一种可靠、可重复的可重复的大鼠部分股骨缺陷模型

摘要

在体内, 哺乳动物的临界骨缺损模型是必不可少的研究愈合机制和骨科治疗。在这里, 我们介绍了一种方案, 以创建可重复的, 节段, 股骨缺损在大鼠稳定使用外固定。

摘要

骨科研究在很大程度上依赖于动物模型来研究骨愈合的机制在体内, 以及研究新的治疗技术。临界大小的节段缺陷是具有挑战性的治疗临床, 研究工作可以受益于一个可靠的, 动态的小动物模型的节段股骨缺陷。在本研究中, 我们提出了一个优化的手术方案, 以一致和重现5毫米临界骨干缺损在大鼠股骨稳定与外部固定器。采用定制夹具对4根基什内尔电线进行了骨固定器切除术, 并采用合适的外固定装置进行了稳定。一个振荡骨锯被用来制造缺陷。单独植入胶原蛋白海绵或浸泡在 rhBMP-2 中的胶原蛋白海绵, 并使用 x 光片在12周内监测骨愈合情况。12周后, 对大鼠进行了牺牲, 并对切除和治疗股骨进行了组织学分析。骨缺损只含有胶原蛋白海绵导致不愈合, 而 Rbmp-2 治疗导致骨膜粘液和新的骨重塑形成。植入后动物恢复良好, 外固定成功地稳定了股骨缺损, 持续12周。这种简化的手术模式可以很容易地应用于研究骨愈合和测试新的骨科生物材料和再生疗法在体内。

引言

骨科创伤手术的重点是治疗广泛的复杂骨折。由于周围肌肉和骨膜再生能力下降以及局部血管生成失败, 临床上证明很难治疗严重的过敏性骨缺损^.现代治疗技术包括骨移植、延迟骨 (masquelet) 的手术固定、^骨移植、骨移植、融合或截肢^2,3^,4。在大多数患者谁具有流动功能保存后, 他们的创伤, 功能良好的远端肢体, 肢体救助显然是一个更好的治疗方案⁵。这些抢救治疗往往需要在一个漫长的疗程分阶段的手术干预。一些作者认为, 外固定优于内固定为这些应用相比, 由于减少组织损伤在体内植入表面积, 并增加术后可调性固定器⁶。然而, 一项前瞻性的随机对照试验目前正在进行中, 以帮助澄清这种争议的内固定对外外固定严重开放骨折的胫骨7。不幸的是, 无论选择哪种治疗方法, 显著的并发症和故障率持续 8,⁹。对于节段性骨丢失, 外科医生必须面对构成重大挑战的节段性过敏性缺陷。节段缺损的矫正必须最大限度地稳定骨骼, 同时增强成骨过程^10,11。

由于关键大小的节段缺陷的临床重要性, 但体积较低, 有效、可重复的动物模型是必要的, 以使研究团队能够推进治疗技术并最终改善临床结果。研究人员需要研究哺乳动物动物模型中的体内生理愈合机制。虽然这种外固定模型已经存在^{12、13、14、15, 但}我们希望为未经治疗的动物提供更可靠的不结合方法, 通过选择价格合理的固定器材料, 并概述了一个简单的手术协议, 便于应用于未来的研究。该方案的主要目的是建立一个可靠和可重复的模型, 为大鼠的关键过敏性缺损。通过评估大鼠股骨在12周内的稳定性和骨愈合情况, 对该手术进行了评估。次要目标包括: 使负担得起的模式尽可能具有成本效益, 简化手术方法和稳定, 并确保对动物的道德关怀。作者和研究小组对一系列不同的生物材料和潜在的再生疗法进行了初步实验, 以改善这种节段缺陷的愈合。

研究方案

本研究中使用的老鼠根据《动物安乐死 AVMA 准则: 2013年第16版》^接受日常护理。威斯康星大学麦迪逊分校动物护理和使用机构委员会在项目开始前对这一实验方案进行了评估并批准。

1. 动物

1. 使用超繁殖的 Sprague-Dawley 雄性大鼠, 重约350克。

2. 骨形态发生蛋白-2 (Rhmbp-2) 浸渍海绵支架的制备

注: 支架的准备工作应在植入股骨之前进行 (参见步骤 6.14)。

1. 按照制造商的说明使用已建立的 rhBMP-2 骨移植试剂盒, 其中含有胶原蛋白海绵, 冻干 rhBMP-2, 和无菌水重建¹⁷。维持无菌, 用无菌水将 rhBMP-2 重组为 1.5 mgml 浓度。
2. 使用无菌剪刀和无菌尺子, 修剪 rhBMP-2 浸泡胶原蛋白海绵, 以重塑适合5毫米 x 3 毫米 x 3 毫米的缺陷。
3. 使用注射器, 将 rhBMP-2 溶液均匀地分布在胶原蛋白海绵上, 使其被吸收。

3. 定制外固定装置的准备

注: 有关尺寸的更完整列表, 请参见图 1 a。

1. 使用拼图或其他适当的工具将铝板库存 (6061 型、0.088 "厚度) 切割成两片 (1.4" x 6 ")。
2. 在铣床中安装一块, 并使用半°90°硬质合金钻床, 纵向切割四个 "V" 槽 (0.035 "深)。让另一块没有伤口。
3. 从两个部分中剪切宽度0.3 英寸的单个板 (图 1 b)。测量和钻孔4-40 螺纹的孔。带有 "V" 槽的轻触板, 带有4-40 螺纹。在没有凹槽的情况下钻板, 以进行 #4 的螺钉体钻。
4. 将两个碎片砂到圆角并减轻重量 (图 1c)。
5. 用4-40、18-8 不锈钢纽扣头盖螺钉 (0.25 ") 将件拧紧, 使凹槽与平板齐平 (图 1d)

4. 麻醉程序和镇痛

1. 将大鼠放置在诱导室, 用4% 异氟醚给予4 lo 2/min, 从而产生麻醉。
   注意: 研究人员必须避免吸入麻醉气体, 并在实验室保持适当的罩和通风。
2. 在大鼠失去纠正反射后, 将大鼠从腔中取出, 贴上鼻锥, 并在通过鼻子进行麻醉的维持剂量下放置 (_{o 2}分娩率为 2-3 l/min 和0.8% 异氟醚)。
3. 将大鼠放在加热垫或加热灯下, 以防止体温过低。
4. 通过捏脚趾或测试眼睑反射来确认足够的麻醉深度。
5. 在眼睛上涂上润滑, 以防止角膜干燥。
6. 在远离手术部位的大鼠树干上注射缓释丁丙诺非 (1 mg/kg), 以便在手术后3天内提供镇痛。

5. 无菌制剂和抗生素预防

1. 后腿周围的沙口区域使用第13肋骨 、脚、背中线和腹侧中线作为边缘。
2. 用不育的 2 x 2 纱布浸泡10% 的聚维酮碘, 然后是70% 的 EtOH (每次 4次, 交替), 擦洗剃光面积。
3. 在手术中注射头孢唑啉 (20 mg/kg)。
4. 术后7天在饮用水中服用恩罗氟沙星 (0.25 mg/ml), 以继续保护抗生素。
5. 在研究期间, 将老鼠放在药用饲料 (如 Uniprim) 上, 以防止针道感染。
6. 术后 3天, 每天一次在皮肤针界面上涂一次双抗生素软膏。
   注: 避免任何外部固定销或夹紧松动, 这可能有助于感染的发展。

6. 手术程序

注: 协同努力, 以保持无菌领域和工作空间, 并遵循无菌技术在整个情况下。

1. 延长剃须腿通过无菌, 明确粘悬垂和覆盖手术长凳在无菌毛巾, 以创建一个无菌的领域。
2. 将股骨触诊, 并使用 #15 刀片通过从膝盖骨延伸到股骨近端较大的转子的皮肤形成前外侧切口。
3. 沿着肌间隔小心地切割外侧腿筋膜, 将股四头肌的侧肌肌肉向后部与腿筋分开, 直到股骨外侧部外露。保留绑架者的臀部肌腱插入大转子。
4. 进行仔细的, 无菌的周向软组织解剖, 并暴露股骨在其从侧面表面开始的中骨干。要做到这一点, 使用 #15 刀片, 通过保持刀片与骨骼表面轮廓平行, 轻轻地将肌肉从基础骨上割开。使用骨膜电梯, 以解除肌肉从暴露的骨头, 因为它被解剖, 并继续围绕股骨干, 直到7-10 毫米的中央骨干已清除软组织的所有方面, 准备骨切除术。
   注: 避免损伤股骨内侧神经血管束。
5. 插入四个 1.0 mm Kirschner (k) 线: 2个近端和2个远端垂直于股骨侧, 直接向内侧。确保所有引脚都与两个顶点 (双形) 接合, 以获得足够的稳定性 (图 2a)。
6. 首先从最远端的引脚开始, 就在侧侧上皮的水平上。将夹具冲洗到股骨远端侧, 并插入1.0 螺纹尖端 k 线。
7. 保持夹具在骨头上的位置, 根据夹具孔确定最近端的别针将从哪里进入骨头。一旦确定了位置, 仔细切割平行于臀部肌腱的纤维, 需要在组织中创建一个小的缝隙, 近端引脚通过, 从而最大限度地减少医源性损伤肌腱。在此间隙中钻出 1.0 mm 的非螺纹 k 线, 再次确保引脚与两个顶点 (图 2b)。
8. 保持夹具与骨骼接触的位置, 并钻两条 1.0 mm 的螺纹 k 线, 一条在未来缺陷部位的两侧。确保引脚与两个顶点连接 (图 2c)。
9. 将外部固定器杆置于皮肤上方1厘米处, 拧紧螺丝, 将棒锁定到位。夹紧多余的引脚长度 (图 2d)。
10. 准备骨切除术 (缺陷的产生), 在股骨前部和后部周围放置一个小的弯曲牵引器, 以保护周围的软组织、肌肉和神经维管束。利用一个 ~ 5 毫米矢状振荡锯片, 非常谨慎地通过中骨干造成一个5毫米节段缺陷。用锯子施加光, 甚至压力, 以避免不必要的断裂 (图 2e)。
11. 根据需要应用少量的灌溉 (室温0.9% 无菌的生理盐水 (NS)), 同时造成缺陷, 以避免骨骼热坏死。
12. 创建缺陷后, 使用 ns 的10毫升冲洗伤口。
13. 将0.25% 的布比卡因的 0.1 ml 与肾上腺素 (1:2000) 作为镇痛药和血管收缩剂对伤口进行处理。
14. 将支架 (5 毫米 x3 毫米 x 3 毫米) 插入胶原蛋白海绵或 rhBMP-2 浸泡海绵 (从步骤2开始) 插入缺陷中。每个脚手架都应适当调整大小, 以跨越缺陷的长度和体积, 帮助海绵保持在适当的位置。
    注: 此时, 如果进行生物发光成像, 则可以按照下面第 7.1-7.3 中的说明制备和注射 mRNA 复合物。
15. 关闭肌肉平面使用简单的中断模式与4-0 可吸收的缝合。关闭皮肤层使用一个运行的线下图案与4-0 可吸收的缝合和皮肤胶水, 以关闭突出的针脚周围的缝隙。
16. 从鼻锥中取出大鼠, 留在加热垫上, 并持续监测, 直到大鼠能够持续保持直立的姿势。此时, 放置在一个干净的笼子里恢复。

7. 复合 mRNA 的制备和生物发光成像

注: 在发光成像前一天的手术中, 应进行与 mRNA 复合物的转染。在处理 mRNA 时使用无菌技术。

1. 将 Gesia 荧光素酶 (库存浓度为 1μμμl) 的 mRNA 编码与脂质转染剂的30Μl 混合。
2. 允许 mrna-脂质复合物在室温下孵育至少 5分钟, 形成。脂质转染剂可使 mRNA 分子致密, 稳定分子, 提高转染效率。
   注: 如果不立即使用复合物, 将它们存放在冰中最多1小时。
3. 使用装有过滤吸头的20Μl 移液器, 分别将一半的 mRNA 复合物注入缺陷的远端和近端。
4. 第二天, 在成像前 3分钟, 使用吸入异氟醚麻醉大鼠, 如步骤4.1 中所述。
5. 将大鼠放置在体内成像室, 该室配备了鼻锥, 提供维持异氟醚 (0.8% 异氟醚, o2输送率为 2-3 lmmin)。
6. 在缺陷附近以 4 mg kg 体重的剂量在盐水中重新悬浮在肠内嗪中。
7. 根据制造商的说明¹⁸, 使用体内成像系统 (ivis) 获取生物发光图像。

8. 成像协议

1. 在校准普通射线胶片机后, x 射线系统¹⁹, 如上文所述 (步骤 4.1), 用吸入异氟醚麻醉大鼠, 并将大鼠放置在鼻锥中, 吸入异氟醚 (0.8% 异氟醚, o2)前股骨 (AP) 影像学的分娩率为 2-3 l2. min。
   1. 当大鼠在胸骨收缩时, 推进手术后肢向前, 在臀部弯曲, 并扼杀关节。将窒息关节弯曲至约90°。把爪子的足底侧贴在下面, 靠近身体壁。将胫骨向前放置在股骨上, 以消除骨叠加的可能性。为了提供轻微的髋关节绑架, 在腹股沟区域放置一块半透明的海绵 (约15毫米厚)。然后得到股骨的前后 (颅骨尾) 图像。
2. 手术后立即重复此 AP 股骨影像学视图, 4周, 12周。使用胶带和纱布, 以适当地定位动物的四肢, 以获得高质量和一致的成像。
3. 从鼻锥中取出大鼠, 并持续监测, 直到大鼠能够持续保持直立的姿势。然后, 回到笼子里。

9. 组织学程序

1. 根据 AVMA 道德标准¹⁶, 在吸入二氧化碳_的室内对大鼠进行安乐死。
2. 安乐死后, 刮掉后肢, 从手术四肢取下皮肤, 并在臀部不清楚股骨。小心地从手术股骨中取出所有软组织 (包括所有肌肉、肌腱和韧带)。只留下一层薄薄的肌肉包围缺陷部位, 以保护愈合区域在解剖过程中免受意外损伤。
3. 将股骨放入10% 中性缓冲福尔马林在室温下 3-4天, 以便进行固定。保持一个15:1 福尔拉林与组织体积的比率。在固定过程的中途改变一次解决方案。
4. 将股骨在15% 的乙二胺四乙酸 (EDTA) pH 6.5 溶液中进行解码, 为期3-4周。收集串行 x 光片, 以确定脱钙端点。
5. 纵向双侧双直股骨, 在矢状中面从前到后部被割伤。提交组织的标准石蜡包埋和血红素和 eosin (H & E) 染色。
6. 将 H & E 幻灯片发送给病理学家进行组织学评估。

结果

在一名助理的帮助下, 一名外科医生在大约一小时内进行了手术。手术优化后, 术中和术后并发症大大减少, 使用夹具装置可确保大小一致 (5 x 3 x 3 mm) 和股骨缺损定位。从麻醉中恢复后, 大鼠立即处于流动状态, 似乎没有任何改变的行为模式;他们的步态并不像过敏, 他们似乎也没有被外部固定器打扰。

选择非螺纹 k 线的最近端引...

讨论

骨科损伤的小动物模型, 如完整的骨折, 使研究, 探索成骨的机制^{和评估生物材料的}治疗潜力20。本研究引入了由自定义外部固定器稳定的大鼠节段缺陷模型, 实验室和生物医学工程团队可以很容易地复制该模型, 以进一步研究承重骨合成骨修复。

此前在大鼠模型中使用临界大小缺陷的研究通常依赖于 21^、22、

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sterile Saline	Baxter	2F7124	Used for irrigating wound and rehydration
10% Iodine/Povidone	Carefusion	1215016	Used to prep skin
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	89370094	Used as fixative
1mm non-threaded kirschner wire	DePuy Synthes	VW1003.15	Sterilized, used for the most proximal pin
1mm threaded kirschner wire	DePuy Synthes	VW1005.15	Sterilized, used for the 3 most distal pin slots
2x2 gauze	Covidien	4006130	Sterilized, used to prep skin and absorb blood
4-0 Vicryl Suture	Ethicon	4015304	Used to close muscle and skin layers
4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws	Generic		External fixator assembly
4200 Cordless Driver	Stryker	OR-S-4200	Used to drill kirschner wires
4x4 gauze	Covidien	1219158	Sterilized, used to absorb blood
70 % Ethanol			Used to prep skin
Baytril	Bayer Healthcare LLC, Animal health division	312.10010.3	Added to water as an antibiotic
Cefazolin	Hikma Pharmaceuticals	8917156	Pre-op antibiotic
CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU)	TriLink Biotechnologies	L-7205	Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use
Coelenterazine native	NanoLight Technology	303	Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo
Double antibiotic ointment	Johnson & Johnson consumer Inc	8975432	Applied to pin sites post-op as wound care
Dual Cut Microblade	Stryker	5400-003-410	Used to create 5mm defect in femur
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Fisher	BP120-500	Used to decalcify bone to prep for histology
Extended Release Buprenorphine	ZooPharm		Used as 3 day pain relief
Fenestrated drapes	3M	1204025	Used to establish sterile field
Handpiece cord for TPS	Stryker	OR-S-5100-4N	Used to create 5mm defect in femur
Heating pad	K&H Pet Products	121239	Rat body temperature maintenance
Hexagonal head screwdriver	Wiha	263/1/16 " X 50	External fixator tightening
Induction chamber	Generic		Anesthesia for rats
Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2	Medtronic	7510200	Clinically relevant treatment used as positive control
Isoflurane	Clipper	10250	Anesthesia for rats
IVIS	Perkin Elmer	124262	Bioluminescence imaging modality
Jig	Custom		Used to place bicortical pins
Lipofectamine MessengerMAX	Fisher Scientific	LMRNA003	mRNA complexing agent that enables mRNA delivery
Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000))	APP Pharmaceuticals, LLC	NDC 63323-468-37	Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction
Sterile water	Hospira	8904653	Used as solvent for cefazolin powder
Titanium external fixator plates	Custom		Prepared in house with scrap titanium and milling machine
Total Performance System (TPS) Console	Stryker	OR-S-5100-1	Used to create 5mm defect in femur
TPS MicroSaggital Saw	Stryker	OR-S-5100-34	Used to create 5mm defect in femur
Ultrafocus Faxitron with DXA	Faxitron		High resolution radiographic imaging modality
Uniprim rat diet	Envigo	TD.06596	Medicated rat diet
Universal Handswitch for TPS	Stryker	OR-S-5100-9	Used to create 5mm defect in femur
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469	Skin closure