一种用自动表型分析预测线虫化学毒性的高通量测定

摘要

通过对线虫表型分析的自动分析, 提出了一种定量鉴别和预测化学品急性毒性的方法。该协议描述了如何在384孔板中使用化学物质处理蠕虫, 捕获视频, 并量化与毒理学相关的表型。

摘要

对小鼠或大鼠等高阶生物中的化学品进行毒性测试是耗时和昂贵的, 因为它们的寿命长, 维护问题。相反, 线虫具有其优势, 使其成为毒性试验的理想选择: 寿命短、易于栽培、繁殖效率高。在这里, 我们描述了一个协议的自动表型分析的线虫在384孔板。线虫在384孔板中进行液体介质和化学处理, 并对每口井进行视频处理, 以量化化学对33种蠕虫特征的影响。实验结果表明, 量化的表型特征可以对不同化合物的急性毒性进行分类和预测, 并为啮齿类动物模型中的进一步传统化学毒性评价试验确定优先清单。

引言

随着化合物在工业生产和人们日常生活中的迅速发展, 研究这些化学品的毒性检测模型具有重要意义。在许多情况下, 使用啮齿类动物模型来评估不同化学品对健康的潜在毒性。一般来说, 在体内的啮齿类动物模型中, 确定致死浓度 (即不同化学品的50% 致死剂量 [ld50]) 被用作传统参数, 这既耗时又非常昂贵。此外, 由于减少、提炼或取代 (3r) 原则, 这对动物福利和伦理至关重要, 允许替换更高动物的新方法对^{科学研究有价值 1、2、3}.线虫是一种自由生活的线虫, 已从土壤中分离出来。由于其寿命短、栽培方便、繁殖效率高等优点, 在实验室中得到了广泛的应用。此外, 许多基本的生物途径, 包括基本的生理过程和在线虫的应激反应,^在高级哺乳动物^4,5^,6,7被保存^,8. 在我们和其他人进行的几次比较中, 在啮齿类动物中观察到的线虫毒性和毒性之间有很好的一致性⁹。所有这些都使线虫成为测试体内化学毒性影响的良好模型。

近年来, 一些研究对线虫的表型特征进行了量化。这些特性可用于分析^{化学品 2、3、10 的}毒性和蠕虫^的老化11。我们还开发了一种结合液体蠕虫养殖系统和图像分析系统的方法, 在不同的化学处理^下, 将蠕虫培养在384孔板中12。该定量技术已开发出来, 可在384孔板中进行12-24h 的化学处理后, 自动分析线虫的33个参数。采用自动显微镜级进行实验视频采集。这些视频由定制设计的程序处理, 与蠕虫移动行为相关的33个功能被量化。该方法用于对10种化合物的处理下的蠕虫表型进行量化。结果表明, 不同的毒性能改变线虫的表型。这些量化的表型可用于识别和预测不同化合物的急性毒性。该方法的总体目标是促进液体培养中线虫实验的观察和表型定量。该方法可用于化学毒性评价和表型定量, 有助于预测不同化合物的急性毒性, 并为进一步的传统化合物建立优先清单。啮齿类动物模型中的化学毒性评估试验。此外, 该方法还可作为食品添加剂污染、药理化合物、环境外源化合物等, 应用于新型化学品或化合物的毒性筛选和检测。

研究方案

该协议遵循了中国北京疾病预防控制中心动物伦理委员会的动物护理指南。

1. 化学制剂

1. 获取化学品 (表 1和材料表)。
2. 确定单个化学品的最高和最低剂量, 对蠕虫的最低浓度为100% 杀伤力 (lc100, 24小时), 最大浓度为100% 非杀伤力 (lc0, 24小时)。使用至少6次浓度最高的稀释剂 (表 1)。
   注: 进行初步蠕虫杀伤力测试⁹ , 以探索 lc100 和 lc0 的新化学品, 以确定剂量。
3. 用 k-介质 (材料表) 稀释每种化学品, 使其达到所需浓度的2倍。使用 k-媒体作为对照, 比较由化学品引起的表型变化。
   1. 例如, 制备7梯度浓度的氯化镉 (cdcl₂) (表 1)。为制备2倍最高浓度水溶液 (4.64 mg/ml), 在 k-介质的8毫升中溶解92.8 毫克的 cdcl₂固体粉末, 并在粉末完全溶解后填充至多 10 ml。用 k-介质稀释制备其他浓度水平。
4. 为化学梯度中的每个浓度准备8个平行井。每口井含有50μl 的2倍化学溶液。准备至少三组由八个平行井组成的 k-介质作为控制 (表 2)。
   注: 简而言之, 每种化学品的单次剂量所需的体积为500μl 的2倍工作溶液。

2. 蠕虫准备

1. 从 caenorhabditis 遗传学中心 (cgc) 中获得野生型 n2 蠕虫和大肠杆菌op50 菌株。
2. 获取同步的 l4 蠕虫。
   1. 从条纹板中选取单个大肠杆菌op50。在 lb 肉汤100毫升的环境中对菌落进行无菌接种, 并在37°c 下过夜生长。
      注:大肠杆菌op50 溶液现已准备好播种到线虫生长介质 (ngm,材料表) 板。
   2. 将 ngm 倒进一个90毫米的塑料 petri 板。浇注每个盘子的 300μl大肠杆菌op50 溶液后的第二天浇注。在20°c 下, 用 op50 在 ngm 板上培育 n2 蠕虫约 2-3天, 直到大多数蠕虫达到成虫阶段。
   3. 将妊娠蠕虫收获到15毫升无菌锥形离心管中, 并带有无菌 h2o.让蠕虫沉淀至少 2分钟, 吸气 h2o, 并添加5毫升的漂白剂 (材料表)。
   4. 旋转管 5分钟, 旋转管 30秒 (在 1, 300 x克), 以颗粒的鸡蛋, 并丢弃上清液。
   5. 用5毫升的无菌 h2o 清洗鸡蛋, 并将试管旋涡 5次. 将试管离心 30秒 (1, 300 x克), 取出上清液, 然后再次清洗。
   6. 将鸡蛋移到一个带有 op50 的新的 ngm 板上。在20°c 下孵化。第二天早上监视孵化的 l1 蠕虫;蠕虫将在大约40小时内到达 l4 阶段。
3. 用 k-介质将90毫米 petri 板上的 l4 蠕虫洗成一个50毫升无菌锥形管。在立体显微镜下, 将蠕虫的浓度调整到每 100μl k-培养基中的 ~ 40只动物。在384井板的每口井中加入 50μl (~ 20 蠕虫)。这些同步蠕虫 (l4 阶段) 已准备好通过化学品进行以下处理。

3. 化学处理和视频采集

注: 在384孔板中, 蠕虫 (每口井 50μl) 被处理到6至7剂量的单个化学品中 (表 1)。准备8口平行井, 每口都含有50μl 的2倍化学溶液 (8 口井充满相同的化学物质和相同浓度,表 2)。所有视频都是使用连接在倒置显微镜 (材料表) 上的数码相机收集的。化学处理实验持续24小时。在24小时化学处理实验中, 不要在每口井中添加细菌食物。

1. 在添加化学品之前, 在自动阶段将384孔板与同步蠕虫一起设置, 并在编程采集过程中拍摄每口井的视频 (每秒7帧2秒; 扫描每个板大约需要 25分钟)。
2. 为每口井添加根据第1节制备的2倍化学库存 50μl (表 2)。将时间设置为0小时点。
3. 在20°c 下孵育384孔板, 并在80点转速时在孵化器振动台中摇晃。
4. 从孵化器中取出盘子, 转移到自动阶段。在12小时和24小时拍摄整个盘子中每口井的视频, 检查在 k-培养基中进行的每一种特定化学处理的蠕虫表型。一个板屏幕大约需要25分钟。

4. 实验视频处理

注: 编写并打包了实验视频和图像处理程序。它可以自由下载 (见材料表)。实验视频以图像帧序列的形式存储, 每个视频的帧序列存储在特定的目录中。该程序可以识别蠕虫和量化表型自动。

1. 在图形用户界面 (gui,图 1) 中, 添加参数, 如帧序列目录、输出目录、蠕虫大小参数和移动阈值参数。单击 "分析"按钮处理实验图像。
   1. 单击 "选择"按钮以选择源图像目录。
   2. 在接口中添加中间结果目录。
      注: 中间结果包括分段的图像。这些中间结果对处理后的图像进行目视观察是有用的。
   3. 在接口中添加最终结果目录。
   4. 在界面的"蠕虫大小" 文本框中添加平均蠕虫大小参数。
      注: 实验中使用的大小参数为 2, 000。
   5. 在接口中添加移动比率的阈值。
      注: 实验中使用的比率为0.93。
   6. 单击 "分析"按钮开始图像处理。单击"重置" 按钮以清除添加的参数。
      注: 为蠕虫定义和量化了33个功能。所有定义的表型都按类别排序 (如表 3所示)。这些特征可以从实验图像中量化。通过比较这些特征, 可以对具有不同毒性的不同化学品进行定量比较。

结果

我们已经测试了暴露在超过10种化学物质12的不同浓度下的蠕虫的表型。在测试中, 在三个时间点 (0小时、12小时和 24小时) 对每种化合物的33个不同特征进行了量化。此前, 对人工和寿命分析的自动分析进行了 1^{1、1 2 项}比较。在这个试验中, 我们发现化学物质和浓度会影响蠕虫的表型。此方法的概述如

讨论

线虫的优点导致其在毒理学⁹中的应用越来越多, 无论是在机械研究还是高通量筛选方法。近年来, 线虫在补充其他毒理学研究模型系统方面的作用显著增加, 特别是在新化学品的快速毒性评估方面。本文为384井板蠕虫表型的高通量定量筛选提供了一种新的方法, 用于化学毒性的自动鉴定和评价。该检测方法是24小时内化学品急性毒性检测的理想选择, 可应用于亚急性毒...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Sigma-Aldrich	59300
384-well plates	Throme	142761
Agar	Bacto	214010
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	PHL80892
Bleach buffer			0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	21074
CCD camera	Zeiss	AxioCam HRm	Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Copper(II) sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Ethanol	Sigma-Aldrich	24105
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
K-Medium			3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth			10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	63140
NGM Plate			3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone	Bacto	211677
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	60130
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	795488
PPB buffer			35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker	ZHICHENG	ZWY-200D
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	71382
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich	s7920
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	239305
The link of program			https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625
Zeiss automatic microscope	Zeiss	AXIO Observer.Z1	Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera