Um modelo confiável e reprodutível tamanho crítico segmentar defeito Femoral em ratos estabilizada com um fixador externo personalizado

Resumo

In vivo dos mamíferos modelos de defeitos ósseos tamanho crítico são essenciais para pesquisadores estudando mecanismos de curativas e terapias ortopédicas. Aqui, apresentamos um protocolo para a criação de defeitos reproduzíveis, segmentares, fêmur em ratos estabilizados utilizando fixação externa.

Resumo

Pesquisa ortopédica confia pesadamente em modelos animais para estudar mecanismos de consolidação óssea em vivo , bem como investigar as novas técnicas de tratamento. Tamanho crítico defeitos segmentares são desafiadores para tratar clinicamente, e os esforços de investigação poderiam beneficiar de um modelo animal pequeno confiável, ambulatório de defeitos segmentares femoral. Neste estudo, apresentamos um protocolo cirúrgico otimizado para a criação consistente e reproduzível de um defeito de diáfise crítica de 5 mm em um rato de fêmur estabilizado com fixador externo. A diáfise ostectomy foi realizada usando um gabarito personalizado para colocar 4 bicortically de fios de Kirschner, que foi estabilizada com um dispositivo adaptado de fixador externo. Uma serra de osso oscilante foi usada para criar o defeito. Ou uma esponja de colagénio sozinha ou uma esponja de colágeno embebida em rhBMP-2 foi implantada para o defeito, e a consolidação óssea foi monitorada durante 12 semanas usando radiografias. Após 12 semanas, ratos foram sacrificados e análise histológica foi executada no controle excisado e tratados fêmures. Defeitos ósseos contendo apenas esponja de colagénio resultaram na não-sindicalizados, tratamento de rhBMP-2 rendeu a formação de uma remodelação óssea periosteal de insensível e nova. Fixação de animais bem recuperada após o implante e externa for bem-sucedida na estabilização dos defeitos femorais durante 12 semanas. Este modelo cirúrgico simplificado poderia ser facilmente aplicado para estudar a consolidação óssea e testar novos biomateriais ortopédicos e terapias regenerativas em vivo.

Introdução

Cirurgia de trauma ortopédico centra-se no tratamento de uma ampla gama de fraturas complexas. Crítica óssea segmentar diafisária defeitos provaram-se difíceis de tratar clinicamente devido a diminuição da capacidade regenerativa da musculatura circundante e periósteo, bem como a falha de localizadas angiogênese¹. Técnicas modernas de tratamento incluem fixação operativa com enxerto ósseo, atrasou o enxerto ósseo (Masquelet), transporte ósseo, fusão ou amputação^2,3,4. Na maioria dos pacientes que têm a função ambulatorial preservada após o trauma, com bom funcionamento Membros distais, salvamento de membro é claramente a melhor opção de tratamento⁵. Estes tratamentos de salvamento muitas vezes exigem intervenções cirúrgicas encenadas um longo tempo de tratamento. Alguns autores têm sugerido que a fixação externa é superior em comparação com a área de superfície de fixação interna para estas aplicações devido aos danos do tecido diminuição durante o implante, diminuiu implantada e ajustabilidade pós-operatório aumentada de o fixador de⁶. No entanto, um prospectivo randomizado controlado está em andamento para ajudar a esclarecer esta controvérsia de interno versus fixação externa em graves fraturas expostas da tíbia⁷. Infelizmente, com qualquer tratamento selecionado, significativas taxas de complicação e falha persistirem^8,9. Com qualquer método de tratamento, no que diz respeito a perda óssea segmentar, o cirurgião deve lidar com defeitos segmentares de diafisárias que apresentam desafios significativos. Correções de defeitos segmentares devem maximizar a estabilização óssea e simultaneamente reforçar o processo osteogênico^10,11.

Devido a importância clínica e, no entanto, o menor volume de defeitos segmentares diafisárias tamanho crítico, um modelo animal eficaz, pode ser reproduzido é necessário para permitir que equipes de pesquisa para o avanço de técnicas de tratamento e, finalmente, melhorar os resultados clínicos. Os pesquisadores precisam estudar na vivo fisiológica mecanismos cura em um modelo animal mamífero. Embora tais modelos de fixação externa já existem^12,13,14,15, esperamos fornecer um método mais confiável para não-uniões nos animais não tratados, diminuição de custos através da escolha de materiais acessíveis de fixador e contorno um protocolo cirúrgico simples, de fácil aplicação para estudos futuros. O objetivo principal do presente protocolo é estabelecer um modelo confiável e reprodutível de um defeito crítico diafisário em ratos. O procedimento foi avaliado pela estabilização e consolidação óssea em fêmures de ratos durante 12 semanas. Os objetivos secundários incluídos: fazendo um modelo acessível como um custo eficaz possível, simplificar a abordagem cirúrgica e a estabilização e assegurar a ética cuidar dos animais. Os autores e a equipe de pesquisa conduziram experimentos preliminares com uma gama de diferentes biomateriais e potenciais terapias regenerativas para melhorar a cicatrização nesse defeito segmentar.

Protocolo

Os ratos utilizados neste estudo receberam cuidados diários, em conformidade com as diretrizes de AVMA sobre a eutanásia dos animais: 2013 edição¹⁶. O Comité de uso na Universidade de Wisconsin-Madison e institucional Cuidado Animal avaliaram e aprovaram este protocolo experimental antes do início do projeto.

1. os animais

1. Use os outbreds ratos machos Sprague-Dawley pesando aproximadamente 350 g.

2. preparação de Bone Morphogenetic proteína-2 (rhBMP-2) embebido esponja andaimes

Nota: A preparação do andaime deve ocorrer apenas antes da implantação no fêmur (ver passo 6.14).

1. Siga as instruções do fabricante para o uso de um kit de enxerto de osso de rhBMP-2 estabelecida contendo uma esponja de colagénio, liofilizado de rhBMP-2 e água estéril para reconstituição¹⁷. Manter a esterilidade, reconstitua o rhBMP-2 com água estéril para uma concentração de 1,5 mg/mL.
2. Usando uma tesoura esterilizada e uma régua estéril, apare a esponja de colagénio encharcado de rhBMP-2 para remodelar para caber uma 5 x 3 mm x defeito de 3 mm.
3. Usando uma seringa, distribua a solução de rhBMP-2 uniformemente sobre a esponja de colágeno que é absorvida.

3. preparação do dispositivo de fixação externa personalizada

Nota: Ver figura 1A , para obter uma lista mais completa de dimensões.

1. Cortar alumínio estoque folha (tipo 6061, 0,088" espessura) de duas peças (1,4" x 6") usando um quebra-cabeças ou outra ferramenta apropriada.
2. Montar uma peça na máquina de trituração e, usando um 1/8" 90°-ponto carboneto broca moinho, corte quatro ranhuras de «V» (0,035" profunda) longitudinalmente. Deixe a outra parte livre de cortes.
3. Cortar chapas individuais de 0,3" largura de duas peças (figura 1B). Medir e fazer furos de parafuso de rosca 4-40. Toque em placa com ranhuras 'V' com o segmento de 4-40. Perfure a placa sem ranhuras para um treino de corpo #4 parafuso.
4. Areia de ambas as partes para arredondar cantos e reduzir o peso (Figura 1).
5. Dane-se peças, juntamente com 4-40, de 18-8 botão cabeça tampa parafusos de aço inoxidável (0,25") para que os sulcos estão alinhados contra a placa simples (Figura 1)

4. analgesia e procedimento anestésico

1. Induzi anestesia, colocando o rato na câmara de indução entregando L 4 O2/min com 4% de isoflurano.
   Atenção: Pessoal de pesquisa deve evitar a inalação de gás anestésico e manter capa adequada e ventilação no laboratório.
2. Remover o rato da câmara depois do rato perde braço endireitante reflex, anexar um cone de nariz e coloque a dose de manutenção da anestesia através do nariz (taxa de entrega de₂ O para 2-3 L/min e 0,8% de isoflurano).
3. Coloque o rato sobre a almofada de aquecimento ou sob a luz de aquecimento para evitar a hipotermia.
4. Confirme a profundidade adequada de anestesia por beliscar o dedo do pé ou teste do reflexo palpebral.
5. Aplica lubrificação aos olhos para impedir a secagem da córnea.
6. Entrega uma injeção subcutânea de liberação prolongada buprenorfina (1 mg/kg) no porta-malas/dorso do rato, longe do sítio cirúrgico, para proporcionar analgesia por até 3 dias após a cirurgia.

5. asséptica preparação e inibidores de antibióticos

1. Raspe a área em torno do hindleg usando a 13^th costela, o pé, da linha mediana dorsal e a linha média ventral como as margens.
2. Área de matagal raspada usando gaze estéril de 2 x 2 embebido com 10% de iodo-povidona seguido por 70% EtOH (4 vezes cada, alternando).
3. Administre uma injeção intramuscular de cefazolina (20 mg/kg) no quadríceps operativa.
4. Administre enrofloxacina (0,25 mg/ml) em água potável por 7 dias no pós-operatório para protecção antibiótica contínua.
5. Coloque ratos sobre alimentos com medicamentos (por exemplo, Uniprim) para a duração do estudo para evitar infecções do tracto de pino.
6. Aplique pomada antibiótica dupla para a interface pele-pin uma vez diariamente por 3 dias no pós-operatório.
   Nota: Evitar qualquer pino de fixação externa ou grampear afrouxamento que pode contribuir para o desenvolvimento de uma infecção.

6. ato cirúrgico

Nota: Certifique-se uma concertada ao esforço para manter um campo esterilizado e o espaço de trabalho e siga a técnica estéril durante a totalidade do caso.

1. Estenda a perna depilada através de drape fenestrado, claro pegajoso e capa cirúrgica banco em toalhas estéreis para criar um campo estéril.
2. Palpar o fêmur e use uma lâmina de 15 # para criar uma incisão ântero-lateral, através da pele, estendendo-se desde a patela para o grande trocanter no fêmur proximal.
3. Incise cuidadosamente a fáscia da perna lateral ao longo do septo intermuscular para separar o músculo vasto lateral do quadríceps anteriormente os isquiotibiais posteriormente até o fêmur lateral é exposto. Preserve a inserção do tendão glúteo abdutor sobre o grande trocanter.
4. Executar uma dissecção cuidadosa, de tecidos moles circunferencial de atraumática e expor o fêmur no seu meio da diáfise começando na superfície lateral. Para fazer isso, use uma lâmina #15 suavemente, cortar o músculo longe do osso subjacente, mantendo a lâmina paralela contra o contorno da superfície óssea. Use um elevador periosteal para levantar o músculo longe do osso exposto como ele é dissecado e proceder ao redor da diáfise femoral até 7-10 mm da diáfise central foi libertado de tecidos moles, por todos os lados para se preparar para ostectomy.
   Nota: Evite lesões o vasculonervoso femoral medial.
5. Insira quatro fios de Kirschner (k) de 1.0 mm: 2 proximal e distal no fêmur perpendicular ao fêmur lateral, 2 dirigido em linha reta lateral para medial. Certifique-se de todos os pinos se envolver ambos os córtices (bicorticais) para estabilidade adequada (Figura 2A).
6. Comece com o pino mais distal, apenas ao nível do epicôndilo lateral. Gabarito de lugar liberar para o fêmur distal lateral e introduza um fio de Kirschner 1,0 ponta roscada.
7. Mantém a posição do gabarito no osso, identifica onde o pino mais proximal entrará o osso baseado os furos do gabarito. Uma vez que a posição é determinada, cuidadosamente incise paralelo às fibras do tendão glúteo conforme necessário para criar um pequeno espaço no tecido para o pino proximal a passagem, minimizando assim danos iatrogênicos ao tendão. Perfure um 1,0 mm não roscados fio de Kirschner esta lacuna, novamente, garantindo que o pino de encaixe ambos os córtices (Figura 2B).
8. Manter a posição do gabarito em contacto com o osso e perfurar dois 1.0 mm roscada fios de Kirschner, um de cada lado do local do defeito do futuro. Certifique-se de pinos envolver ambos os córtices (Figura 2).
9. Coloque o fixador externo bar nível 1 cm acima da pele e aparafuse firmemente, a barra de bloqueio. Clip os comprimentos de pino em excesso (Figura 2D).
10. Prepare-se para o ostectomy (criação de defeito) colocando um afastador pequeno, curvado em torno do fêmur anterior e posterior para proteger os tecidos moles circundantes, músculo e feixe vasculonervoso. Utilizando uma oscilação sagital ~ 5 mm da lâmina da Serra, muito cautelosamente, criar um defeito segmentar 5mm através do meio da diáfise. Aplica uma luz, uma pressão uniforme com a serra para evitar desnecessária da fratura (Figura 2E).
11. Aplica pequenas quantidades de irrigação (temperatura 0,9% solução salina normal estéril (NS)) conforme a necessidade, ao criar o defeito para evitar necrose térmica do osso.
12. Lave a ferida com 10 mL de NS depois de criar o defeito.
13. Administre 0,1 mL de bupivacaína a 0,25% com epinefrina (1: 200, 000) a ferida como um analgésico e um vasoconstritor.
14. Inserir o andaime (5 x 3 x 3 mm) de esponja de colágeno ou de rhBMP-2 embebido esponja (da etapa 2) para o defeito. Cada andaime deve ser dimensionada adequadamente para abranger o comprimento e volume do defeito, ajudando a esponja fica em posição.
    Nota: neste ponto, complexos mRNA podem ser preparados e injetados conforme descrito nas etapas abaixo de 7,1-7,3 se realizando imagens de bioluminescência.
15. Feche o avião muscular usando o padrão interrompido simples com uma sutura absorvível de 4-0. Fechar a camada de pele usando um padrão de execução subcuticular com sutura de 4-0 e cola para fechar as lacunas ao redor dos pinos protuberantes de pele.
16. Retire o cone de nariz, permanecendo na rampa de aquecimento, o rato e monitorar continuamente até que o rato é capaz de manter sempre uma postura ereta. Neste ponto, coloque em uma gaiola limpa para se recuperar.

7. preparação de mRNA complexado e imagens de bioluminescência

Nota: Transfection com complexos mRNA deve ser realizada durante a cirurgia 1 dia antes da imagem latente de luminescência. Use técnicas estéreis ao manusear o mRNA.

1. Mix 10 µ l de mRNA codificação para Gaussia luciferase (estoque concentração de 1 µ g / µ l) com 30 µ l do agente transfecting lipídico.
2. Permitem os complexos mRNA-lipídios para formar incubando pelo menos 5 min à temperatura ambiente. O agente transfecting lipídico irá condensar as moléculas de mRNA, estabilizando-os e melhorando a eficiência do transfection.
   Nota: Se os complexos não são usados imediatamente, armazená-los no gelo por um período máximo de 1 h.
3. Utilizando uma pipeta de µ l 20 equipados com pontas filtradas, injete metade do volume de complexos mRNA para as extremidades distais e proximais do defeito, respectivamente.
4. No dia seguinte, 3 min antes de imagem, anestesia o rato utilizando isoflurano inalado como descrito anteriormente no passo 4.1.
5. Posicione o rato em um na vivo de imagem câmara equipada com um cone de nariz entregando manutenção isoflurano (isoflurano 0,8%, taxa de entrega O₂ de 2-3 L/min).
6. Injete coelenterazine resuspended em soro fisiológico na dose de 4 mg/kg de peso corporal na proximidade do defeito.
7. Adquirir imagens de bioluminescência com o na vivo de imagem de sistema (IVIS) de acordo com instruções^{18 as indicações do fabricante}.

8. protocolo de imagem

1. Depois de calibrar a máquina radiográfica simples, um sistema de raio x¹⁹, anestesiamos rato utilizando isoflurano inalado como descrito anteriormente (ver passo 4.1) e posicione o rato em um cone de nariz com isoflurano inalado (0,8% de isoflurano, O₂ taxa de entrega de 2-3 L/min) para uma radiografia do fêmur ântero-posterior (AP).
   1. Enquanto o rato está em prostração esternal, avançar o cirúrgico membro posterior para frente, flexão no quadril e sufocar a articulação. Flexione a articulação de asfixiar a aproximadamente 90°. Fita do lado de plantar pata no chão, perto da parede do corpo. Posição da tíbia para a frente do fémur para eliminar a possibilidade de sobrepor os ossos. Para fornecer ligeira abdução do quadril, coloque uma esponja translúcida (cerca de 15 mm de espessura) na região da virilha. Em seguida, obter uma imagem (crânio-caudal) ântero-posterior do fêmur.
2. Repita essa visão radiográfica do fêmur AP imediatamente após a cirurgia, semanas 4 e 12 semanas. Use fita e gaze para posicionar adequadamente a extremidade do animal para imagem consistente e de qualidade.
3. Retire o cone de nariz o rato e monitorar continuamente até que o rato é capaz de manter sempre uma postura ereta. Em seguida, coloque de volta para a jaula.

9. histológico procedimento

1. Eutanásia em ratos em uma câmara com inalado CO₂ de acordo com padrões éticos de AVMA¹⁶.
2. Após eutanásia, raspar o membro posterior, remover a pele da extremidade operativa e desarticular o fêmur no quadril. Retire todo tecido mole do fémur operativo (incluindo todos os músculos, tendões e ligamentos). Deixe apenas uma fina camada de músculo em torno do local do defeito para proteger danos inadvertidos durante a dissecção da região de cura.
3. Coloque o fêmur em 10% neutro tamponado formalina em temperatura ambiente por 3-4 dias para permitir a fixação. Manter um formol de 15:1 a relação entre o volume de tecido. Altere a solução, uma vez que o processo de fixação no meio.
4. Descalcificar o fêmur em uma solução de pH 6,5 15% ácido etilenodiaminotetracético ácido (EDTA) por 3-4 semanas. Colete seriais radiografias para determinar o ponto de extremidade de descalcificação.
5. Bissetriz do fêmur longitudinalmente com um corte de anterior posterior no plano sagital médio. Submeta o tecido para incorporação de parafina padrão e hematoxilina e eosina (H & E) coloração.
6. Envie H & E slides para uma patologista para avaliação histológica.

Resultados

Cirurgias foram realizadas em cerca de uma hora por um cirurgião com a ajuda de um assistente. Após a otimização cirúrgica, intrae complicações pós-operatórias foram grandemente minimizadas e usam de aparato jig assegurado tamanho consistente (5 x 3 x 3 mm) e localização de defeitos femorais. Ratos foram ambulatorial imediatamente após recuperação da anestesia e não pareceu ter qualquer padrões comportamentais alteradas; sua marcha não era antalgic, e eles não pareciam s...

Discussão

Pequenos animais modelos de lesões ortopédicas, como fraturas ósseas completa habilitar pesquisa que explora os mecanismos de osteogênese e avaliar o potencial terapêutico de biomateriais²⁰. Este estudo apresenta um rato defeito segmentar modelo estabilizado por um fixador externo personalizado que uma equipe do laboratório e a engenharia biomédica pode prontamente se reproduzem para novos estudos de reparação de osso de osteossíntese de carga.

Estudos anterio...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sterile Saline	Baxter	2F7124	Used for irrigating wound and rehydration
10% Iodine/Povidone	Carefusion	1215016	Used to prep skin
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	89370094	Used as fixative
1mm non-threaded kirschner wire	DePuy Synthes	VW1003.15	Sterilized, used for the most proximal pin
1mm threaded kirschner wire	DePuy Synthes	VW1005.15	Sterilized, used for the 3 most distal pin slots
2x2 gauze	Covidien	4006130	Sterilized, used to prep skin and absorb blood
4-0 Vicryl Suture	Ethicon	4015304	Used to close muscle and skin layers
4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws	Generic		External fixator assembly
4200 Cordless Driver	Stryker	OR-S-4200	Used to drill kirschner wires
4x4 gauze	Covidien	1219158	Sterilized, used to absorb blood
70 % Ethanol			Used to prep skin
Baytril	Bayer Healthcare LLC, Animal health division	312.10010.3	Added to water as an antibiotic
Cefazolin	Hikma Pharmaceuticals	8917156	Pre-op antibiotic
CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU)	TriLink Biotechnologies	L-7205	Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use
Coelenterazine native	NanoLight Technology	303	Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo
Double antibiotic ointment	Johnson & Johnson consumer Inc	8975432	Applied to pin sites post-op as wound care
Dual Cut Microblade	Stryker	5400-003-410	Used to create 5mm defect in femur
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Fisher	BP120-500	Used to decalcify bone to prep for histology
Extended Release Buprenorphine	ZooPharm		Used as 3 day pain relief
Fenestrated drapes	3M	1204025	Used to establish sterile field
Handpiece cord for TPS	Stryker	OR-S-5100-4N	Used to create 5mm defect in femur
Heating pad	K&H Pet Products	121239	Rat body temperature maintenance
Hexagonal head screwdriver	Wiha	263/1/16 " X 50	External fixator tightening
Induction chamber	Generic		Anesthesia for rats
Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2	Medtronic	7510200	Clinically relevant treatment used as positive control
Isoflurane	Clipper	10250	Anesthesia for rats
IVIS	Perkin Elmer	124262	Bioluminescence imaging modality
Jig	Custom		Used to place bicortical pins
Lipofectamine MessengerMAX	Fisher Scientific	LMRNA003	mRNA complexing agent that enables mRNA delivery
Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000))	APP Pharmaceuticals, LLC	NDC 63323-468-37	Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction
Sterile water	Hospira	8904653	Used as solvent for cefazolin powder
Titanium external fixator plates	Custom		Prepared in house with scrap titanium and milling machine
Total Performance System (TPS) Console	Stryker	OR-S-5100-1	Used to create 5mm defect in femur
TPS MicroSaggital Saw	Stryker	OR-S-5100-34	Used to create 5mm defect in femur
Ultrafocus Faxitron with DXA	Faxitron		High resolution radiographic imaging modality
Uniprim rat diet	Envigo	TD.06596	Medicated rat diet
Universal Handswitch for TPS	Stryker	OR-S-5100-9	Used to create 5mm defect in femur
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469	Skin closure