Надежных и воспроизводимых критического размера сегментарный бедренной дефект модель крыс, стабилизировалось с пользовательской внешних фиксаторов

Резюме

В естественных условиях млекопитающих модели критического размера костных дефектов имеют важное значение для исследователей, изучая механизмы заживления и ортопедической терапии. Здесь мы представляем собой протокол для создания воспроизводимых, сегментарный, бедренной дефектов в крыс, стабилизировалась, с использованием внешней фиксации.

Аннотация

Ортопедические исследования опирается на животных моделей для изучения механизмов кости Исцеление в естественных условиях , а также исследовать новые методы лечения. Критического размера сегментарный дефекты являются сложными для лечения клинически, и исследовательские усилия могли бы извлечь пользу из надежной, амбулаторный малых животных модели сегментарный бедренной дефекта. В этом исследовании мы представляем оптимизированные хирургический протокол для создания последовательного и воспроизводимые критический дефект диафизарных 5 мм в крыса бедра, стабилизировалось с внешних фиксаторов. Диафизарных ostectomy была выполнена с использованием пользовательских джиг поставить 4 Kirschner провода bicortically, которые были стабилизированы с устройством адаптированы внешних фиксаторов. Осциллирующий пилой был использован для создания дефекта. Коллагеновая губка одиночку или коллагена губкой, смоченной в rhBMP-2 был имплантирован в дефект, и исцеление кости контролируется более 12 недель, используя рентгенограммы. После 12 недель крысы были принесены в жертву, и гистологический анализ проводился на подакцизные управления и лечить бедра. Дефектов костей, содержащие только коллагеновая губка привело к не союз, в то время как лечение rhBMP-2 принесли формирования периостальная черствым и новые костного ремоделирования. Также восстановленные после имплантации и внешней фиксации животных оказалась успешной в стабилизации бедренной дефектов более 12 недель. Этот обтекаемый хирургические модель может применяться легко изучать кости Исцеление и тестировать новые ортопедические биоматериалов и регенеративной терапии в естественных условиях.

Введение

Ортопедической травматологии фокусируется на лечении широкого спектра сложных переломов. Критические диафизарных сегментарный кость, которую дефекты доказали трудным для лечения клинически обусловлено снижение регенерационной способности окружающие мышцы и надкостницы, а также отказ от локализованных ангиогенеза¹. Современные методы включают постановляющей части фиксации с костной пластикой, задержкой подсадка кости (Masquelet), кости транспорта, фьюжн или ампутация^2,3,4. У большинства пациентов, которые имеют амбулаторного функции сохранены после их травмы, с хорошо функционирующей Дистальная конечностей конечности бабло, несомненно, лучшее лечение вариант⁵. Эти аварийные процедуры часто требуют поэтапного хирургических вмешательств течение длительного лечения. Некоторые авторы полагают, что выше по сравнению с внутренней фиксации для этих приложений из-за повреждения снижение тканей во время имплантации, уменьшилось имплантированных площадь поверхности и увеличение послеоперационной приспособляемость этой внешней фиксации Фиксатор пластинчатый⁶. Однако перспективных рандомизированное контролируемое испытание ведется в настоящее время чтобы помочь прояснить этот спор внутренней против внешней фиксации в тяжелой открытых переломов голени⁷. К сожалению с либо лечения выбран, значительных осложнений и провал ставки сохраняются^8,9. С либо метод лечения, что касается потери сегментарный кости хирург должны бороться с сегментарный диафизарных дефекты, которые представляют серьезные проблемы. Исправления сегментарный дефектов необходимо максимизировать кости стабилизации и одновременно повысить Остеогенные процесс^10,11.

Благодаря клиническое значение, но ниже объема, критического размера диафизарных сегментарный дефектов эффективной, воспроизводимые животной модели необходимо, чтобы исследовательские группы для продвижения методов лечения и в конечном итоге улучшить клинические исходы. Исследователи должны учиться в vivo физиологическое заживление механизмов в млекопитающих животных модели. Хотя такие модели внешней фиксации уже существуют^12,13,14,15, мы надеемся обеспечить более надежный метод для профсоюзов, в необработанной животных, уменьшение расходов путем выбора материалы доступные фиксатором и наброски прямой хирургический протокол для легко приложения для будущих исследований. Основная цель настоящего Протокола заключается в создание надежных и воспроизводимых модель критический дефект диафизарных крыс. Процедура оценивалась путем оценки стабилизации и кости Исцеление в крыса бедра свыше 12 недель. Вторичные цели включали: сделать доступным модель стоимости для максимально эффективной, упрощение хирургический подход и стабилизации и обеспечение этического заботу о животных. Авторы и исследовательская группа провела предварительные эксперименты с широкий спектр разных биоматериалов и потенциальных регенеративной терапии для улучшения исцеление в этой сегментарный дефекта.

протокол

Крысы, используемые в данном исследовании получил ежедневного ухода в соответствии с руководящими принципами AVMA для эвтаназии животных: 2013 издания¹⁶. Институциональный уход животных использования в университете Висконсин-Мэдисон оцениваются и Комитет одобрил этот экспериментальный протокол, до начала проекта.

1. Животные

1. Используйте беспородных Sprague-Dawley самцах массой около 350 г.

2. Подготовка костных морфогенетических белков-2 (rhBMP-2) смоченной губкой подмости

Примечание: Подготовка леса должно происходить только перед имплантацией в бедренной кости (см. шаг 6.14).

1. Следуйте инструкциям производителя для использования комплекта трансплантата установленных кости rhBMP-2, содержащие коллаген Губка, лиофилизированные rhBMP-2 и стерильной водой для растворения¹⁷. Сохранения стерильности, воссоздания rhBMP-2 с стерильной воды до концентрации 1,5 мг/мл.
2. С помощью стерильными ножницами и стерильные правителя, обрежьте rhBMP-2 пропитанной коллагеновая губка перестроить соответствовать 5 мм x 3 мм x 3 мм дефекта.
3. С помощью шприца, равномерное распределение раствора rhBMP-2 над коллагеновая губка таким образом, чтобы она поглощается.

3. Подготовка пользовательских внешней фиксации устройства

Примечание: Смотрите Рисунок 1A для более полного перечня размеры.

1. Вырезать алюминия тонколистового (тип 6061, 0,088" толщина) до двух штук (1.4" x 6") с использованием jigsaw или другой подходящий инструмент.
2. Смонтировать один кусок в фрезерный станок и, используя мельница сверло карбид 90°-точка 1/8", пазы четыре «V» (видимая область 0,035" по глубокой) вдоль пополам. Оставьте другой кусок, без сокращений.
3. Вырезать отдельные пластины шириной 0,3" из двух частей (рис. 1B). Измерить и Просверлите отверстия для винтов для потока 4-40. Нажмите плита с пазами «V» с резьбой 4-40. Просверлите пластину без канавки для дрели #4 винт тела.
4. Песок оба произведения Закруглить углы и уменьшить вес (рис. 1 c).
5. Винт куски вместе с 4-40, 18-8 нержавеющей стали кнопку головкой (0,25"), так что пазов заподлицо с простой пластины (рис. 1 d)

4. цистит процедуры и обезболивание

1. Побудить анестезии, поместив крыса в камере индукции, обеспечивая 4 L O₂мин. с 4% изофлюрановая.
   Предупреждение: Исследовательский персонал должны избегать ингаляционной анестезии газов и поддержания надлежащего Худ и вентиляции в лаборатории.
2. Удалить крысы из камеры после того, как крыса теряет восстанавливающих рефлекс, приложите носовой конус и место в дозе поддержание анестезии через нос (O₂ скорость доставки до 2-3 Л/мин и 0,8% изофлюрановая).
3. Место крысы на грелку или под потепления свет для предотвращения переохлаждения.
4. Подтвердите адекватной глубины анестезии, защемления ног или тестирования глазной рефлекс.
5. Применение смазки для глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
6. Доставить подкожно расширенного выпуска бупренорфин (1 мг/кг) на ствол/спинку крысы, далеко от хирургической сайта, чтобы обеспечить анальгезии на срок до 3 дней после операции.

5. асептический подготовка и антибактериальной профилактики

1. Бритье вокруг hindleg, используя 13^го ребра, ноги, спинной срединной и брюшной срединной линии в качестве поля.
2. Скраб брился области с помощью стерильные марлевые 2 x 2, пропитанной с 10% повидон йод следуют 70% EtOH (4 раза каждый, чередуя).
3. Администрировать внутримышечной инъекции цефазолина (20 мг/кг), в постановляющей части четырехглавой мышцы.
4. Администрировать Энрофлоксацин (0,25 мг/мл) в питьевой воде для 7 дней после операции для продолжения антибактериальной защиты.
5. Место крыс на лечебные корма (например, Uniprim) в течение всего исследования для предотвращения инфекции тракта PIN-код.
6. Обратиться двойной мазь с антибиотиком кожи контактный интерфейс раз ежедневно в течение 3 дней после операции.
   Примечание: Во избежание любой внешней фиксации ПИН или зажим, разрыхление, которая может способствовать развитию инфекции.

6. хирургическая процедура

Примечание: Сделать согласованные усилия, чтобы поддерживать стерильные области и область и следовать стерильных во всем объеме дела.

1. Расширить бритая ноги через перфорированную, ясно липкой Пелерина и покрытия хирургических скамейке в стерильных полотенца для создания поля, стерильный.
2. Ощупывайте бедренной кости и использовать #15 лезвие для создания передне-боковой разрез через кожу, простирающейся от надколенника к большей вертела в проксимального отдела бедренной кости.
3. Тщательно надрезать поперечной ножки фасции вдоль межмышечной перегородки для разделения lateralis мышц мышц четырехглавой кпереди от бедра кзади до боковой бедренной подвергается. Сохраните похититель ягодичной сухожилие вставки на более вертела.
4. Выполните тщательного, рассечение продольных мягких тканей атравматической и разоблачить бедренной кости в его середине диафиза, начиная на боковой поверхности. Для этого используйте лезвие #15 аккуратно вырезать мышцы от основной кости, сохраняя лезвие параллельное против контура поверхности кости. Используйте периостальная Лифт поднимать мышцы от подвергаются кости, как она рассекается и перейти вокруг оси бедра до 7-10 мм Центральной диафиза была очищена от мягких тканей со всех сторон для подготовки к ostectomy.
   Примечание: Во избежание повреждения медиального бедренной кости сосудисто-нервного пучка.
5. Вставьте четыре провода 1,0 мм Киршнер (k): 2 проксимальных и дистальных в бедра перпендикулярно боковой бедренной кости, 2 направлен прямо бокового к медиальному. Убедитесь, что все контакты участвовать оба коре (bicortical) для надлежащей стабильности (рис. 2A).
6. Начните с дистальной большинство ПИН во-первых, просто на уровне боковой надмыщелок. Место джиг заподлицо боковыми дистальной бедренной кости и k-проволоку 1.0 резьбовой наконечник.
7. Сохранение позиции джиг на кости, определите, где наиболее проксимальный контакт войдет кости, основанный на джиг отверстия. После того, как определяется позиция, тщательно надрезать параллельно волокна ягодичной сухожилия, необходимые для создания небольшой разрыв в ткани для проксимальной контактный пройти через, таким образом минимизируя ятрогенные повреждения сухожилия. Дрель 1,0 мм беспотоковая k провод в этот разрыв, опять таки гарантируя, что ПИН привлекает обе коре (рис. 2B).
8. Сохранять позицию джиг в контакте с костью и просверлить два k-1,0 мм резьбовые провода, один на обе стороны дефекта будущего сайта. Убедитесь, что контакты участвовать оба коре (рис. 2 c).
9. Место внешних фиксаторов бар уровня 1 см выше кожи и плотно, винт блокировки панели на месте. Обрезать излишки ПИН длины (Рисунок 2D).
10. Подготовиться ostectomy (дефект создание), поместив небольшой, изогнутые втягивающего вокруг передней и задней бедренной кости для защиты окружающих мягких тканей, мышц и сосудисто-нервного пучка. Используя ~ 5 мм сагиттальной осциллирующие пилы, очень осторожно создать сегментарный дефект 5 мм через середину диафиза. Примените, свет, даже давление с пилой, чтобы избежать ненужных перелом (Рисунок 2E).
11. Примените небольшое количество орошения (комнатной температуре 0.9% стерильный физиологический (NS)) по мере необходимости при создании дефекта во избежание теплового некроз кости.
12. Промойте рану, используя 10 мл NS после создания дефекта.
13. Администрировать 0,1 мл 0,25% бупивакаин с эпинефрина (1: 200, 000) в рану как болеутоляющее и сосудосуживающие.
14. Вставить леску (5 x 3 x 3 мм) коллагеновая губка или rhBMP-2 смоченной губкой (из шага 2) в дефект. Каждый леску следует надлежащим образом размера занимаемых длину и объем дефекта, помогая Губка оставаться в положении.
    Примечание: на данный момент, мРНК комплексов может быть подготовлен и вводят изложенные в шагах 7.1-7.3 ниже при выполнении визуализации биолюминесценции.
15. Закройте плоскости мышцы с помощью простого Прерванный шаблона с рассасывающиеся шовные 4-0. Закройте слой кожи с помощью шаблона работает subcuticular с 4-0 рассасывающиеся шовные и кожи клей, чтобы закрыть пробелы вокруг выступающие штифты.
16. Удаление крысы из носовой конус, оставаясь на грелке и мониторинга непрерывно до тех пор, пока крыса способна постоянно сохранять вертикальное положение. На данный момент место в чистой клетке для восстановления.

7. Подготовка complexed мРНК и биолюминесценции изображений

Примечание: Transfection с мРНК комплексы должны выполняться во время операции за 1 день до изображений свечения. Используйте стерильные приемы при обработке мРНК.

1. Смесь 10 мкл мРНК кодировки для Gaussia Люцифераза (фондовых концентрация составляет 1 мкг/мкл) с 30 мкл липидный transfecting агента.
2. Разрешите для мРНК липидных комплексов к форме, инкубации по крайней мере 5 минут при комнатной температуре. Липидный transfecting агент будет конденсируются молекулы мРНК, их стабилизации и повышения эффективности transfection.
   Примечание: Если сразу не используются комплексы, храните их в ice для максимум 1 час.
3. С помощью 20 мкл пипетки с отфильтрованной советы, придать половина объема мРНК комплексов в проксимальном и дистальном концы дефекта, соответственно.
4. Следующий день, 3 мин до изображений, анестезировать крыса, используя вдыхаемого изофлюрановая как описано в шаге 4.1.
5. Расположите крыса в в естественных условиях imaging камеры оснащены носовой конус, обеспечивая техническое обслуживание изофлюрановая (0,8% изофлюрановая, скорость доставки₂ O 2-3 Л/мин).
6. Придать целентеразин высокомобильна в физиологического раствора в дозе 4 мг/кг веса тела в непосредственной близости от дефекта.
7. Приобрести биолюминесценции изображения с в vivo imaging системы (ИВИС) согласно инструкциям производителя¹⁸.

8. изображений протокол

1. После калибровки равнина радиографический машина, рентгеновские системы¹⁹, анестезировать крыс с помощью вдыхаемого изофлюрановая как описано выше (см. Шаг 4.1) и положение крыса в носовой конус с вдыхаемого изофлюрановая (0,8% изофлюрановая, O₂ скорость доставки 2-3 Л/мин) на рентгенограмме бедренной переднезаднем (AP).
   1. В то время как крыса в грудной recumbency, заранее хирургические задних конечностей вперед, сгибание на бедра и задушить сустава. Flex коленному суставу до приблизительно 90°. Лента с лапой подошвенной стороны вниз, недалеко от стенки тела. Положение голени вперед от бедра, чтобы исключить возможность наложения кости. Предоставлять небольшие похищения бедра, место полупрозрачный губкой (примерно 15 мм толщиной) в районе паха. Затем получите изображение (черепно хвостового) передней задней бедренной кости.
2. Повторите это мнение радиографический бедренной AP, сразу же после операции, 4 недели, а 12 недель. Использовать ленту и марля надлежащим образом позиционировать конечности животного для качества и последовательного изображений.
3. Удаление крысы из носовой конус и мониторинга непрерывно до тех пор, пока крыса способна постоянно сохранять вертикальное положение. Затем место обратно в клетке.

9. гистологические процедура

1. Усыпить крыс в камере с ингаляционных CO₂ согласно AVMA этических стандартов¹⁶.
2. После эвтаназии брить задних конечностей, удалить кожу из постановляющей части конечности и disarticulate бедра на бедра. Тщательно удалите все мягкие ткани из постановляющей части бедра (включая все мышцы, сухожилия и связки). Оставьте только тонкий слой мышц, окружающих дефект сайт для защиты регионе исцеления от случайного повреждения во время вскрытия.
3. Место бедренной кости в 10% нейтральных буферизуются формалин при комнатной температуре 3-4 дней для фиксации. Держите формалина 15:1 соотношение объема тканей. Измените решение, как только на полпути через процесс фиксации.
4. Известь бедренной кости в раствор рН 6,5 15% Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) для 3-4 недели. Собирайте серийный рентгенограммы, чтобы определить конечную точку декальцинации.
5. Пополам бедренной продольно с разрубки от кзади в середине сагиттальной плоскости. Представить ткани для встраивания Стандартный парафин и гематоксилином и эозином (H & E).
6. Отправьте H & E слайды патологоанатом для гистологической оценки.

Результаты

Операции были проведены в приблизительно один час один хирург с помощью одного помощника. После хирургической оптимизации интра - и послеоперационных осложнений значительно были сведены к минимуму и использовать джиг аппарата обеспечивается постоянный размер (5 x 3 x 3...

Обсуждение

Малые животные модели ортопедических травм, таких как полный переломов включить исследования, который исследует механизмы остеогенез и оценки терапевтический потенциал биоматериалов²⁰. Это исследование представляет крыса сегментарный дефект модель стабилизировать пос?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sterile Saline	Baxter	2F7124	Used for irrigating wound and rehydration
10% Iodine/Povidone	Carefusion	1215016	Used to prep skin
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	89370094	Used as fixative
1mm non-threaded kirschner wire	DePuy Synthes	VW1003.15	Sterilized, used for the most proximal pin
1mm threaded kirschner wire	DePuy Synthes	VW1005.15	Sterilized, used for the 3 most distal pin slots
2x2 gauze	Covidien	4006130	Sterilized, used to prep skin and absorb blood
4-0 Vicryl Suture	Ethicon	4015304	Used to close muscle and skin layers
4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws	Generic		External fixator assembly
4200 Cordless Driver	Stryker	OR-S-4200	Used to drill kirschner wires
4x4 gauze	Covidien	1219158	Sterilized, used to absorb blood
70 % Ethanol			Used to prep skin
Baytril	Bayer Healthcare LLC, Animal health division	312.10010.3	Added to water as an antibiotic
Cefazolin	Hikma Pharmaceuticals	8917156	Pre-op antibiotic
CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU)	TriLink Biotechnologies	L-7205	Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use
Coelenterazine native	NanoLight Technology	303	Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo
Double antibiotic ointment	Johnson & Johnson consumer Inc	8975432	Applied to pin sites post-op as wound care
Dual Cut Microblade	Stryker	5400-003-410	Used to create 5mm defect in femur
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Fisher	BP120-500	Used to decalcify bone to prep for histology
Extended Release Buprenorphine	ZooPharm		Used as 3 day pain relief
Fenestrated drapes	3M	1204025	Used to establish sterile field
Handpiece cord for TPS	Stryker	OR-S-5100-4N	Used to create 5mm defect in femur
Heating pad	K&H Pet Products	121239	Rat body temperature maintenance
Hexagonal head screwdriver	Wiha	263/1/16 " X 50	External fixator tightening
Induction chamber	Generic		Anesthesia for rats
Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2	Medtronic	7510200	Clinically relevant treatment used as positive control
Isoflurane	Clipper	10250	Anesthesia for rats
IVIS	Perkin Elmer	124262	Bioluminescence imaging modality
Jig	Custom		Used to place bicortical pins
Lipofectamine MessengerMAX	Fisher Scientific	LMRNA003	mRNA complexing agent that enables mRNA delivery
Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000))	APP Pharmaceuticals, LLC	NDC 63323-468-37	Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction
Sterile water	Hospira	8904653	Used as solvent for cefazolin powder
Titanium external fixator plates	Custom		Prepared in house with scrap titanium and milling machine
Total Performance System (TPS) Console	Stryker	OR-S-5100-1	Used to create 5mm defect in femur
TPS MicroSaggital Saw	Stryker	OR-S-5100-34	Used to create 5mm defect in femur
Ultrafocus Faxitron with DXA	Faxitron		High resolution radiographic imaging modality
Uniprim rat diet	Envigo	TD.06596	Medicated rat diet
Universal Handswitch for TPS	Stryker	OR-S-5100-9	Used to create 5mm defect in femur
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469	Skin closure