Un análisis de alto rendimiento para la predicción de toxicidad química por perfiles fenotípicos automatizado de Caenorhabditis elegans

Resumen

Se ha desarrollado un método cuantitativo para identificar y predecir la toxicidad de productos químicos, analizando automáticamente los perfiles fenotípicos de Caenorhabditis elegans. Este protocolo describe cómo tratar gusanos con productos químicos en una placa de 384 pozos, capturar videos y cuantificar fenotipos relacionados toxicológicos.

Resumen

Aplicación de ensayos de toxicidad de químicos en los organismos superiores de la orden, tales como ratones o ratas, es lento y costoso, debido a su larga vida útil y problemas de mantenimiento. Por el contrario, el nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) tiene ventajas que lo hacen una opción ideal para las pruebas de toxicidad: una vida corta, fácil cultivo y reproducción eficiente. Aquí, describimos un protocolo para la automática perfiles fenotípicos de C. elegans en una placa de 384 pozos. Los gusanos nematodos son cultivados en una placa de 384 pozos con líquido medio tratamiento físico-químico, y videos se toman de cada pozo para cuantificar la influencia química de 33 características de gusano. Resultados experimentales demuestran que las características de fenotipo cuantificada pueden clasificar y predecir la toxicidad aguda de compuestos químicos diferentes y establecer una lista de prioridades para más pruebas de la evaluación de la toxicidad química tradicional en un modelo roedor.

Introducción

Junto con el rápido desarrollo de compuestos químicos aplicados a la producción industrial y la vida cotidiana de las personas, es importante estudiar la toxicidad pruebas modelos de los productos químicos. En muchos casos, el modelo animal de roedor se emplea para evaluar la potencial toxicidad de diferentes productos químicos sobre la salud. En general, la determinación de concentraciones letales (es decir, el ensayo 50% dosis letal [DL50] de diferentes productos químicos) se utiliza como parámetro tradicional en un modelo de roedor (rata/ratón) en vivo, que es muy costoso y desperdiciador de tiempo. Además, debido a reducir, afinar, o sustituir (3R) principio fundamental con la ética y el bienestar de los animales, nuevos métodos que permiten la sustitución de los animales superiores son valiosos para la investigación científica^1,2,3 . C. elegans es un nematodo de vida libre que se ha aislado del suelo. Ha sido ampliamente utilizado como un organismo de investigación en el laboratorio debido a sus características beneficiosas, tales como una vida útil corta, fácil cultivo y reproducción eficiente. Además, muchos caminos biológicos fundamentales, incluyendo los procesos fisiológicos básicos y las respuestas de estrés en C. elegans, se conservan en el más alto mamíferos^{4,5,6,7 , 8}. en un par de comparaciones entre nosotros y otros hemos hecho, hay una buena concordancia entre la toxicidad de C. elegans y toxicidad en roedores⁹. Todo esto hace que C. elegans un buen modelo para probar los efectos de toxicidad química en vivo.

Recientemente, algunos estudios cuantifican las características fenotípicas de C. elegans. Las características se pueden utilizar para analizar la toxicidad de productos químicos^2,3,10 y la crianza de gusanos¹¹. También se desarrolló un método que combina un líquido gusano cultivo sistema y un sistema de análisis de imagen, en la que los gusanos se cultivan en una placa de 384 pozos bajo diferentes tratamientos químicos¹². Esta técnica cuantitativa ha sido desarrollada para analizar automáticamente los 33 parámetros de C. elegans después de 12-24h de tratamiento químico en una placa de 384 pozos con medio líquido. Una platina del microscopio automatizado se utiliza para la adquisición de video experimental. Los videos son procesados por un programa de diseño personalizado, y se cuantifican 33 características relacionadas con el comportamiento de movimiento de los gusanos. El método se utiliza para cuantificar los fenotipos gusano bajo el tratamiento de 10 compuestos. Los resultados muestran que la toxicidad diferente puede alterar los fenotipos de C. elegans. Estos fenotipos cuantificables pueden utilizarse para identificar y predecir la toxicidad aguda de compuestos químicos diferentes. El objetivo general de este método es facilitar la observación y cuantificación fenotípica de experimentos con C. elegans en un cultivo líquido. Este método es útil para el uso de C. elegans en evaluaciones de la toxicidad química y cuantificaciones de fenotipo, que ayudan a predecir la toxicidad aguda de compuestos químicos diferentes y establecer una lista de prioridad para el más tradicional pruebas de evaluación de la toxicidad química en un modelo roedor. Además, este método puede aplicarse a la toxicidad, evaluación y análisis de nuevos productos químicos o el compuesto como la contaminación del agente aditivo de alimentos, farmacéutico compuestos, compuestos exógenos ambientales y así sucesivamente.

Protocolo

El protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales del Comité de ética Animal del centro de Beijing para la prevención de enfermedades y el Control en China.

1. química preparación

1. Obtener productos químicos (tabla 1 y Tabla de materiales).
2. Determinar la dosis más alta y más baja de los productos químicos individuales para una concentración mínima del 100% de mortalidad (LC100, 24 h) y una concentración máxima de 100% nonlethality (LC0, 24 h) a los gusanos. Use al menos seis diluciones de la mayor concentración (tabla 1).
   Nota: Realizar un gusano preliminar mortalidad prueba⁹ para explorar LC100 y LC0 para un nuevo producto químico, para determinar la dosificación.
3. Diluir cada sustancia con K-medio (Tabla de materiales) a 2 x la concentración requerida. Uso K-medio como control para comparar las alteraciones del fenotipo causadas por los productos químicos.
   1. Por ejemplo, preparar 7 concentraciones gradiente de cloruro de cadmio (CdCl₂) (tabla 1). Para preparar 2 x la solución acuosa concentrada más alta (4,64 mg/mL), disolver 92,8 mg de CdCl₂ polvo sólido en 8 mL de medio de K y completar hasta 10 mL después de que el polvo se haya disuelto completamente. Preparar los otros niveles de concentración por dilución en medio K.
4. Preparar ocho pozos paralelos para cada concentración en el gradiente químico. Bien, cada una contiene 50 μl de la 2 x solución química. Preparar al menos tres grupos de ocho pozos paralelos de K medianas como controles (tabla 2).
   Nota: en breve, un volumen de 500 μl de 2 x solución de trabajo es necesario para una sola dosis de cada sustancia química.

2. gusano preparación

1. Obtener gusanos de N2 de tipo salvaje y cepas de Escherichia coli OP50 desde el centro de genética de Caenorhabditis (CGC).
2. Obtener gusanos L4 sincronizados.
   1. Escoge una sola Colonia de OP50 de e. coli de la placa de la raya. Inocular la colonia de 100 mL de LB caldo asépticamente y crecer durante la noche a 37 ° C.
      Nota: La solución de e. coli OP50 está ahora lista para la siembra a placas de medio (NGM, Tabla de materiales) de crecimiento nematodos.
   2. Vierta NGM en una placa de Petri de plástico de 90 mm. Semilla cada placa con 300 μL de solución de e. coli OP50 el día después de verter. Incubar gusanos de N2 en las planchas NGM con OP50 a 20 ° C durante 2-3 días, hasta que la mayoría de los gusanos ha llegado a la etapa adulta.
   3. Cosecha de gusanos grávidos en un tubo de centrifugadores cónicos estériles de 15 mL estéril de H₂O. Que los gusanos asentarse durante al menos 2 minutos, aspirar la H₂O y añadir 5 mL de solución de lejía (Tabla de materiales).
   4. Vórtice el tubo durante 5 minutos, girar el tubo durante 30 s (a 1.300 x g) a los huevos de la pelotilla y descarte el sobrenadante.
   5. Lavar los huevos con 5 mL de H₂O y vórtice estéril el tubo por 5 s. Centrifugar el tubo durante 30 s (a 1.300 x g), eliminar el sobrenadante y lavar otra vez.
   6. Pipetear los huevos en un plato nuevo de NGM con OP50. Incubar a 20 ° C. Controlar el tramado L1 gusanos a la mañana siguiente; los gusanos se llega a la etapa de L4 en aproximadamente 40 h.
3. Lave los gusanos L4 de las placas de Petri de 90 mm con medio de K en un tubo cónico estéril de 50 mL. Ajustar la concentración de gusanos a ~ 40 animales por 100 μl de medio de K bajo un estereomicroscopio. Añadir 50 μl (~ 20 gusanos) en cada pocillo de la placa de 384 pozos. Estos gusanos sincronizados (etapa L4) están listos para el siguiente tratamiento por sustancias químicas.

3. química tratamiento y captura de vídeo

Nota: En una placa de 384 pozos, gusanos (50 μL en cada pocillo) tratan a seis a siete dosis de una sustancia química individual (tabla 1). Preparar ocho pozos paralelos, cada uno con 50 μl de la 2 x solución química para cada dosis (ocho pozos están llenos de la misma química y la misma concentración, tabla 2). Todos los vídeos son recogidos utilizando una cámara digital conectada a un microscopio invertido (Tabla de materiales). El experimento de tratamiento químico dura 24 h. No agregue alimentos bacteriana a cada pocillo durante el experimento de tratamiento químico de 24 h.

1. Antes de añadir los productos químicos, coloque la placa de 384 pocillos con los gusanos sincronizados en la etapa automática y grabar vídeos de cada pozo con el procedimiento de adquisición programada (7 cuadros por segundo para 2 s; tarda ~ 25 min para escanear cada placa).
2. Añada 50 μl de la 2 x acción química preparada según la sección 1 para cada pozo (tabla 2). Ajustar el tiempo como el punto de 0 h.
3. Incubar la placa de 384 pozos a 20 ° C y agitar a 80 rpm en un agitador incubador.
4. Retire la placa de la incubadora y transferirlo a una etapa automática. Tomar videos de cada pocillo de la placa entera, a las 12 h y a las 24 h, para comprobar los fenotipos de los gusanos para cada tratamiento químico específico en medio de K. Aproximadamente 25 minutos son necesarios para la pantalla de una placa.

4. procesamiento de vídeo del experimento

Nota: Un programa de video experimental y procesamiento de imágenes fue escrito y empaquetado. Se puede descargar libremente (véase Tabla de materiales). El video experimental se almacena en forma de una secuencia de marcos de imagen, y la secuencia de fotogramas de cada vídeo se almacena en un directorio específico. El programa puede reconocer gusanos y cuantificar fenotipos automáticamente.

1. En la interfaz gráfica de usuario (GUI, figura 1), agregue los parámetros, tales como el directorio de secuencia de marco, el directorio de salida, el parámetro de tamaño de gusano y el parámetro de umbral de movimiento. Haga clic en el botón analizar para procesar las imágenes experimentales.
   1. Haga clic en el botón seleccionar para elegir el directorio de imágenes de origen.
   2. Añada el directorio de resultado medio en la interfaz.
      Nota: Los resultados mediados incluyen las imágenes segmentadas. Estos resultados mediados son útiles para la observación visual de las imágenes procesadas.
   3. Añada el directorio de resultado final en la interfaz.
   4. Añadir el parámetro de tamaño medio gusano en el cuadro de texto Tamaño de gusano en la interfaz.
      Nota: El parámetro de tamaño utilizado en los experimentos es 2.000.
   5. Agregar el umbral de proporción movido en la interfaz.
      Nota: La proporción utilizada en los experimentos es 0,93.
   6. Haga clic en el botón analizar para comenzar el proceso de imagen. Haga clic en el botón de Reset para borrar los parámetros añadidos.
      Nota: Hay 33 características definidas y cuantificadas para gusanos. Todos los fenotipos definidos están ordenados por categorías (enumeradas en la tabla 3). Estas características se pueden cuantificar de imágenes experimentales. Una comparación cuantitativa entre diferentes productos químicos, que tienen diferentes efectos secundarios, puede hacerse mediante la comparación de estas características.

Resultados

Hemos probado los fenotipos de gusanos expuestos a diferentes concentraciones de más de 10 productos químicos¹². En la prueba, se cuantificaron 33 características distintas para cada producto químico compuesto en tres puntos del tiempo (0 h, 12 h y 24 h). Anteriormente, una comparación entre un manual y un análisis automático de un ensayo de vida útil se realizó^11,12. En este ensayo, se encontró q...

Discusión

Las ventajas de la C. elegans han conducido a su creciente uso en toxicología⁹, para el estudio de mecanismos y métodos de cribado de alto rendimiento. Un papel creciente para C. elegans en complementar otros sistemas modelo en la investigación toxicológica ha sido notable en los últimos años, especialmente para la evaluación rápida de la toxicidad de nuevos productos químicos. Este artículo proporciona un nuevo ensayo de cribado de alto rendimiento, cuantitativa del gu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Sigma-Aldrich	59300
384-well plates	Throme	142761
Agar	Bacto	214010
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	PHL80892
Bleach buffer			0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	21074
CCD camera	Zeiss	AxioCam HRm	Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Copper(II) sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Ethanol	Sigma-Aldrich	24105
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
K-Medium			3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth			10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	63140
NGM Plate			3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone	Bacto	211677
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	60130
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	795488
PPB buffer			35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker	ZHICHENG	ZWY-200D
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	71382
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich	s7920
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	239305
The link of program			https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625
Zeiss automatic microscope	Zeiss	AXIO Observer.Z1	Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera