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要約

Vivo哺乳類モデル重要なサイズの骨欠損部の治癒メカニズムと整形外科の治療法の研究に不可欠です。創外固定による安定化ラットの再現、分節、大腿骨の欠陥生成のためのプロトコルを紹介します。

要約

整形外科の研究は、新しい治療技術の調査し同様、生体内で治癒のメカニズムを研究する動物モデルに大きく依存します。臨界サイズ骨欠損に臨床的に治療するために挑戦しているし、研究努力は分節大腿骨欠損の信頼性の高い、外来の小さな動物のモデルから寄与できます。この研究では、創外固定器で安定したラット大腿骨の 5 mm の重要な骨幹部欠陥の一貫性と再現性のある作成するため最適化された外科プロトコルを提案する.骨幹部の歯槽は、適応創外固定器デバイスの安定する 4 Kirschner ワイヤ bicortically を配置するカスタム治具を用いて行われた.振動骨鋸は、欠陥を作成に使用されました。コラーゲン スポンジだけまたは, 2 に浸したコラーゲン スポンジは、欠陥に移植された、レントゲン写真を用いた 12 週間以上を監視した骨の治癒します。12 週間後ラットを犠牲と組織学的解析摘出のコントロールを行った大腿骨を扱われます。コラーゲン スポンジだけを含む骨欠損は、骨膜の無神経と新しい骨のリモデリングの形成をもたらした, 2 治療中非組合で起因しました。動物の注入後も回収し、外部の固定大腿骨欠陥 12 週間以上の安定化に成功しました。この合理化された外科的モデルは、骨の治癒を勉強してテストする新しい整形外科バイオマテリアルと再生治療で体内に容易に適用でした。

概要

整形外科外傷の手術は複雑な骨折の広い範囲の治療に焦点を当てください。欠陥の障害と同様に、周囲の筋肉や骨膜の再生能力の低下により臨床的に治療するために難しいと判明した重要な分節骨は、血管新生1をローカライズしました。骨移植手術固定、遅延 (Masquelet) の骨移植、骨輸送、融合、または切断2,3,4現代治療技術があります。よく機能遠位肢を持つ彼らの外傷後に保持外来機能を持つほとんどの患者の下肢救済は明らかにより良い治療オプション5です。これらのサルベージ治療は、長い治療経過の段階的な外科的介入を必要があります。何人かの著者は、その外固定、注入中に注入、減少減少した組織損傷のため、これらのアプリケーションの内部固定の表面積の増加の術後の調整と比較して優れた示唆しています。創固定器6。しかし、前向き無作為化対照試験は脛骨7の重度の開放骨折で創外固定と内部のこの論争を明確にするために現在進行中。残念なことに、いずれかの治療選択、重要な合併症と失敗率は8,9を永続化します。分節骨の損失に関して、どちらの治療方法外科医は骨幹部骨欠損を重要な課題に対処しなければなりません。欠損の修正する必要があります骨の安定化を最大にし骨プロセス10,11を同時に高めます。

臨床的重要性はまだ重要なサイズ骨幹部骨欠損の下のボリュームによる効果的な再現可能な動物モデルは治療技術を促進し、最終的には臨床転帰の改善研究チームを有効にする必要です。研究者は体内哺乳類動物モデルにおける生理学的治癒メカニズムを勉強する必要があります。未処理動物の選択によりコストを削減で非組合より信頼性の高いメソッドを提供しています外固定既にのようなモデルには、12,13,14,15が存在する場合、手頃な創固定器材料と概要将来の研究簡単アプリケーションの簡単な外科手術。このプロトコルの主な目的は、ラットにおける重要な骨幹部欠陥の信頼性と再現性のあるモデルを確立することです。手順は、安定化と 12 週間にわたってラットの大腿骨で直る骨を評価することにより評価しました。含まれるセカンダリ目標: 動物倫理的な外科的アプローチと安定化、簡素化し、可能な限り効果的なコストとして手頃な価格モデルを作るします。著者と研究チームは、異なる生体材料とこの区域の欠陥の治療を改善する潜在的な再生療法の範囲で予備実験を行いました。

プロトコル

本研究で使用されるラットは動物の安楽死の AVMA のガイドラインに従って毎日のケアを受け取った: 2013年版16。機関動物ケアおよび使用委員会ウィスコンシン大学マディソン校評価し、プロジェクトを開始する前に、この実験的プロトコルを承認します。

1. 動物

  1. ザイモグラム Sprague-dawley ラット体重約 350 g を使用します。

2. 準備の骨形態形成タンパク質-2 (, 2) 浸したスポンジ足場

注: 足場準備大腿骨で移植前にだけ発生する必要があります (ステップ 6.14 を参照)。

  1. コラーゲン スポンジ、凍結乾燥,-2、および再構成17のため滅菌水を含む確立された, 2 骨移植キットの使用のための製造元の指示をに従ってください。無菌性を維持し、1.5 mg/mL の濃度に滅菌水で, 2 を再構築します。
  2. 滅菌はさみや滅菌のルーラーを使用して、トリム 5 mm × 3 mm × 3 mm の欠陥に合わせて形状を変更する, 2 浸漬コラーゲン スポンジです。
  3. 注射器を使用すると、均等に, 2 ソリューション コラーゲン スポンジに吸収されるように。

3. カスタムの外部固定装置の準備

注: 寸法のより完全なリストのため図 1 aを参照してください。

  1. 2 アルミニウム シート素材 (厚型 6061、0.088」) をカット部分 (1.4"x 6") ジグソー パズルまたはその他の適切なツールを使用します。
  2. フライス盤でワンピースをマウントし、ミルを使用して 1/8「90 ° ポイント超硬ドリル、溝加工を行う 4 '' (0.035"深い) 縦。カットの無料の他の作品を残します。
  3. カット幅 0.3」の 2 つからの個々 の板部分 (図 1 b)。測定し、4-40 スレッドのネジ穴をドリルします。4 40 スレッドと 'V' 溝付きプレートをタップします。#4 ネジ本体ドリル溝無しプレートをドリルします。
  4. 角を丸くし、(図 1) の重量を減らすの両方の部分を砂します。
  5. 溝が隣り合わせプレーン プレート (図 1) に、4-40、18-8 ステンレス ボタン ヘッド キャップ ネジ (0.25") と一緒に作品をねじ

4. 麻酔手技と鎮痛

  1. 4% イソフルランと 4 L O2最低を提供する誘導室でラットを配置することによって麻酔を誘導します。
    注意: 研究員は麻酔ガスの吸入を避けるや適切なフードと実験室の換気を維持する必要があります。
  2. ラット立ち直り反射を失った後、商工会議所からラットを削除、鼻の円錐形を添付し、(O2配信率 2-3 L/分、0.8% のイソフルラン麻酔) 鼻から麻酔の維持投与量に置きます。
  3. 加熱パッドまたは低体温症を防ぐために地球温暖化の光の下では、ラットを配置します。
  4. つま先を折ったり、眼瞼反射をテストして適切な麻酔深度を確認します。
  5. 角膜の乾燥を防ぐために目を潤滑します。
  6. 術後 3 日間の鎮痛を提供するために、手術部位からのラットのトランク/背部拡張リリース ブプレノルフィン (1 mg/kg の皮下注射を提供します。

5. 無菌調製と抗菌薬の医者

  1. 余白は、13番目の肋骨、足、背側正中線上、腹側正中線を使用して脚の周辺を剃る。
  2. 次いで 70% 10% ポビドン ヨードを浸した滅菌の 2 x 2 ガーゼを使用してスクラブ剃毛エリア エタノール (4 回ずつ、交互になる)。
  3. 手術大腿四頭筋にセファゾリン (20 mg/kg の筋肉内注射を管理します。
  4. 継続的な抗生物質保護術後 7 日の飲料水中エンロフロキサシン (0.25 mg/ml) を管理します。
  5. 薬用フィード (例えば、Uniprim) ピン尿路感染症を防ぐために研究の持続期間のためにラットを配置します。
  6. ダブルの抗生物質軟膏をインターフェイスに適用肌ピン一度毎日 3 日間術後。
    注: 任意の創外固定のピンを回避またはクランプ緩める感染症の開発に貢献することができます。

6. 手術

注: をさせる滅菌フィールドとワークスペースを維持し、ケースの全体を通して滅菌手法に従うのための努力を協調。

  1. 穴あき、明確な粘着性ドレープ、滅菌フィールドを作成する滅菌タオルでカバー手術ベンチを剃毛脚を拡張します。
  2. 触診する大腿骨と膝蓋骨から近位大腿骨の大転子に及ぶ皮膚切開は前外側を作成する #15 のブレードを使用します。
  3. 慎重に、大腿四頭筋外側広筋前方から分離、膝腱後方外側の大腿骨が公開されるまでに筋間中隔に沿って横方向の足筋膜を切開します。大転子に転殿腱挿入を保持します。
  4. 慎重に、非外科的円周の軟部組織の郭清を行い、外側面からその中間の骨幹で大腿骨を公開します。これを行うには、するのにには、刃を骨表面の輪郭に対して平行に保つことによって基になる骨から筋肉を優しくカットするのに #15 のブレードを使用します。到達のために準備するすべての側面に軟部組織の中央の骨幹の 7-10 mm がクリアされるまで、大腿のシャフトの周りに進みそれは解剖され、露出した骨から筋肉を持ち上げに骨膜エレベーターを使用します。
    注: は、内側大腿神経血管束に損傷を避けます。
  5. 4 の 1.0 mm Kirschner (k) ワイヤを挿入: 2 近位と遠位大腿骨側の大腿骨に垂直な 2 監督ストレートの外側内側。すべてのピンを行う十分な安定性 (図 2 a) の両方の野 (bicortical) を確認します。
  6. 外側上顆のレベルだけでまず、ほとんど遠位ピンから始めます。場所治具は、大腿骨遠位部の横方向にフラッシュされ、1.0 ねじ先端の k ワイヤーを挿入します。
  7. 骨に治具の位置を維持する、最も近位ピンが治具穴に基づく骨が入力されますを識別します。位置が決まったら、慎重に切開臀部の腱の線維に平行に体内を通過する近位ピンの小さなギャップを作成に必要な腱の医原性損傷を最小限に抑える。ドリル 1.0 mm 非スレッド k-ワイヤ、このギャップで再度ピン従事両方の野 (図 2 b) を確保します。
  8. 骨との接触治具の位置を維持し、将来欠陥サイトのいずれかの側に 1 つ 2 つ 1.0 ミリメートル スレッド k-ワイヤー、ドリルします。ピン従事両方の野 (図 2) を確認します。
  9. レベル 1 cm 皮膚上バー創外固定器を置き、ネジをしっかりと場所にバーをロックします。余分なピンの長さ (図 2 D) をクリップします。
  10. 周囲軟部組織、筋肉、神経血管束を保護するために前部と後部の大腿骨の周りの小さな、湾曲したリトラクターを配置することによって到達 (欠陥生成) の準備します。〜 5 mm 矢状振動を利用した、ブレードを非常に慎重に半ばの骨幹を 5 mm 分節欠陥を作成します。光、不必要な破壊 (図 2 e) を避けるためにのこぎりで均等に力が適用されます。
  11. 必要に応じて骨の熱壊死を避けるために欠陥を作成中、(部屋の温度 0.9% 滅菌生理食塩水入り (NS)) 灌漑の少量を適用します。
  12. 欠陥を作成した後 NS の 10 mL を使用して傷を洗い流します。
  13. 鎮痛剤や血管収縮薬として傷にエピネフリン (1: 200, 000) と 0.25% ブピバカインの 0.1 mL を管理します。
  14. 挿入コラーゲン スポンジや, 2 の足場 (5 mm × 3 mm × 3 mm) は、欠陥に (ステップ 2) からスポンジを浸漬。各足場のスパンの長さと位置にスポンジを助ける、欠陥の量に適切なサイズ。
    注: この時点で、mRNA 複合体が準備し、生物発光イメージングを実行している場合、7.1 7.3 以下の手順で説明したように注入します。
  15. 4-0 縫合糸で簡単な中断パターンを使用して筋平面を閉じます。4-0 縫合糸で実行している真皮パターンを使用スキン層を閉じ、突出ピンの周りのギャップを閉じるに接着剤を皮膚します。
  16. 加熱パッドの残り、鼻の円錐形からラットを削除し、ラットは直立姿勢を一貫して維持することができるまで継続的に監視します。この時点で回復するきれいなケージに配置します。

7. 複合体 mRNA と生物発光イメージングの準備

注: mRNA 複合体のトランスフェクションは、手術前日発光イメージング中に行わなければなりません。MRNA を処理するときは、滅菌テクニックを使用します。

  1. MRNA は Gaussia ルシフェラーゼ (ストック濃度 1 μ g/μ L) 脂質 transfecting エージェントの 30 μ L でのエンコーディングのミックス 10 μ L。
  2. 少なくとも 5 分間室温でインキュベートしフォームに mRNA リン脂質複合体を可能にします。安定化、トランスフェクション効率を高めて、脂質の transfecting エージェントは mRNA の分子を凝縮します。
    注: 複合体をすぐに使用しない場合 1 h の最大の氷に格納します。
  3. それぞれ、欠陥の遠位と近位端に mRNA 複合体量の半分を注入装備されてフィルターのヒント 20 μ L ピペットを使用して。
  4. 次の日、イメージング、前に 3 分の麻酔ラット吸入イソフルランを使用して手順 4.1 で説明したとおり。
  5. 生体内イメージング保守イソフルラン (0.8% イソフルラン、O2配信率 2-3 L/分) を提供する鼻の円錐形を装備したチャンバー ラットを配置します。
  6. 欠陥の近くの 4 mg/kg 体重の投与量で生理食塩水で再停止されるセレンテラジンを注入します。
  7. 生体内イメージング システム (IVIS) 製造元の手順18によると生物発光画像を取得します。

8. イメージング プロトコル

  1. プレーン撮影機、x 線システム19の場合は、校正後前述 (手順 4.1を参照) として吸入イソフルランを使用してラットの麻酔し、吸入イソフルラン (0.8% イソフルラン、O2と鼻の円錐形で、ラットの位置2-3 L/分の速度で配信) 前後 (AP) 大腿骨レントゲン写真のため。
    1. ラットは、胸骨の横臥中は、手術の後肢、股関節屈曲を進めるし、ジョイントを抑えます。約 90 ° に抑える関節を屈曲します。体壁に近く、足の足底側をテープします。骨をスーパーイン ポーズの可能性を排除する大腿骨から脛骨前方の位置。股関節のわずかな外転を提供するには、鼠蹊部周辺に半透明のスポンジ (約 15 mm 厚) を配置します。大腿骨の前方後方 (頭蓋仙骨) 画像を取得します。
  2. この AP の大腿骨のレントゲン写真のビューの手術、4 週間と 12 週間の直後を繰り返します。適切な品質と一貫性のあるイメージのため動物の四肢の位置にテープとガーゼを使用します。
  3. 鼻の円錐形からラットを削除し、ラットは直立姿勢を一貫して維持することができるまで継続的に監視します。その後、ケージに配置。

9. 組織の手順

  1. ラット吸入 CO2 AVMA 倫理16によると、商工会議所を安楽死させます。
  2. 次の安楽死は、後肢を剃る、手術下肢から皮膚を削除し、股関節の大腿骨を disarticulate します。(すべての筋肉、腱や靭帯を含む) 手術の大腿骨からすべて軟部組織を注意深く取り外します。解剖時に偶発的な損傷から癒しの地域を保護するために欠陥サイトを取り巻く筋肉の薄い層のみを残します。
  3. 大腿骨が、10% 中性バッファー ホルマリン 3-4 日間室温で固定できるようにします。15:1 ホルマリンを組織体積比にしてください。一度固定化プロセスの途中でソリューションを変更します。
  4. 3-4 週間のため、15% エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) pH 6.5 溶液で大腿骨をめし。脱エンドポイントを決定するシリアル レントゲン写真を収集します。
  5. 縦方向後方前方正中面からカットと大腿骨を二等分します。標準的なパラフィン包埋し、ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色のための組織を提出してください。
  6. 病理組織学的評価のために H & E のスライドを送信します。

結果

手術は、約 1 時間で 1 つのアシスタントの助けを借りて、1 つの外科医によって行われました。手術の最適化後術中・術後合併症が大幅に最小化された大腿骨欠陥の局在と一貫性のあるサイズ (5 x 3 x 3 mm) を確保する治具装置使用することとします。ラットの麻酔から歩行直後回復され任意変更された行動パターンを持っている表示されませんでした。彼らの歩行で、?...

ディスカッション

完全な骨の骨折などの整形外科的損傷の小さな動物モデルでは、骨形成と生体材料20の治療の可能性の評価のメカニズムを探る研究を有効にします。本研究はラットを紹介、カスタム創外固定器ラボと医用生体工学チームは荷重骨接合用骨修復のさらなる研究のため容易に再現できるによって安定化された区域の欠陥モデル。

よくラット モデルにおけ?...

開示事項

著者ない競合する金銭的な利益や利益を宣言します。この記事の著者の受けた直接的または間接的利益はなかった。

謝辞

この作品は、ウィスコンシン大学と公衆衛生、医学リハビリテーション整形外科部門によって提供される追加のサポートと共に NIH 機器の助成金 1S10OD023676-01 によって支えられました。UW のコスミック カーボンがんセンター サポート助成金 P30 CA014520 と h. マーティンのサポートのための NIH のトレーニングの許可 5T35OD011078-08 と同様、小動物イメージング施設、使用を認めることを願います。我々 も筋骨格系の再生パートナーシップのサポートのマイケルとメアリー ・ スー ・ シャノンに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Sterile SalineBaxter2F7124Used for irrigating wound and rehydration
10% Iodine/PovidoneCarefusion1215016Used to prep skin
10% Neutral Buffered FormalinVWR89370094Used as fixative
1mm non-threaded kirschner wireDePuy SynthesVW1003.15Sterilized, used for the most proximal pin
1mm threaded kirschner wireDePuy SynthesVW1005.15Sterilized, used for the 3 most distal pin slots
2x2 gauzeCovidien4006130Sterilized, used to prep skin and absorb blood
4-0 Vicryl SutureEthicon4015304Used to close muscle and skin layers
4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screwsGenericExternal fixator assembly
4200 Cordless DriverStrykerOR-S-4200Used to drill kirschner wires
4x4 gauzeCovidien1219158Sterilized, used to absorb blood
70 % EthanolUsed to prep skin
BaytrilBayer Healthcare LLC, Animal health division312.10010.3Added to water as an antibiotic
CefazolinHikma Pharmaceuticals8917156Pre-op antibiotic
CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU)TriLink BiotechnologiesL-7205Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use
Coelenterazine nativeNanoLight Technology303Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo
Double antibiotic ointmentJohnson & Johnson consumer Inc8975432Applied to pin sites post-op as wound care
Dual Cut MicrobladeStryker5400-003-410Used to create 5mm defect in femur
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)FisherBP120-500Used to decalcify bone to prep for histology
Extended Release BuprenorphineZooPharmUsed as 3 day pain relief
Fenestrated drapes3M1204025Used to establish sterile field
Handpiece cord for TPSStrykerOR-S-5100-4NUsed to create 5mm defect in femur
Heating padK&H Pet Products121239Rat body temperature maintenance
Hexagonal head screwdriverWiha263/1/16 " X 50External fixator tightening
Induction chamberGenericAnesthesia for rats
Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2Medtronic7510200Clinically relevant treatment used as positive control
IsofluraneClipper10250Anesthesia for rats
IVISPerkin Elmer124262Bioluminescence imaging modality
JigCustomUsed to place bicortical pins
Lipofectamine MessengerMAXFisher ScientificLMRNA003mRNA complexing agent that enables mRNA delivery
Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000))APP Pharmaceuticals, LLCNDC 63323-468-37Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction
Sterile waterHospira8904653Used as solvent for cefazolin powder
Titanium external fixator platesCustomPrepared in house with scrap titanium and milling machine
Total Performance System (TPS) ConsoleStrykerOR-S-5100-1Used to create 5mm defect in femur
TPS MicroSaggital SawStrykerOR-S-5100-34Used to create 5mm defect in femur
Ultrafocus Faxitron with DXAFaxitronHigh resolution radiographic imaging modality
Uniprim rat dietEnvigoTD.06596Medicated rat diet
Universal Handswitch for TPSStrykerOR-S-5100-9Used to create 5mm defect in femur
Vetbond Tissue Adhesive3M1469Skin closure

参考文献

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