel polymerisiert hat, bereiten die Stapeln Gel-Mischung (4 % Acrylamid, 125 mM Tris-HCl [pH 6,8], 0,1 % SDS [w/V], und 0,025 % APS [w/V]).
5. Spülen Sie oben auf die Lösung von Gel mit entionisiertem H₂O, und entfernen Sie dann alle Wasser.
   Hinweis: Verwenden Sie Filterpapier, um die letzten Tropfen zu entfernen.
6. Die Stapelung Gel-Mischung (0,005 % [V/V]) TEMED hinzu, mischen Sie, und überlagern Sie das Auflösen von Gel mit Stapeln Gel und legen Sie einen 15-Well-Kamm. Sobald das stapelnde Gel polymerisiert hat, überträgt es auf eine laufende Kammer und füllen Sie die oberen und unteren Kammern mit Puffer ausgeführt (25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin [pH 8,3] und 0,1 % SDS [w/V]).
7. 10 µL der Probe pro Bahn in einem 15-spurige Minigel zu laden. Vermeiden Sie das Laden der Proben in der ersten und der letzten Spur auf das Gel und laden Sie die nonreducing Probenpuffer in allen leeren Spuren zu verhindern, dass das Lächeln der Bands. Führen Sie die Gele bei konstanten 25 mA/Gel, bis Farbstoff vorne an der Unterseite des Gels ist.
8. Entfernen Sie die Gele aus Glasplatten, färben die Gele mit Protein-Färbelösung (10 % Essigsäure und 30 % Methanol in H₂O + 0,25 % brilliant blue R250 [w/V]) für 5 min. unter Rühren, und dann für 30 min mit entfärben (Färbung Lösung destain Lösung ohne brilliant blue R250).
9. Ordnen Sie die Gele verdeckt auf einem Kunststoff wickeln und dann legen Sie 0,4 mm Chromatographiepapier auf ihnen. Legen Sie die Gel Sandwich Chromatographie Papier-Seite nach unten auf ein Gel Trockner. Trocknen Sie nach den Anweisungen des Herstellers die Gele für 2 h bei 80 ° C.
10. Die getrockneten Gele auf einer Kassette übertragen und mit Autoradiographie Film oder Phosphor-Bildschirm überlagern. Wenn Autoradiographie Film verwenden, muss dieser Schritt in einem dunklen Raum durchgeführt werden.

Ergebnisse

Die Faltung und Sekretion von HIV-1 gp120 aus einem anhaftenden Puls Chase ist in Abbildung 2dargestellt. Das nonreducing Gel (Zellen NR in der Abbildung) zeigt die oxidative Faltung des gp120. Sofort nach dem Puls Kennzeichnung von 5 min (0 min. Chase) gp120 erscheint als eine diffuse Band höher in das Gel, und Fortschreiten der Jagd, die Band wandert nach unten das Gel durch noch mehr verbreitet Faltung Zwischenprodukte (IT), bis es reichert sich in den en...

Diskussion

Puls-Jagd-Methoden wurden wesentlich für die Entwicklung von wissenschaftlichen Verständnis der Proteinfaltung in intakten Zellen. Während wir versucht haben, ein Verfahren zu schaffen, die so allgemein wie möglich ist, hat dieser Ansatz das Potenzial für nahezu grenzenlose Variationen, verschiedene Prozesse zu studieren, die während der Faltung, den Transport und das Leben der Proteine in der Zelle auftreten.

Bei der Durchführung einer Puls-Verfolgungsjagd mit adhärenten Zellen in Ger...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.400
Acetic Acid	Sigma	A6283	glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20x25 cm	GE Life Sciences	28956475
Bromophenol Blue	Sigma	B8026	Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films	Kodak	Z350370-50EA
Cell-culture media	Various	N/A	Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine	Various	N/A	Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper	Whatman	1872047
Charcoal filtered pipette tips	Molecular bioproducts	5069B
Charcoal vacu-guard	Whatman	67221001
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma	112,553	for electrophoresis
Cysteine	Sigma	C7352	Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001	Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix	Perkin Elmer	NEG772014MC	Other size batches of label are available depending on useage
EDTA	Sigma	E1644	Molecular biology grade
Gel-drying equipment	Various	N/A
Glycerol	Sigma	G5516	Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper	GE Life Sciences	3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	24020117
Kimwipes delicate task wipes	VWR	21905-026
MES	Sigma	M3671	Molecular biology grade
Methanol	Sigma	MX0490
Methionine	Sigma	M5308	Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment	Various	N/A
NaCl	Sigma	S7653	Molecular biology grade
N-ethylmaleimide	Sigma	E3876	Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS	Sigma	P5368	Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads	GE health-care	17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma	L3771	Molecular biology grade
Triton X-100	Sigma	T8787	Molecular biology grade
Trizma base (Tris)	Sigma	T6066	Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager	Amersham	29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath	Nalgene	5970-0320PK