Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Özet

Burada tarif biz katlama, taşıma ve yıkımı canlı hücrelerde takip edilecek proteinlerin kinetik analiz sağlar bir genel nabız-chase yöntemi için bir iletişim kuralı.

Özet

Radyoaktif nabız-chase etiketleme eğitim konformasyon olgunlaşma, taşıma fonksiyonel hücresel konumlarını ve hedef proteinler canlı hücrelerde bozulma için güçlü bir araçtır. Kısa (darbe) radiolabeling kez kullanarak (< 30 dk) ve sıkı kontrol chase kere, toplam protein havuzu yalnızca küçük bir kısmını etiket ve onun katlama izleyin mümkündür. Nonreducing/azaltılması SDS-polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) ve immunoprecipitation (özel biçimi) antikorları ile birleştirildiğinde, süreçleri katlama ayrıntılı olarak incelenebilir. Bu sistem özellikleri çözünür protein, tekli ve çoklu geçiş transmembran proteinler, ağır N ve O glikozile proteinler gibi büyük bir varyasyon ile protein ve protein ve geniş disülfür olmadan Katlama çözümlemek için kullanılan bağ. Nabız-chase yöntemleri co ve ardından değişiklikleri, Oligomerizasyonda ve polimerizasyonu, temelde analiz bir protein doğumdan ölüme izin dahil olmak üzere ek özellikleri bir dizi içine kinetik çalışmalar temelidir. Nabız-chase çalışmalar protein katlanması üzerinde çalışmak için proteinler vitro artan zamansal çözünürlük ve fizyolojik bilgi sağlayarak diğer Biyokimya ve biyofizik yöntemleri ile tamamlayıcı niteliktedir. Bu kağıt içinde açıklandığı gibi yöntemleri kolayca neredeyse memeli ya da böcek-hücre sistemlerinde ifade edilebilir herhangi bir protein katlama çalışmaya adapte.

Giriş

Hatta nispeten basit protein katlama birçok farklı katlama enzim, moleküler chaperones ve kovalent modifikasyon¹içerir. Bu işlemler vitro tam bir sulandırma farklı bileşenleri dahil çok sayıda göz önüne alındığında pratik olarak mümkün değildir. Bu nedenle, in vivo, canlı hücrelerde katlama protein çalışmaya son derece arzu edilir. Radyoaktif nabız-chase teknikleri sentezi, katlama, taşıma ve proteinlerin kendi doğal ortamlarında bozulma çalışmak için güçlü bir araç kanıtlamak.

Metabolik ³⁵S etiketli metiyonin/Sistein ile kısa bir darbe sırasında proteinlerin etiketleme, radyoaktif bir etiket yokluğunda bir kovalamaca ardından, daha geniş hücresel ortamında yeni sentezlenmiş protein bir nüfusun belirli izlenmesini sağlar. Sonra hedef proteinler ve üzerinden SDS-sayfası veya diğer tekniklerle analiz izole yolu ile immunoprecipitation olabilir. Çoğu protein için onların yolculuk boyunca hücre SDS-sayfa jel üzerinde görülebilen değişiklikler tarafından işaretlenir. Örneğin, taşıma glikozile proteinlerin endoplazmik retikulum (ER) üzerinden Golgi kompleksi kez glukanlardir N bağlı değişiklikler veya ek O bağlantılı glukanlardir^2,3tarafından eşlik ediyor. Bu değişiklikler büyük artışlar SDS-sayfa hareketlilik değişiklikler görülebilir belirgin molekül ağırlığı neden. Olgunlaşma, sinyal peptid bölünme veya pro-peptidler, değişiklikleri kolayca SDS-sayfa jel⁴üzerinde takip edilmesi belirgin molekül ağırlığı sonuçlanan kaldırılması gibi proteolitik kesim tarafından da işaretlenebilir. Radyoaktivite vardır sikloheksimit çarpma gibi karşılaştırılabilir teknikleri üzerinde önemli avantajlar olarak daha uzun tedaviler hücrelere zehirlidir ve büyük, kararlı durum proteinler çoğunluğu dışlamayın nerede roman protein sentezi, engellenir Analizi, bazı proteinler yarım-gün canlıdır. Proteinler nonreducing her ikisi de altında karşılaştırılması ve koşulları azaltmak sağlar analiz disülfit bağı oluşumu, birçok salgı proteinler^4,5,6, katlanır önemli bir adım ⁷.

Burada biz bir radyoaktif nabız-chase yaklaşım kullanarak protein katlanması ve sağlam olan hücrelerde taşıma analizi için genel bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntemi olarak sağlamak amaçlanmıştır iken mümkün olduğunca ayrıntılı protokol adaptasyon için neredeyse sınırsız bir potansiyele sahiptir ve optimizasyon her okuyucunun spesifik proteinlerin çalışmaya izin verir.

İki alternatif darbe-chase protokol, bir yapışık hücreleri (adım 1.1 burada sunulan Protokolü) ve süspansiyon hücreleri (adım 1.2 burada sunulan Protokolü) için sağlanır. Koşulun sağlanması halinde burada orta-yüksek ifade düzeyleri ile ifade edilen bir protein görselleştirmek yeterli vardır. Eğer okuyucu kötü ifade proteinler veya birden çok immunoprecipitations gibi çeşitli posttreatment koşulları ile çalışma çanak boyutunu artırın veya uygun şekilde sayı hücre gereklidir.

Süspansiyon darbe chase için her zaman noktada alınan chase örnekler tüm hücreleri tek bir tüp alınır. Darbe ihmal sonra yıkama adımları; Bunun yerine, daha fazla ³⁵S birleşmesiyle etiketlenmemiş metionin ve sistein yüksek bir fazlalığı ile seyreltme tarafından engellenir.

Hücresel protein katlanması işlemlerini takip için radyoaktif ³⁵S etiketli sistein ve metionin sunulan iletişim kurallarını kullanır. Radyoaktif reaktifleri ile tüm işlemleri herhangi bir operatör ve radyoaktif Radyasyon ortamına maruz en aza indirmek ve belirlenmiş bir laboratuarda gerçekleştirilen uygun koruyucu önlemleri kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Nabız-chase teknik etiketleme kısa darbe zamanlarda nispeten verimsiz (< 15dk), radyoaktivite başlangıç miktarı % 1'i yeni sentezlenmiş protein dahil daha az. Üzerinden hedef protein immunoprecipitation zenginleştirme sonra radyoaktivite başlangıç miktarı daha az % 0.05 SDS-sayfa için örnek içerir.

³⁵S metionin ve mix etiketleme sistein stabilize rağmen bazı ayrıştırma radyoaktif uçucu bileşikler, verimli, ortaya çıkar. Araştırmacı ve aparatı korumak için bazı önlemler alınmalıdır. Araştırmacı her zaman yerel radyasyon güvenlik kurallarına itaat etmelisin ve maske, önlük ve eldiven (Çift Kişilik) yanı sıra hemşirelik kömür olabilir. Hisse senedi şişeleri ³⁵S metionin ve sistein ile her zaman bir duman başlıklı veya yerel aspirasyon noktası altında açılmalıdır. Bilinen laboratuvar kirlenme Santrifüjler Pipetler, su hamamlar, kuluçka ve shakers noktalardır. Bu alanların kirlenme pipet ipuçlarını kullanarak bir kömür filtre, pozitif-mühür microcentrifuge tüpler ( Tablo malzemelerigörmek), akvaryum kömür sünger nabız-chase yemekleri yapıştırılmış su banyoları, kömür filtre gazetelerde azalır, aspirasyon sistemi ve bulaşık kuluçka ve saklama kapları kömür tahıl içeren yerleşimini kömür muhafız.

Protokol

Tüm radyoaktif reaktifler ve yordamlar yerel Utrecht Üniversitesi radyasyon kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde ele.

1. darbe Chase

1. Nabız Chase yapışık hücreleri için
   Not: burada verilen birimleri 60 mm hücre kültür yemekleri üzerinde temel alır. 35 mm veya 100 mm yemekleri için birimleri tarafından 1/2 ya da 2, sırasıyla çarpın. Bu iletişim kuralı 0, 15, 30, 60, 120 ve 240 min 10 dk ve chase kez darbe zamanı kullanır. Bunlar belirli proteinler (Aşağıda tartışılan) okudu bağlı olarak farklı olabilir.
   1. Böylece onlar olacak altı 60 mm hücre kültür yemekleri tohum yapışık hücreleri (Örneğin, HEK 293, HeLa, CHO) subconfluent (% 80-%90) nabız chase gününde. Zaman noktası ve/veya koşulu başına en az bir tabak kullanın.
   2. Gerekirse, üreticinin yönergelerine göre piyasada bulunan transfection reaktifler hücrelerle transfect; veya virally hücreleri ifade için uygun yapı ile nabız-chase önce 1 gün deneme⁸ transduce.
   3. Bulaşık yıkama arabelleği (Hank'in dengeli tuz solüsyonu [HBSS]) 2 mL ile açlık Orta (normal kültür metionin ve sistein ve fetal Sığır serum [FBS], metionin ve sistein olmadan en az gerekli orta [MEM] gibi eksik Orta 2 mL ekleyin Ama 10 mM HEPES, pH 7.4 ile) ve bulaşıkları bir 37 ° C oksijen kuluçka makinesi %5 CO₂ ile 15 dakika yerleştirin.
   4. Böylece onlar su ile temas ancak değil float bulaşıkları raflar prewarmed 37 ° C su banyosu içinde aktarın. Bir sayacı başlatmak.
   5. 40 s, açlık orta Aspire edin, darbe çözüm (açlık medya + etiket, adım 1.1.1 önceki nota bakın 55 µCi/35 mm çanak) 600 µL kadar çizmek pipet içine ve yavaşça yemeğin ortasına doğru tam olarak 1 dakika tekrar bu adımı t için 1 dk aralıklarla ekleyin o kalan yemekleri. Denemeniz sırasında zaman kazanmak için en uzun kovalamaca örnek ile başlayın.
      Not: radyoaktif madde ele alırken, uygun önlemler ve yerel kurallar ve düzenlemeler kazayla maruz kalma ve/veya kontaminasyonu önlemek için takip için gerekli olduğunu.
   6. Tam olarak 11 dk ve 0 dk chase örnek dışında tüm aşağıdaki yemekleri için doğrudan yemek için chase Orta 2 mL ekleyin, bu Aspire edin ve tekrar, chase Orta 2 mL ekleyin. 1 dk aralıklarla kalan yemekler için bu adımı yineleyin. Tüm yemekler 37 ° C kuluçka aktarın.
   7. Tam olarak 16 dk chase Orta 2 mL ekleyin (normal kültür orta + 10 mM HEPES [pH 7.4], 5 mM sistein ve 5 mM metionin) 0 dk örnek yemek üstüne etiketleme; durdurmak için nabız orta için doğrudan o zaman, hemen Aspire edin, çanak için soğutmalı alüminyum plaka aktarmak ve buz gibi dur arabellek (HBSS + 20 mM N- ethylmaleimide [NEM]) 2 mL ekleyin.
      Not: 0 dk chase örnek bu. Bu örnek için doğrudan 1.1.9 adım geçin.
   8. Her chase yemeğin geri su banyosu için 2 dk önce her chase zaman (Örneğin, bir 15dk chase için 24 dk) aktarmak ve, tam chase zaman (Örneğin, bir 15dk chase için 26 dk), chase medya Aspire edin (veya pr takip microcentrifuge tüp aktarmak Otein salgılanması) ve bir soğutulmuş alüminyum tabak çanak transfer. Buz gibi dur arabellek 2 mL ekleyin.
   9. Tüm yemekler buz durağı arabellek ≥5 min için kuluçkaya; o zaman, durmak eriyik Aspire edin ve buz gibi durmak eriyik 2 mL ile yıkayın. Yıkama Aspire edin ve yemekleri ile lizis arabelleği 600 µL parçalayıcı (fosfat tamponlu tuz [PBS] + nondenaturing deterjan [bkz: Malzemeler tablo] + proteaz inhibitörleri + 20 mM NEM). Bulaşıkları kantitatif lysed emin olmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
   10. Transfer lysate 1.5 mL microcentrifuge tüp ve santrifüj 15.000-20.000 x g , 10 min ve 4 ° C çekirdekleri cips.
2. Nabız Chase süspansiyon hücreler için
   Not: verimli etiketleme emin olmak için hücreleri bir konsantrasyon 3 x 10⁶ 5 x 10⁶ hücre/ml, Geniş puls ve chase birimleri 4 x nabız cilt olmalıdır. Aşağıdaki örnekte, 5 x 10⁶ hücre 10 dk 1 ml hacminde Geniş puls, verim için beş saat chase puan (0, 15, 30, 60 ve 120 dk) 1 ml 1 x 10⁶ hücreler her zaman noktası içeren. Tüm çözümler Bölüm 1.1 ile aynıdır.
   1. Böylece hücreleri yeterli sayıda deneme, zaman zaman başına en az 1 x 10⁶ hücre üzerine gelin ve/veya durumu (Örneğin, 3T3, Jurkat) daha önce yayımlanan Protokolü⁹ göre süspansiyon hücre kültür.
   2. Gerekirse, üreticinin yönergelerine göre piyasada bulunan transfection reaktifler hücrelerle transfect veya virally hücreleri ifade için uygun yapı ile nabız-chase önce 1 gün deneme⁸ transduce.
   3. 5 x 10⁶ hücre başına 50 mL tüp durumda vasıl 250 x g oda sıcaklığında 5 min için cips, onları yıkamak ile açlık medya, 5 mL 1 x onları tekrar cips ve onları açlık medya 1 mL resuspend.
   4. Hücreleri 37 ° C su banyosu aktarmak ve alt kısmında yerleşme hücreleri önlemek için her 10-15 dk tüpler 10-25 dk. kışkırtmak için onları kuluçkaya.
   5. Sayacı başlatmak. Tam olarak 1 dk, hücreleri içeren tüp doğrudan 275 µCi (55 µCi/1 x 10⁶ hücreler) su katılmamış etiket eklemek ve karıştırmak için girdap.
      Not: radyoaktif madde ele alırken, uygun önlemler ve yerel kurallar ve düzenlemeler kazayla maruz kalma ve/veya kontaminasyonu önlemek için takip için gerekli olduğunu.
   6. Tam olarak 11 dk chase medya 4 mL ekleyerek etiketleme durdurmak. Örnek karıştırın ve hemen 1 mL 15 mL tüp buz, buz gibi durmak eriyik 9 mL içeren transfer.
      Not: 0 dk chase örnek bu.
   7. Her bir her başarılı zaman nokta için bu adımları yineleyin. Bir kez tüm zaman puan topladı, 250 x g 4 ° C'de 5 dakika için hücreleri cips Orta Aspire edin (veya protein salgılanması takip için yeni bir 15 mL tüp aktarmak). 5 mL durak çözüm de hücrelerle yıkama ve 250 x g 4 ° C'de 5 dakika için hücreleri cips
   8. Durmak eriyik Aspire edin, tamamen buz gibi lizis arabelleği 300 µL içeren hücreleri parçalayıcı ve onları tam lizis sağlamak için buz üzerinde 20 dk için kuluçkaya. Transfer lysate 1.5 mL microcentrifuge tüp ve santrifüj 15.000-20.000 x g çekirdekleri cips için 4 ° c de 10 dakika.

2. Immunoprecipitation

1. Antikor birleştirmek (konuya bakın) ve 50 µL immunoprecipitation boncuk (örneğin, protein A-Sepharose) (% 10 süspansiyon [v/v] lizis arabellek + %0.25 Sığır serum albümin [BSA]) bir microcentrifuge içinde tüp ve onları 4 ° c ~ 30 dk bir shaker için kuluçkaya.
2. Boncuk, 12.000 x g oda sıcaklığında 1 dk. için cips ve süpernatant Aspire edin. Lysate, 200 µL antikor-boncuk karışıma ekleyin ve bir shaker 1s veya baş-over 4 ° C'de immunoprecipitation gerektiriyorsa, kuluçkaya > 1 h.
3. Boncuk, 12.000 x g oda sıcaklığında 1 dk. için cips. Süpernatant Aspire edin ve immunoprecipitation yıkama arabellek 1 mL ekleyin. Bir shaker oda sıcaklığında 5 min için örnek bir yer.
4. 2.3. adımda açıklandığı gibi boncuk cips ve yıkama tekrar 1 x. Daha sonra süpernatant Aspire edin ve boncuk TE arabellek, pH 6.8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) 20 µL içinde resuspend. Girdap örnek.
5. 2 örnek arabellek olmadan indirgeyici, x 20 µL eklemek girdap, 95 ° C ve girdap 5 min için tekrar ısı.
   Not: 500 mm DTT 2 µL azalan bakiyeli örnekleri hazırlama yalnızca, bu noktada eklenmelidir. O zaman, 2.7 adıma geçin.
6. Boncuk 2.3 adımda anlatıldığı gibi cips. 500 mm DTT 1 µL içeren bir taze microcentrifuge tüp nonreduced süpernatant ile 19 µL aktarmak, örnek ve girdap santrifüj kapasitesi 95 ° C'de 5 min için tekrar ısıtma daha önce.
7. Spin aşağı 12.000 x g, 1 dk. için örnek; azaltılmış örnek bu. Aşağı oda sıcaklığına kadar serin ve 1 m NEM 1.1 µL hem azalır ve nonreduced örnek ekleyin. Girdap ve örnekleri aşağı spin.

3. SDS-SAYFA

1. Önce uygun SDS-sayfa çözme jel yüzdesini protein için faiz belirleyin. Örneğin, HIV-1 gp120, ne zaman deglycosylated, ~ 60 kDa çalışır ve % 7.5 jel içinde analiz edilir.
2. Üreticinin yönergelerine göre TEMED olmadan çözme jel karışım hazırlamak (% akrilamid, 375 mM Tris-HCl [pH 8.8,] % 0,1 SDS [w/v], x ve % 0.05 amonyum Persülfat [APS] [w/v]) ve için vakum altında degas > 15 dak. Jel karışım gaz giderme iken, iyice jel cam plakanın % 70 etanol ve hav bırakmayan dokular ile temiz ve bir döküm aparatı koyun.
3. TEMED (at %0,005 [v/v] son bir konsantrasyon) çözme jel karışımı ekleyin, iyice karıştırın ve cam plakanın istifleme jel için ~1.5 cm boşluk bırakarak arasında pipet. Dikkatle deiyonize H₂O veya isopropanol ile jel kaplama ve polimerize için bırakın.
4. Sonra çözme jel polimerli, yığın jel karışım hazırlamak (%4 akrilamid, 125 mM Tris-HCl [pH 6.8], % 0,1 SDS [w/v] ve % 0,025 APS [w/v]).
5. Çözme jel deiyonize H₂O ile üst floş ve tüm su kaldır.
   Not: filtre kağıdı son damla kaldırmak için kullanın.
6. TEMED yığın jel karışımı (%0,005 [v/v]) ekleyin, iyice karıştırın ve yığın jel ile çözme jel kaplama ve bir 15-iyi tarak yerleştirin. Yığın jel polimerli bir kez çalışan bir odasına aktarmak ve tampon çalıştıran ile alt ve üst odaları doldurmak (25 mM Tris-HCl, 192 mM glisin [pH 8.3] ve % 0.1 SDS [w/v]).
7. Örnek 15-lane minigel şeritte başına 10 µL yükleyin. İlk örnekleri ve jel son Lane'de yüklenmesini önlemek ve nonreducing örnek arabellek grup gülümseyen engellemek için tüm boş şerit yük. Boya açık jel alt kısmında olana jelleri bir 25 mA/jel sabiti çalıştırın.
8. Jelleri cam plakanın kaldırmak için çözüm protein boyama ile jelleri leke (% 10 asetik asit ve % 30 metanol H₂O + %0.25 parlak mavi R250 [w/v]) ile ajitasyon, 5 min için ve sonra 30 dk (boyama çözüm destaining ile destain çözüm olmadan parlak mavi R250).
9. Jelleri aşağı dönük bir plastik wrap ve görüntülenmemesini 0.4 mm Kromatografi kağıt üstünde tepe-in onları düzenleyin. Jel sandviç Kromatografi kağıt tarafında bir jel kurutma makinesi yerleştirin. Üreticinin yönergeleri izleyerek, 80 ° C'de 2 h için jeller Kuru
10. Kurutulmuş jelleri bir kaset için transfer ve onları autoradiography film ya da fosfor ekran yerleşimi. Autoradiography film kullanıyorsanız, bu adımı karanlık bir odada gerçekleştirilmelidir.

Sonuçlar

Katlama ve HIV-1 gp120 bir yapisan darbe chase üzerinden salgılanmasını Şekil 2' de gösterildiği. Nonreducing jel (şekilde hücreleri NR) oksidatif gp120 katlama gösterir. Nabız hemen sonra 5 dk (0 dak chase) gp120 etiketleme diffüz grup jel içinde daha yüksek olarak görünür ve chase ilerledikçe grup jel ile aşağı daha da sıkı grup (NT) birikir kadar ara ürün (BT) katlanır yayılmış geçirir Yerel olarak katlanmış gp120 temsil ede...

Tartışmalar

Nabız-chase yöntemleri protein sağlam hücreleri katlama bilim adamlarının anlayış geliştirmek için gerekli olmuştur. Biz mümkün olduğu kadar genel bir yöntem sağlamak teşebbüs ederken, bu yaklaşım katlanır, taşıma ve yaşam proteinlerin hücre içinde sırasında oluşan çeşitli işlemleri incelemek neredeyse sınırsız varyasyonları için potansiyele sahiptir.

Yemekleri yapışık hücreleri kullanarak bir darbe takip gerçekleştirirken, aynı ayrı tabak olarak m?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.400
Acetic Acid	Sigma	A6283	glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20x25 cm	GE Life Sciences	28956475
Bromophenol Blue	Sigma	B8026	Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films	Kodak	Z350370-50EA
Cell-culture media	Various	N/A	Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine	Various	N/A	Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper	Whatman	1872047
Charcoal filtered pipette tips	Molecular bioproducts	5069B
Charcoal vacu-guard	Whatman	67221001
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma	112,553	for electrophoresis
Cysteine	Sigma	C7352	Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001	Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix	Perkin Elmer	NEG772014MC	Other size batches of label are available depending on useage
EDTA	Sigma	E1644	Molecular biology grade
Gel-drying equipment	Various	N/A
Glycerol	Sigma	G5516	Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper	GE Life Sciences	3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	24020117
Kimwipes delicate task wipes	VWR	21905-026
MES	Sigma	M3671	Molecular biology grade
Methanol	Sigma	MX0490
Methionine	Sigma	M5308	Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment	Various	N/A
NaCl	Sigma	S7653	Molecular biology grade
N-ethylmaleimide	Sigma	E3876	Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS	Sigma	P5368	Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads	GE health-care	17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma	L3771	Molecular biology grade
Triton X-100	Sigma	T8787	Molecular biology grade
Trizma base (Tris)	Sigma	T6066	Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager	Amersham	29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath	Nalgene	5970-0320PK