꼬마 선 충 의 프로 파일링 Phenotypic 자동화 하 여 화학 독성의 예측에 대 한 높은 처리량 분석 결과

요약

양적 방법 확인 하 고 자동으로 꼬마 선 충의 phenotypic 프로 파일링 분석 하 여 화학 물질의 급성 독성 예측 개발 되었습니다. 이 프로토콜 384-잘 접시에 화학 물질과 웜 치료, 비디오, 캡처 및 독물학 관련된 고기를 계량 하는 방법을 설명 합니다.

초록

쥐 또는 쥐와 같은 더 높은 주문 유기 체에 화학 물질의 독성 시험 적용 시간과 비싼, 그들의 긴 수명 및 유지 보수 문제 때문입니다. 선 충 류 꼬마 선 충 (C. 선 충) 독성 시험을 위한 이상적인 선택 있도록 장점이 오히려: 짧은 수명, 쉽게 경작, 및 효율적인 복제. 여기, 우리는 자동 phenotypic 프로 파일링 C. 선 충 의 384-잘 접시에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 선 충 벌레 액체 매체 및 화학 치료, 384-잘 접시에 교양 있으며 동영상 33 웜 기능에 화학적 영향을 계량 하기 각 잘 찍힌다. 실험 결과 계량된 형 기능 분류 및 다른 화합물에 대 한 급성 독성을 예측 하 고 설정할 수 더 전통적인 화학 독성 평가 시험에 대 한 우선 순위 목록을 설치류 모델에서을 보여 줍니다.

서문

산업 생산 및 사람들의 일상 생활에 적용 하는 화합물의 급속 한 발전, 함께 그것은 독성 화학 물질에 대 한 모델을 테스트를 공부 하는 것이 중요. 대부분의 경우, 설치류 동물 모델 건강에 다른 화학 물질의 잠재적 독성을 평가 하기 위해 채택 된다. 일반적으로, 치명적인 농도 (즉, assayed 50% 치 사 량 [LD50] 다른 화학 물질의) 결정 시간이 소요 되 고 매우 비싼 vivo에서, 설치류 (쥐/마우스) 모델에서 전통적인 매개 변수로 사용 됩니다. 또한, 감소, 수정, 또는 교체는 동물 복지 및 윤리 중심 (3R) 원리, 더 높은 동물의 교체는 과학 연구^1,2,3 가치를 허용 하는 새로운 방법 . C. 선 충 은 토양에서 격리 되어 자유 롭 살아있는 선 충 류 이다. 그것은 널리 사용 되었습니다 실험실에서 연구 유기 체로 짧은 수명, 쉽게 재배, 효율적인 복제 등의 유익한 특성 때문에. 또한, C. 선 충 에 기본적인 생리 적 프로세스 및 스트레스 응답을 포함 하 여 많은 기본적인 생물 학적 경로 높은 포유류^4,5,,67 에 보존 됩니다. ^{, 8}. 우리와 다른 사람 만든 비교에, C. 선 충 독성 및 독성 설치류⁹관찰 사이 좋은 색인 이다. 이 모든 게 선 충 C. 화학 독성 vivo에서의 효과 테스트 하는 좋은 모델.

최근, 일부 연구 정량 C. 선 충의 phenotypic 특징. 화학^2,,310 의 독성 벌레¹¹의 노화를 분석 하는 기능을 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 경작 시스템 및 이미지 분석 시스템, 벌레는 다른 화학 치료¹²에서 384-잘 접시에 교양 있는 액체 벌레를 결합 하는 방법을 개발. 이 양적 기술 액체 매체와 384-잘 접시에 화학 치료의 12-24 h 후 C. 선 충의 33 매개 변수를 자동으로 분석 개발 되었습니다. 자동화 된 현미경 단계 실험 비디오 수집에 사용 됩니다. 벌레의 이동 행동에 관련 된 33 기능 계량 및 동영상 사용자 정의 설계 프로그램에 의해 처리 됩니다. 메서드는 10 화합물의 치료에서 벌레 고기를 계량 하는 데 사용 됩니다. 결과 표시 다른 독성 C. 선 충의 고기를 변경할 수 있습니다. 이러한 계량된 고기를 식별 하 여 다른 화합물의 급성 독성 예측 사용할 수 있습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 관찰과 실험 액체 문화에서 C. 선 충 의 phenotypic 정량화를 촉진. 이 메서드는 화학 독성 평가에 다른 화합물의 급성 독성을 예측 하 고 대 한 우선 순위 목록을 설정 형 quantifications C. 선 충 의 응용 프로그램에 대 한 더 전통적인 화학 독성 평가 설치류 모델에서 테스트합니다. 또한,이 방법은 독성 검사 및 식품 첨가제 에이전트 오염, pharmacautical 화합물, 환경 외 인 화합물, 그리고에 새로운 화학 물질 또는 화합물의 테스트에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

프로토콜 질병 예방 및 중국에 있는 컨트롤에 대 한 베이징 센터의 동물 윤리 위원회의 동물 보호 지침을 따릅니다.

1. 화학 준비

1. 화학 물질을 (표 1 및 표의 재료)를 가져옵니다.
2. 100% 치 (LC100, 24 h)의 최소 농도 웜 100 %nonlethality (LC0, 24 h)의 최대 농도 대 한 개별 화학 물질의 최고 및 최저 복용량을 결정 합니다. (표 1)의 높은 농도의 6 희석 사용 합니다.
   참고: LC100와 LC0는 새로운 화학 물질에 대 한 복용량을 결정 하기 위해 예비 웜 치 테스트⁹ 실시 합니다.
3. 필요한 농도 x 2 K-중간 (자료 테이블)과 각 화학 물질을 희석. 컨트롤 K-매체를 사용 하 여 화학 물질에 의해 발생 하는 표현 형 변경 비교.
   1. 예를 들어 카드뮴 염화 (CdCl₂)의 7 그라데이션 농도 준비 (표 1). 2 배를 준비 하 높은 집중 된 수성 해결책 (4.64 mg/mL), K-중간의 8 ml에서 CdCl₂ 고체 분말의 92.8 mg를 녹이 고 가루는 완전히 해산 후 최대 10 mL를 채우기. K-매체와 희석 하 여 다른 농도 준비 합니다.
4. 화학에서 모든 농도 대 한 8 개의 병렬 우물을 준비 합니다. 각 잘 화학 솔루션 x 2의 50 µ L를 포함합니다. (표 2) 컨트롤로 K-중간의 8 개의 병렬 우물의 적어도 3 개 그룹을 준비 합니다.
   참고: 간단 하 게, 작업 솔루션 x 2의 500 µ L의 볼륨은 각 화학의 단일 투여에 필요한.

2. 웜 준비

1. 야생-타입 N2 웜 및 대장균 OP50 긴장 꼬마 유전학 센터 (CGC)에서 가져옵니다.
2. 동기화 된 L4 벌레를 얻을.
   1. 조 흔 격판덮개에서 대장균 OP50의 단일 식민지를 선택 하십시오. Aseptically LB 국물의 100 mL에 식민지를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 그것을 성장합니다
      참고: 대장균 OP50 솔루션은 이제 선 충 성장 매체 (NGM, 테이블의 재료) 판 시드를 위한 준비.
   2. NGM 90 m m 플라스틱 페 트리 접시에 붓으십시오. 각 씨앗 플레이트 대장균 OP50 솔루션의 300 µ L를 붓는 후 하루. 약 2-3 일 벌레의 대부분에는 성인 무대에 도달 했습니다 때까지 20 ° C에서 OP50는 NGM 접시에 N2 벌레를 품 어.
   3. 살 균 H₂o. 15 mL 원뿔 메 마른 분리기 관으로 수확 벗 웜 웜 2 분 이상에 대 한 진정, H₂O, 발음 및 표 백제 버퍼 (자료 테이블)의 5 mL을 추가 하자.
   4. 소용돌이 관 5 분 동안 회전 30 튜브 (1300 x g)에 계란, 작은 하는 상쾌한 삭제.
   5. 워시 살 균 H₂O와 소용돌이의 5 mL와 함께 계란 튜브 5 s. 원심 분리기 튜브 30 (에서 1300 x g) s, 상쾌한, 제거 하 고 세척에 대 한에 대 한 다시.
   6. OP50와 새로운 NGM 접시에 계란 플라스틱 20 ° c.에서 그들을 품 어 모니터 부 화 L1 벌레 다음 아침; 벌레 약 40 h에서 L4 단계를 도달할 것 이다.
3. 워시 살 균 50 mL 원뿔 튜브로 K-매체와 90 mm 페 트리 접시에서 L4 벌레. 벌레는 stereomicroscope에서 K-매체의 100 µ L 당 40 동물의 농도 조정 합니다. 384-잘 접시의 각 음에 50 µ L (~ 20 벌레)를 추가 합니다. 이 동기화 된 벌레 (L4 단계) 화학 물질에 의해 다음 치료에 대 한 준비가 되었습니다.

3. 화학 처리 및 비디오 캡처

참고: 384-잘 접시에 웜 (각 잘에서 50 µ L) 6 7 복용량의 개별 화학 (표 1)에 처리 됩니다. 8 병렬 웰 스, 각 (8 우물 가득 같은 화학 및 동일한 농도, 표 2) 모든 복용량에 대 한 화학 솔루션 x 2의 50 µ L을 포함 준비. 모든 비디오는 거꾸로 한 현미경 (자료 테이블)에 연결 된 디지털 카메라를 사용 하 여 수집 됩니다. 화학 치료 실험 24 시간 동안 지속 된다. 24 h 화학 치료 실험 기간 동안 각 잘에 세균성 음식을 추가 하지 마십시오.

1. 화학 물질을 추가 하기 전에 자동 무대에 동기화 된 웜 384-잘 접시를 설정 하 고 프로그램된 인수 절차와 각의 동영상 (2 초당 7 프레임 s 스캔 각 접시 ~ 25 분 소요).
2. 섹션 1 각 음 (표 2)에 따라 준비 하는 화학 주식 x 2의 50 µ L를 추가 합니다. 시간 0 h 지점으로 설정 합니다.
3. 20 ° C에서 384-잘 접시를 품 어 고 인큐베이터 셰이 커에 80 rpm에서 그것을 흔들어.
4. 인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 자동 단계에 그것을 전송. 걸릴 동영상의 전체 판의 각 잘과 24 h, 12 h K-중간에 각 특정 화학 치료에 대 한 벌레의 고기를 확인. 약 25 분이 한 접시 화면에 대 한 필요 합니다.

4. 실험 비디오 처리

참고: 실험 비디오 및 이미지 처리 프로그램 작성 되었고 포장. 그것은 ( 재료의 표참조) 자유롭게 다운로드 될 수 있다. 실험적인 비디오 이미지 프레임 시퀀스의 형태로 저장 되며 각 비디오의 프레임 시퀀스는 특정 디렉토리에 저장 됩니다. 프로그램 벌레를 인식 하 고 자동으로 고기를 계량 수 있습니다.

1. 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI, 그림 1)에서 프레임 시퀀스 디렉터리, 출력 디렉터리, 웜 크기 매개 변수 움직임 임계값 매개 변수 등의 매개 변수를 추가 합니다. 실험적 이미지 처리 분석 버튼을 클릭 합니다.
   1. 소스 이미지 디렉터리를 선택 하려면 선택 단추를 클릭 합니다.
   2. 인터페이스에서 중간 결과 디렉터리를 추가 합니다.
      참고: 중간 결과 포함 된 이미지. 이러한 중간 결과 처리 된 이미지의 시각적 관찰에 대 한 유용 합니다.
   3. 인터페이스에서 최종 결과 디렉터리를 추가 합니다.
   4. 인터페이스에서 웜 크기 textbox에서 평균 웜 크기 매개 변수를 추가 합니다.
      참고: 실험에 사용 된 크기 매개 변수는 2000.
   5. 이동된 비율의 인터페이스에 추가 합니다.
      참고: 비율 실험에 사용 되는 0.93입니다.
   6. 이미지 처리를 시작 하려면 분석 버튼을 클릭 합니다. 추가 매개 변수를 재설정 버튼을 클릭 합니다.
      참고: 정의 및 벌레에 대 한 계량 33 기능이 있습니다. 모든 정의 된 고기 ( 표 3에 나열 된) 범주에 의해 정렬 됩니다. 이러한 기능 실험 이미지에서 측정할 수 있습니다. 이러한 기능을 비교 하 여 다른 독성 있는 다른 화학 물질 중 양적 비교를 수행할 수 있습니다.

결과

10 개 이상의 화학 물질¹²의 다른 농도에 노출 하는 벌레의 고기 테스트 했습니다. 테스트에서 33 가지 기능 (0 h, 12 h, 그리고 24 h) 3 시간 시점에 각 화합물에 대 한 정량 했다. 이전에 매뉴얼 및 수명 분석 결과의 자동 분석 비교^11,12이루어졌다. 이 분석 결과에서 우리는 화학 물질과 농도 영향을 미칠 수 웜 고기 ?...

토론

C. 선 충 의 장점은 독극물⁹, 모두 기계 연구와 높은 처리량 검열 방법의 증가 사용에 이르렀다. 독물학 연구에서 다른 모델 시스템 보완에 C. 선 충 에 대 한 증가 역할은 최근 몇 년 동안, 특히 새로운 화학 물질의 급속 한 독성 평가 대 한 놀라운 되었습니다. 이 문서에는 자동 식별 및 화학 독성의 평가 대 한 384-잘 접시에 고기를 벌레의 높은 처리량, 양적 심사의 새?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Sigma-Aldrich	59300
384-well plates	Throme	142761
Agar	Bacto	214010
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	PHL80892
Bleach buffer			0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	21074
CCD camera	Zeiss	AxioCam HRm	Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Copper(II) sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Ethanol	Sigma-Aldrich	24105
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
K-Medium			3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth			10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	63140
NGM Plate			3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone	Bacto	211677
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	60130
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	795488
PPB buffer			35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker	ZHICHENG	ZWY-200D
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	71382
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich	s7920
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	239305
The link of program			https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625
Zeiss automatic microscope	Zeiss	AXIO Observer.Z1	Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera