사용자 지정 외부 Fixator를 안정화 하는 쥐에서 안정적이 고 재현 가능한 크기의 중요 한 단편 대 퇴 결함 모델

요약

Vivo에서 포유류 모델의 중요 한 크기의 뼈 결함 치유 메커니즘 및 정형 외과 치료를 공부 하는 연구원을 위한 필수적입니다. 여기, 우리는 외부 고정을 사용 하 여 안정화 하는 쥐에 재현, 단편, 대 퇴 결함의 생성에 대 한 프로토콜을 소개 합니다.

초록

정형 외과 연구 vivo에서 치유 하는 뼈의 메커니즘을 연구 하 고 새로운 치료 기술을 조사 동물 모델에 크게 의존 합니다. 임계 크기 단편 결함 임상, 치료를 도전 그리고 연구 노력 단편 대 퇴 결함의 안정적이 고 외래 작은 동물 모델에서 혜택을 받을 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 외부 fixator를 안정화 하는 쥐 대 퇴 골에 5mm 중요 한 diaphyseal 결함의 일관 되 고 재현 가능한 창조에 대 한 최적화 된 수술 프로토콜을 제시. Diaphyseal ostectomy 4 Kirschner 전선을 bicortically를 사용자 정의 지 그를 사용 하 여 어떤 적응된 외부 fixator 장치와 안정 되었다 수행 되었다. 진동 뼈 톱 결함을 만드는 데 사용 되었다. 혼자 콜라겐 스폰지 또는 rhBMP-2에 배어 콜라겐 스폰지는 결함으로 이식 했다 하 고 치유 하는 뼈 검사를 사용 하 여 12 주 동안 모니터링 했습니다. 12 주 후 쥐 희생 했다, 그리고 조직학 분석 삭제 제어에 수행한 화관을 취급. RhBMP-2 치료 개장 periosteal 비정 하 고 새로운 뼈의 형성을 굴복 하는 동안 뼈 결함만 콜라겐 스폰지 포함 된 비-연합, 결과. 동물 이식, 후 잘 복구 하 고 외부 고정 안정화 대 퇴 결함 12 주 이상에서 성공 입증. 이 합리적인된 수술 모델 뼈 치유를 연구 하 고 새로운 정형 외과 바이오 소재 및 재생 치료 비보테스트를 쉽게 적용할 수 있습니다.

서문

정형 외과 외상 수술은 다양 한 복잡 한 골절 치료에 중점을 둡니다. 결함의 실패 뿐만 아니라 주변 근육과 감소 재생 능력 때문에 임상 치료 하기 어려운 입증 했다 중요 한 diaphyseal 단편 뼈 지역화 신생¹. 현대 치료 기법으로 뼈 접목 수술 고정, 지연 (Masquelet) 뼈 접목, 뼈 전송, 융합, 또는 절단^2,,34. 잘 작동 원심 사지와 그들의 외상 후 보존 하는 보 행 기능 대부분의 환자에서 다리 구조는 명확 하 게 더 나은 치료 옵션⁵입니다. 이러한 구조 치료는 종종 긴 치료 과정을 통해 단계적된 수술 개입을 필요합니다. 몇몇 저자는 외부 고정은의 증가 수술 후 조정와 내부 고정 감소 조직 손상으로 인해 이러한 응용 프로그램에 대 한 감소 하는 이식 시 이식 표면적, 우수한 제안 fixator⁶. 그러나, 장래 무작위로 고른된 통제 되는 예는 현재 진행이 논쟁의 경골⁷의 심각한 오픈 골절 외부 고정 대 내부를 명확히입니다. 불행히도, 어느 치료 선택, 중요 한 합병증 및 실패 속도 유지^8,9. 단편 뼈 손실에 관하여 치료 방법 중 하나는 외과 의사 해야 합니다 중요 한 과제가 단편 diaphyseal 결함으로 다 투 다. 단편 결함의 수정 뼈 안정화를 극대화 하 고 동시에 osteogenic 과정^10,11을 강화 해야 합니다.

임상 중요성, 아직 중요 한 크기 diaphyseal 단편 결함의 낮은 볼륨으로 인해 효과적, 재현할 수 동물 모델은 사전 처리 기술 및 궁극적으로 임상 결과 개선 연구 팀을 활성화 하는 데 필요한. 연구원은 생체 내에서 생리 치료 메커니즘 포유류 동물 모델에서 공부 해야 합니다. 외부 고정 이미의 같은 모델^12,13,,1415존재, 비-조합 치료 동물의 선택을 통해 감소 비용에 대 한 더 신뢰할 수 있는 방법을 제공 하겠습니다. 저렴 한 fixator 자료, 그리고 미래의 연구를 쉽게 응용 프로그램에 대 한 간단한 수술 프로토콜 개요. 이 프로토콜의 주요 목표 쥐에서 중요 한 diaphyseal 결함의 안정적이 고 재현 가능한 모델을 확립 하는 것입니다. 절차는 안정화 및 뼈 쥐 화관에서 12 주 이상 치료를 평가 하 여 평가 되었습니다. 포함 하는 보조 목표: 윤리적인 동물 들 외과 접근 및 안정화, 단순화 하 고, 효과적인 비용으로 저렴 한 모델을 만들기. 저자와 연구 팀 다른 생체 재료 및이 단편 결함에서 치유 개선에 잠재적인 재생 치료의 범위와 예비 실험을 실시.

프로토콜

이 연구에 사용 된 쥐 동물의 안락사에 대 한 일일 케어 AVMA 지침에 따라 받은: 2013 판¹⁶. 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 위스콘신-매디슨 대학 평가 하 고 프로젝트를 시작 하기 전에이 실험 프로토콜을 승인 했다.

1입니다. 동물

1. 무게 약 350 g outbred Sprague-Dawley 남성 쥐를 사용 합니다.

2. 준비의 뼈 Morphogenetic 단백질-2 (rhBMP-2) 젖은 스폰지 건설 기계

참고: 비 계 준비 대 퇴 골에 이식 직전 발생 한다 (단계 6.14 참조).

1. 콜라겐 스폰지, 동결 건조 된 rhBMP-2, 및 재구성¹⁷살 균 물 포함 하는 설립된 rhBMP-2 뼈 이식 키트의 사용에 대 한 제조 업체의 지침을 따릅니다. 무 균 유지, reconstitute 1.5 mg/mL의 농도에 살 균 물과 rhBMP 2.
2. 가 위 살 균 및 살 균 눈금자 using, 트림 rhBMP-2 배어 콜라겐 스폰지는 5 m m x 3 m m x 3 m m 결함에 맞게 바꿀 수 있습니다.
3. 주사기를 사용 하 여 배포 rhBMP-2 솔루션 균등 하 게 콜라겐 스폰지에 흡수 되는.

3입니다. 사용자 지정 외부 고정 장치 준비

참고: 치수의 더 완전 한 목록에 대 한 1A 그림 참조.

1. 2 알루미늄 시트 재고 (종류 6061, 0.088"두께)를 잘라 조각 (1.4" x 6")는 또는 다른 적절 한 도구를 사용 하 여.
2. 밀링 기계에 원피스를 탑재 하 고, 4 개의 'V' 홈 (0.035 깊은)를 잘라 1/8"90 °-포인트 카바 이드 드릴 선반을 사용 하 여, 세로로. 무료 커트의 다른 조각을 두십시오.
3. 두에서 0.3"폭의 개별 번호판을 잘라 조각 (그림 1B). 측정 하 고 4-40 스레드 나사 구멍을 드릴 합니다. 4-40 스레드 'V' 홈 플레이트를 누릅니다. #4 나사 신체 훈련에 대 한 홈 없이 접시 드릴.
4. 모래 모서리 둥글게 줄일 무게 (그림 1C)을 두 조각.
5. 그루브 일반 판 (그림 1D)에 대 한 플러시 되도록 4-40, 18-8 스테인리스 단추 머리 캡 나사 (0.25") 함께 조각을 스크류합니다

4. 마 취 절차와 진통

1. 4 %isoflurane 4 L O₂/min 제공 유도 실에서 쥐를 배치 하 여 마 취를 유도.
   주의: 연구 요원 마 취 가스의 흡입을 방지 하 고 적절 한 후드와 실험실에서 환기를 유지 해야 합니다.
2. 쥐 righting 반사 손실 후 상공에서 쥐를 제거 하 고 코 콘을 첨부 코 (2-3 L/min와 0.8 %isoflurane O₂ 배달 속도)를 통해 마 취의 유지 보수 복용량에.
3. 가 열 패드 또는 저체온증을 방지 하기 위해 지구 온난화 빛에서 쥐를 놓습니다.
4. 발가락을 곤란 하 게 하거나 종을 반사를 테스트 하 여 마 취의 적절 한 깊이 확인 합니다.
5. 윤 활 막의 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.
6. 트렁크/등의 수술 후 최대 3 일 동안 진통 제공 하는 외과 사이트, 멀리 쥐에서 확장 릴리스 buprenorphine (1 mg/kg)의 피하 주사를 제공 합니다.

5. 무 균 준비 및 항생제 preventatives

1. Hindleg 여백으로 13^번째 늑 골, 발, 등 쪽 정중 선, 그리고 복 부 중간을 사용 하 여 주변을 면도.
2. 10 %povidone-요오드 70% 뒤 젖은 멸 균 2 x 2 거 즈를 사용 하 여 면도 스크럽 영역 EtOH (4 회 각각, 교류).
3. 관리 요원 quadriceps에 cefazolin (20 mg/kg)의 근육 주사 합니다.
4. Postoperatively 지속적인된 항생제 보호를 위해 7 일 동안 식용 수에 있는 enrofloxacin (0.25 mg/ml)를 관리 합니다.
5. 핀으로 감염을 방지 하기 위해 연구 기간에 대 한 치료 피드 (예: Uniprim)에 쥐를 놓으십시오.
6. 적용 더블 항생제 연 고 피부 핀 인터페이스를 한 번에 매일 3 일 동안 postoperatively.
   참고: 모든 외부 고정 핀을 피 하거나 감염의 발전에 기여할 수 있는 완화 클램프.

6. 수술

참고: 확인 한 공동 노력을 살 균 분야 및 작업 영역을 유지 하 고 경우의 전체에 걸쳐 메 마른 기술 따라 하.

1. Fenestrated, 분명 스티커 드 레이프와 살 균 필드를 만드는 메 마른 수건에 커버 외과 벤치를 통해 면도 다리를 확장 합니다.
2. 대 퇴 골을 만져 하 고 #15 블레이드를 사용 하 여 근 위 대 퇴 골에 더 중대 한 trochanter 슬 개 골에서 연장 하는 피부를 통해 anterolateral 절 개를 만듭니다.
3. 조심 스럽게 분리 하는 근육의 vastus lateralis 근육 anteriorly는 근육에서 뒤로 측면 대 퇴 골 노출까지 질의 심장 따라 측면 다리 근 막 incise. 더 중대 한 trochanter에 납치범 gluteal 힘 줄 삽입을 유지 합니다.
4. 주의 atraumatic 원주 연 조직 절 개를 수행 하 고 대 퇴 골의 중간 diaphysis 측면 표면에 시작에 노출. 이렇게 하려면 #15 블레이드를 사용 하 여 부드럽게 뼈 표면의 윤곽에 대 한 병렬 블레이드를 유지 하 여 기본 뼈에서 근육을 잘라. Periosteal 엘리베이터를 사용 하 여 노출 된 뼈에서 근육으로 해 부 되 고 중앙 diaphysis의 7-10 m m ostectomy에 대 한 준비를 모든 면에서 연약한 조직 삭제 될 때까지 대 퇴 샤프트 주위 진행.
   참고: 내측 대 퇴 혈관 번들에 부상을 피하십시오.
5. 4 1.0 m m Kirschner (k) 전선 삽입: 2 근 2 수직 측면 대 퇴 골, 대 퇴 골에서 원심 감독 중간에 바로 옆. 적절 한 안정성 (그림 2A)에 대 한 두 외피가 (bicortical)을 종사 하는 모든 핀을 확인 합니다.
6. 그냥 측면 뼈의 수준에서 처음, 원심 가장 핀부터 시작. 장소 지 그를 측면 원심 대 퇴 골을 1.0 스레드 끝 k-와이어를 삽입 합니다.
7. 뼈에 지 그의 위치를 유지, 가장 근 위 핀 지 그 구멍에 따라 뼈를 입력 것입니다 식별 합니다. 위치 결정 되 면 신중 하 게 incise gluteal 힘 줄의 섬유에 평행으로 통과, 근 위 핀에 대 한 조직에 작은 차이 만드는 데 필요한 힘에 의원 성 손상을 최소화. 1.0 m m 비-스레드 k-와이어가이 간격에 다시 핀 종사 두 외피가 (그림 2B) 보장 드릴.
8. 지 그의 위치는 뼈와 접촉을 유지 하 고 두 개의 스레드 1.0 m m k-와이어, 미래의 결함 사이트의 양쪽에 하나씩 드릴. 핀 두 외피가 (그림 2C) 참여 확인 합니다.
9. 피부 위에 레벨 1 cm 바 외부 fixator를 놓고 긴밀 하 게, 자리에 바 잠금 나사. 클립 초과 핀 길이 (그림 2D).
10. 앞쪽 및 후부 대 퇴 골 주위 작은, 곡선 견인을 배치 하 여 주변 연부 조직, 근육, 및 혈관 다발을 보호 하기 위해 ostectomy (결함 생성)에 대 한 준비. ~ 5 mm 화살 진동 활용 보았다 블레이드, 매우 신중 하 게 중간 diaphysis 통해 5mm 단편 결함을 만들. 빛, 불필요 한 골절 (그림 2E)을 피하기 위해 톱으로도 압력을 적용 합니다.
11. 뼈의 열 괴 사를 방지 하는 결함을 만드는 동안 필요한으로 관개 (실내 온도 0.9% 메 마른 정상적인 염 분 (NS))의 작은 금액을 적용 합니다.
12. 결함을 만든 후 10ml의 NS 사용 하 여 상처를 플러시.
13. 진통제와 vasoconstrictor 상처에 피 네 프 린 (1: 200, 000)와 0.25 %bupivacaine 0.1 mL를 관리 합니다.
14. 삽입의 콜라겐 스폰지 또는 rhBMP-2 (3 mm x 3 mm x 5) 비 계 ( 2 단계)에서 결함으로 스폰지 젖 었. 각 비 계 스팬 길이 위치에 유지 하는 스폰지를 돕는 결함의 볼륨을 적절 하 게 크기 한다.
    참고:이 시점에서, mRNA 단지 수 될 준비 하 고 수행 하는 생물 발광 영상 경우 7.1-7.3 아래 단계에 설명 된 대로 주입.
15. 4-0 흡수 봉합과 간단한 중단 된 패턴을 사용 하 여 근육 비행기를 닫습니다. 4-0 흡수 봉합 사로 실행 중인 subcuticular 패턴을 사용 하 여 피부 레이어 닫고 피부 접착제를 튀어나온 핀 주위 간격을 닫습니다.
16. 난방 패드에 남아 있는 코 콘에서 쥐를 제거 하 고 쥐 지속적으로 직 립 자세를 유지할 수 있게 될 때까지 지속적으로 모니터링 합니다. 이 시점에서 복구 하려면 깨끗 한 장에 배치 합니다.

7. 준비 complexed mRNA 및 생물 발광 영상

참고: mRNA 단지와 Transfection 수술 발광 영상 전에 1 일 동안 수행 되어야 합니다. 무 균 기법을 사용 하 여 mRNA를 처리할 때.

1. 혼합 10 µ L mRNA lipidic transfecting 에이전트의 30 µ L 함께 Gaussia luciferase (1 µ g / µ L의 재고 농도)에 대 한 인코딩.
2. 실 온에서 적어도 5 분 동안 배양 하 여 mRNA 지질 단지 형태를 허용 합니다. 그들을 안정 시키고 transfection 효율 향상 lipidic transfecting 에이전트 mRNA 분자를 응축 됩니다.
   참고: 복합물을 즉시 사용 하지 않는 그들에 저장할 최대 1 시간에 대 한 얼음.
3. 각각의 결함, 원심 및 인접 끝에 mRNA 단지의 볼륨의 절반을 주사 필터링된 팁을 갖춘 20 µ L 피 펫을 사용 하 여.
4. 다음 날, 이미징, 전에 3 분 흡입된 isoflurane 이전 단계 4.1에 설명 된 대로 사용 하 여 쥐를 anesthetize.
5. Vivo에서 이미징 챔버 장착 유지 보수 isoflurane (0.8 %isoflurane, 2-3 L/min의 O₂ 배달 속도)를 제공 하는 코 콘 쥐를 놓습니다.
6. 결함의 근접에 4 mg/kg 몸 무게의 복용량에 염 분에서 resuspended coelenterazine 주사.
7. Vivo에서 이미징 시스템 (IVIS) 제조 업체의 지침¹⁸에 따라 생물 발광 이미지를 취득 합니다.

8. 이미징 프로토콜

1. 일반 방사선 기계는 x 선 시스템¹⁹, 보정 후 anesthetize 흡입된 isoflurane를 사용 하 여 앞에서 설명한 ( 단계 4.1참조)으로 쥐 및 쥐 흡입된 isoflurane (0.8 %isoflurane, O₂ 와 코 콘에 2-3 L/min의 배달 속도) anteroposterior (AP) 대 퇴 골 방사선 사진에 대 한.
   1. Sternal recumbency에 쥐를 실행 하는 동안 수술 hindlimb 앞으로 엉덩이에 flexing 사전 및 공동 억압. 약 90 °를 억압 조인트 플렉스. 체 벽에 가까운, 발 발바닥 쪽을 테이프. 뼈도 랑의 가능성을 제거 하기 위해 대 퇴 골에서 경골 앞으로 배치 합니다. 엉덩이의 약간의 납치를 제공, 사 타 구니 지역에서 반투명 스폰지 (약 15 m m 두께)을 배치 합니다. 그런 다음 대 퇴 골의 앞쪽 후부 (두개골 꼬리) 이미지를 얻을.
2. 바로 수술, 4 주, 12 주 뒤이 AP 대 퇴 골 방사선 보기를 반복 합니다. 거 즈와 테이프를 사용 하 여 적절 하 게 품질과 일관 된 이미징에 대 한 동물의 말단 위치.
3. 코 콘에서 쥐를 제거 하 고 쥐 지속적으로 직 립 자세를 유지할 수 있게 될 때까지 지속적으로 모니터링 합니다. 다음으로 다시 장소입니다.

9. 조직학 절차

1. AVMA 윤리 기준¹⁶에 따라 흡입 공동₂ 챔버에 쥐 안락사
2. 다음 안락사는 hindlimb를 면도, 요원 말단에서 피부를 제거 하 고 disarticulate 엉덩이에 대 퇴 골. 조심 스럽게 수술 대 퇴 골 (를 포함 하 여 모든 근육, 힘 줄, 인 대)에서 모든 연 조직 제거. 만 해 부 동안 실수로 손상에서 치유 영역을 보호 하기 위해 결함 사이트를 둘러싼 근육의 얇은 레이어를 남겨 주세요.
3. 10%는 대 퇴 골 에서도 중립 버퍼링 말린 3-4 일 동안 실내 온도에 고정을 위한 수 있도록. 조직 볼륨 비율 15:1 포 르 말린을 유지. 일단 정착 과정을 통해 중간 솔루션을 변경 합니다.
4. 3-4 주 동안 15 %Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) pH 6.5 솔루션에서 대 퇴 골을 알려줍니다. Decalcification 끝점을 확인 하기 위해 직렬 검사를 수집 합니다.
5. 중반-화살 평면에서 후부 앞쪽에서 커트로 경도 대 퇴 골 이등분 조직 표준 파라핀 포함 되며 고 오신 (H & E) 얼룩에 대 한 제출.
6. 조직학 평가 대 한 병리학 자 H & E 슬라이드 보내기.

결과

수술 한 조 수의 도움으로 한 외과 의사에 의해 약 1 시간에 수행 되었습니다. 수술 최적화 후 내부-수술 후 합병증 크게 최소화 했다 고 일관성 있는 크기 (5 x 3 x 3 m m) 및 대 퇴 결함의 지역화 보장 지 그 장치를 사용. 쥐 마 취에서 외래 즉시 다음 복구 되었고 어떤 변경 된 행동 패턴;는 나타나지 않았다 그들의 걸음 걸이, antalgic 되었고 그들은 외부 fixator에 의해 방해 하 고...

토론

완전 한 뼈 골절 등 정형 외과 상해의 작은 동물 모델 바이오²⁰의 치료 가능성을 평가 하 고 골의 메커니즘을 탐구 하는 연구를 사용 합니다. 이 연구에서는 쥐 단편 결함 모델 연구소와 생명 공학 팀 로드 베어링 osteosynthetic 뼈 수리의 추가 연구에 대 한 쉽게 재현할 수 있는 사용자 지정 외부 fixator에 의해 안정.

일반적으로 쥐 모델에서 중요 한 크기의 결함을...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sterile Saline	Baxter	2F7124	Used for irrigating wound and rehydration
10% Iodine/Povidone	Carefusion	1215016	Used to prep skin
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	89370094	Used as fixative
1mm non-threaded kirschner wire	DePuy Synthes	VW1003.15	Sterilized, used for the most proximal pin
1mm threaded kirschner wire	DePuy Synthes	VW1005.15	Sterilized, used for the 3 most distal pin slots
2x2 gauze	Covidien	4006130	Sterilized, used to prep skin and absorb blood
4-0 Vicryl Suture	Ethicon	4015304	Used to close muscle and skin layers
4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws	Generic		External fixator assembly
4200 Cordless Driver	Stryker	OR-S-4200	Used to drill kirschner wires
4x4 gauze	Covidien	1219158	Sterilized, used to absorb blood
70 % Ethanol			Used to prep skin
Baytril	Bayer Healthcare LLC, Animal health division	312.10010.3	Added to water as an antibiotic
Cefazolin	Hikma Pharmaceuticals	8917156	Pre-op antibiotic
CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU)	TriLink Biotechnologies	L-7205	Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use
Coelenterazine native	NanoLight Technology	303	Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo
Double antibiotic ointment	Johnson & Johnson consumer Inc	8975432	Applied to pin sites post-op as wound care
Dual Cut Microblade	Stryker	5400-003-410	Used to create 5mm defect in femur
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Fisher	BP120-500	Used to decalcify bone to prep for histology
Extended Release Buprenorphine	ZooPharm		Used as 3 day pain relief
Fenestrated drapes	3M	1204025	Used to establish sterile field
Handpiece cord for TPS	Stryker	OR-S-5100-4N	Used to create 5mm defect in femur
Heating pad	K&H Pet Products	121239	Rat body temperature maintenance
Hexagonal head screwdriver	Wiha	263/1/16 " X 50	External fixator tightening
Induction chamber	Generic		Anesthesia for rats
Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2	Medtronic	7510200	Clinically relevant treatment used as positive control
Isoflurane	Clipper	10250	Anesthesia for rats
IVIS	Perkin Elmer	124262	Bioluminescence imaging modality
Jig	Custom		Used to place bicortical pins
Lipofectamine MessengerMAX	Fisher Scientific	LMRNA003	mRNA complexing agent that enables mRNA delivery
Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000))	APP Pharmaceuticals, LLC	NDC 63323-468-37	Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction
Sterile water	Hospira	8904653	Used as solvent for cefazolin powder
Titanium external fixator plates	Custom		Prepared in house with scrap titanium and milling machine
Total Performance System (TPS) Console	Stryker	OR-S-5100-1	Used to create 5mm defect in femur
TPS MicroSaggital Saw	Stryker	OR-S-5100-34	Used to create 5mm defect in femur
Ultrafocus Faxitron with DXA	Faxitron		High resolution radiographic imaging modality
Uniprim rat diet	Envigo	TD.06596	Medicated rat diet
Universal Handswitch for TPS	Stryker	OR-S-5100-9	Used to create 5mm defect in femur
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469	Skin closure