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摘要

我们提出了利用 hela 细胞研究哺乳动物细胞周期中双链 rna 结合蛋白激酶 rna 激活 (pkr) 的 rna 相互作用的实验方法。该方法利用甲醛对交联 rna-pkr 复合物和免疫沉淀进行富集 pkr 约束 rna。这些 rna 可以通过高通量测序或 qrt-pcr 进一步分析。

摘要

蛋白激酶 rna 激活 (pkr) 是先天免疫反应蛋白的成员, 并能识别病毒 rna 的双链二级结构。当与病毒双链 rna (dsrna) 结合时, pkr 经历二聚化和随后的自磷酸化。磷酸化 pPKR (ppkr) 变得活跃, 并诱导真核起始因子 2 (eif2α) 的α亚基磷酸化, 以抑制全局平移。越来越多的证据表明, pkr 可以在生理条件下激活, 例如在细胞周期中或在各种压力条件下, 没有感染。然而, 由于缺乏捕获和分析 pkr 相互作用 dsrna 的标准化实验方法, 我们对 pkr rna 激活剂的理解有限。在这里, 我们提出了一个实验方案, 以专门丰富和分析 pkr 绑定 rna 在细胞周期中使用 hela 细胞。利用甲醛的有效交联活性固定 pkr-rna 复合物, 并通过免疫沉淀分离。然后可以进一步处理 pkr 联合免疫沉淀 rna, 以生成高通量测序库。pkr 相互作用的细胞 dsrna 的一个主要类别是线粒体 rna (mtrna), 它可以通过重链和光链 rna 之间的互补相互作用作为分子间 dsrna 存在。为了研究这些双工 mtrna 的散变性, 我们还提出了一种带特异性 qrt-pcr 的方案。我们的协议是针对 pkr 结合 rna 的分析而优化的, 但它可以很容易地进行修改, 以研究其他 dsrna 结合蛋白的细胞 dsrna 或 rna 相互体。

引言

蛋白激酶 rna 激活 (pkr), 也被称为真核起始因子2α激酶 2 (EIF2AK2), 是一种特征良好的蛋白激酶, 传输 rna 提供的信息。它属于真核翻译起始2亚基α (eif2α) 激酶家族和磷酸酯 eif2α在丝氨酸51响应感染,以抑制全球翻译1。在此背景下, pkr 被病毒双链 rna (dsrna) 激活, 为 pkr 二聚和自磷酸化2提供了一个平台。除了 eif2α, pkr 还可以磷酸化 p53, 胰岛素受体底物 1, 抑制剂 b, 和 c-jun n-端子激酶 (jnk) 调节活性的许多信号转导途径 3,4,5, 6。

pkr 最初被确定为一种在脊髓灰质炎病毒感染过程中磷酸化 eif2α的激酶, 通过识别脊髓灰质炎病毒的 dsrna 7,8。pkr 越来越多地被发现在免疫反应之外发挥着多方面的作用, 其异常激活或故障在许多人类疾病中都隐含着。在细胞凋亡过程中经常观察到活着的磷酸化 pPKR (ppkr), 是退行性疾病患者的共同特征, 尤其是亨廷顿病、帕金森症和阿尔茨海默病等神经退行性疾病9 10,11,12, 13.此外, pkr 在代谢应激和热休克等各种压力条件下被激活, 14、15、16、17。另一方面, pkr 的抑制导致细胞增殖甚至恶性转化的增加 18,19。pPKR 功能在正常大脑功能和细胞周期中也很重要, 因为在 m 期20、21、22 期间, ppkr 水平升高。在这种情况下, ppkr 抑制全局转换, 并为正确的细胞分裂20所需的关键有丝分裂信号系统提供提示。此外, 长时间激活 pkr 导致 g2m 相细胞周期停止在中国仓鼠卵巢 23.因此, pkr 磷酸化由负反馈回路调节, 以确保在 mg1 过渡期间快速失活21。

尽管 pkr 功能范围广泛, 但由于缺乏能够激活 pkr 的标准化高吞吐量实验方法来捕获和识别 dsrna, 我们对 pkr 激活的理解有限。先前的研究表明, pkr 可以与由两个倒置 alu 重复 (iralus)20、24形成的 dsrna 相互作用, 但存在额外的细胞 dsrna 的可能性, 这些细胞 dsrna 可以在细胞周期内或以下激活 pkr。人类细胞的应激条件尚未探索。识别 rna 结合蛋白 (rbp) rna 相互体的常规方法是利用紫外光将 rna-rbp 复合物交联 25、26、27。最近的一项研究将这种紫外交联方法应用于小鼠系统, 并确定小核子蛋白 rna 可以调节 pkr 激活在代谢应激16。利用甲醛的高交联效率, 提出了一种在 hela 细胞28细胞周期中识别 pkr 相互作用 rna 的替代方法。在其他 dsRBPs (如 staufen 和 drosha29、30、31) 的研究中也采用了类似的方法。我们发现 pkr 可以与各种类型的非编码 rna 相互作用, 如短插层核元件 (sine)、长穿插核元素 (line)、内源性逆转录病毒元素 (erv), 甚至α-卫星 rna。此外, 我们还表明 pkr 可以与线粒体 rna (mtrna) 相互作用, 线粒体 rna 通过重链和光链 rna28之间的互补相互作用形成分子间 dsrna。最近的一份出版物进一步支持了我们的数据, 即一些 mtrna 以双工形式存在, 并可以激活 dsrna 传感器, 如黑色素瘤差异相关的蛋白质 5, 以诱导干扰素32。更重要的是, mtrna 的表达和亚细胞定位在细胞周期和各种压力源中被调节, 这可能对它们调节 pkr 激活28的能力很重要。

在本文中, 我们提出了一个详细的协议, 最近开发的甲醛交联和免疫沉淀 (fCLIP) 方法来捕获和分析 pkr 相互作用的 rna 在细胞周期。我们演示了用胸苷和诺加唑制备细胞周期抑制样本的方法。然后, 我们提出了分离 pkr 绑定 rna 的 fclip 过程, 以及一种准备高吞吐量测序库以识别这些 rna 的方法。此外, 我们还描述了使用 qrt-pcr 分析 pkr 绑定 rna 的详细过程。具体而言, 我们提出了一个字符串特定的逆转录过程来分析 mtrna 的字符串。所述协议针对 hara 细胞和 pkr 进行了优化, 但可轻松修改细胞周期样本、fclip 和特异性 qrt-pcr 分析等关键步骤, 以研究细胞 dsrna 或识别其他 dsRNAs 的 rna 干扰体。

研究方案

1. 溶液和细胞制备

  1. 解决方案准备
    1. 对于细胞培养培养基, 在杜尔贝科改良鹰培养基 (dmem) 的500毫升中加入50毫升的胎儿牛血清 (fbs), 制备平细胞培养培养基。
      注: 抗生素可以添加到细胞培养基中, 但我们不使用抗生素。
    2. 对于0.1% 的甲醛, 在1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中溶解 4% (w/v), 在热板上加热并稀释, 通过添加 1x pbs 使30% 毫升的甲醛。
      注意: 在烟罩中执行所有步骤, 并注意不要将甲醛溶液煮沸。保护0.1% 溶液不受光线的影响, 并存储在4°c。在一个月内使用该解决方案。
      注: 最终 0.1% (v/v) 聚甲醛溶液的 ph 值应在7左右。
    3. 准备 fclip 裂解缓冲液:20 mm Tris-HCl (ph 7.5), 15 mm 氯化钠、10 mm edta、0.5% (v/v) 非偏数-p40 (np-40)、0.1% (v/v) triton x-100、0.1% (v/v) 十二烷基硫酸钠 (sds) 和 0.1% (w/v) 脱氧胆酸钠。将三重蒸馏水 (tdw) 加入40毫升。存放在4°c。
    4. 准备 fclip 洗涤缓冲液:20 mm Tris-HCl (ph 7.5)、150 mm 氯化钠、10 mm edta、0.1% (v/v) np-40、0.1% (v/v) triton x-100、0.1% (v2) sds 和 0.1% (w/v) 脱氧胆酸钠。加入 tdw 到40毫升。存放在4°c。
    5. 准备 4x pk 缓冲液: 400 mm Tris-HCl (ph 7.5)、200 mm 氯化钠、40 mm edta 和 4% (v/v) sds。加入 tdw 到40毫升。在室温下存放。
    6. 准备 fclip 洗脱缓冲液: 4 x pk 缓冲液20毫升, 尿素21克, tdw 8.5 毫升。准备新鲜的。
    7. 制备 rna 洗脱缓冲液: 0.3 m naoac 和 2% (w/v) sds。在室温下存放。
    8. 制备 2x rna 加载染料: 0.025 (w/v) 溴酚蓝, 0.025 (w/v) 二甲苯氰醇, 5 mm edta, 0.025 (w/v) sds, 95% (v/v) 甲酰胺。储存在-20°c。
    9. 准备 1x tbe 缓冲液: 0.089 mm Tris-Borate 和 0.002 m edta。准备500毫升的 tbe 缓冲器。
  2. s 或 m 相抑制细胞的制备
    1. 种子 ~ 750, 000 或 ~ 1, 000, 000, 000 平底细胞, 分别为 s 或 m 相抑制样本。在37°c 和 5% co2 下生长24小时细胞 。
    2. 用 2 mm 胸苷治疗细胞, 在37°c 孵育18小时。
    3. 用 pbs 清洗细胞两次。在37°c 下加入新鲜培养基并孵育9小时。
    4. 对于 s 相停止细胞, 用 2 mm 胸苷治疗细胞。对于 m 相抑制细胞, 用 100 ngml nocodazole 唑治疗细胞。在37°c 下孵化 15小时, 收获细胞。
      注: 可以使用流式细胞仪检查细胞周期样本的均匀性。

2. 甲醛交联和免疫沉淀

  1. 细胞收获
    1. 对于 s 相样品, 用细胞刮刀收集细胞, 并转移到15毫升的锥形管中。对于 m 相样本, 点击细胞培养盘的一侧分离 m 相抑制细胞, 并将其转移到15毫升的锥形管中。
      注: 为了增加 m 相抑制细胞的均匀性, 请不要使用细胞刮刀。
    2. 在室温下以 380 x克离心细胞 3分钟, 取出上清液, 用1毫升的冷 pbs 重新悬浮, 转移到 1.5 ml 的微离心管中。
    3. 在4°c 条件下, 以 10, 000 x g的温度离心细胞 30秒, 完全去除上清液。
  2. 甲醛交联
    1. 在室温下加入 750μl 0.1% 的甲醛, 10分钟, 固定细胞。
    2. 加入250μl 的 1 m 甘氨酸, 在室温下额外孵育 10分钟, 以淬火反应。在4°c 条件下, 以 10, 000 x g的温度离心细胞 30秒, 完全去除上清液。
    3. 用1毫升的 pbs 重新暂停。在4°c 下以 10, 000 x g的温度离心细胞 30秒, 并去除上清液。
    4. 用400μl 的 fclip 裂解缓冲液重新悬浮, 辅以 0.2% (v/v) 蛋白酶抑制剂和 2% (v/v) rnase 抑制剂。在冰上加血 10分钟, 用超声波机进行声纳。
    5. 加入11μl 的5m 氯化钠, 将氯化钠浓度调整到 ~ 150 mm。旋涡短暂, 离心机在 21,130 x g在4°c 下 15分钟, 将上清液转移到预冷 1.5 ml 微离心管中。
      注: 将40μl 上清液保留在新的离心管中作为输入样品。将输入样品存放在4°c。
  3. 免疫沉淀
    1. 在 1.5 ml 微离心管中加入20μl 的蛋白质 a 珠。
    2. 用400μl 的 fclip 裂解缓冲液清洗珠子。在4°c 条件下以 1, 000 x g离心珠子 1分钟, 取出上清液, 小心添加400μl 的 fclip 裂解缓冲液。通过倒置 3 ~ 4次轻轻重新悬浮珠子。
    3. 重复清洗步骤三次。最后清洗后, 完全取出上清液。
    4. 在300μl 的 fclip 裂解缓冲液中重新悬浮珠子。加入8.3μl 的 5 m 氯化钠, 将氯化钠浓度调整到 ~ 150 mm。加入10μl 的 pkr 抗体, 在4°c 的旋转器上孵育3小时。
    5. 在4°c 下以 1, 000 x g离心珠子 1分钟, 取出上清液, 加入400μl 的 fclip 洗涤缓冲液。通过倒置 3 ~ 4次轻轻重新悬浮珠子。
    6. 重复两次清洗步骤。最后清洗后, 完全取出上清液。
      注: 切勿使用涡流混合器。用双手轻轻反转管子。
    7. 加入300μl 的裂解液, 在4°c 时在旋转器上孵育3小时。
      注: 较长的孵育时间可能会导致背景结合增加。
    8. 在4°c 下以 1, 000 x g离心珠子 1分钟, 取出上清液, 加入400μl 的 fclip 洗涤缓冲液。通过倒置 3 ~ 4次轻轻重新悬浮珠子。
    9. 重复清洗步骤三次。最后清洗后, 完全取出上清液。
    10. 加入300μl 的 fclip 洗脱缓冲液。在25°c 的温度下在热敏器中培养 3小时, 从珠子中洗脱 pkr。
      注: 准备新鲜的 fclip 洗脱缓冲液。
    11. 在室温下以 1, 000 x克离心, 并将上清液转移到干净的硅化管中。
      注: 微离心管也是确定的, 但硅化管是首选, 以防止蒸发在交联步骤 (步骤 2.3.12)。
    12. 加入300μl 蛋白酶 k (20mg/ml), 在65°c 下孵育过夜。
      注: 使用热敏管与加热盖, 以避免蒸发。
  4. rna 提取
    1. 加入580μl 的酸性-苯酚氯仿和涡旋, 在37°c 下进行1年的培养。
    2. 涡流为 30秒, 离心机在室温下为 12, 000 x g , 为10分钟。
    3. 将顶层转移到干净的 1.5 ml 微离心管中。加入 3 m naoac 的半容量, 0.5 微米的共沉淀剂 (如糖蓝), 以及等量的异丙醇。在-20°c 下过夜。
    4. 以最高速度在4°c 离心 1小时, 沉淀颗粒。
      注: 如果没有观察到 rna\ dna 颗粒, 则再添加0.5μl 的共沉淀剂和离心机, 再增加 1小时, 继续这一步骤, 直至观察到 rna/dna 颗粒。
    5. 去除上清液, 加入75% 乙醇1毫升。在4°c 下以 12, 000 x g 离心5分钟. 再重复一次清洗步骤。完全取出上清液, 在室温下干燥颗粒。
    6. 加入42μl 的 tdw、5μl 的 dnase i 缓冲液、1μl 的 rnase 抑制剂和2μl 的 dnase i. 在37°c 下培养1小时。
    7. 加入150μl 的 tdw 和200μl 的酸性-苯酚氯仿。涡流为 30秒, 在室温下离心 10分钟.
    8. 将顶层转移到干净的 1.5 ml 微离心管中。加入20μl 的 3 m naoac, 0.5μl 的共沉淀剂, 和1毫升的100% 乙醇。在-80°c 下过夜。
    9. 沉淀颗粒和清洗与75% 乙醇如步骤所述 2.4.4 2.4.5。
    10. 以适当数量的 tdw 重新暂停。

3. 测序库准备

  1. rrna 去除
    1. 用28μl 的 tdw 从步骤2.4.10 重新悬浮 rna 颗粒。
      注: 总 rna 的最大数量应小于5微克。
    2. 按照 rrna 去除试剂盒的参考指南提供的程序进行删除 rrna。
    3. 通过添加160μl 的磁珠来清理 rrna 耗尽的 rRNA。
      1. 通过移液量 ~ 15次混合, 在室温下孵育15分钟。
      2. 将管子连接在磁性棒上, 并取出上清液。
      3. 加入300μl 的80% 乙醇, 而珠子仍然附着在磁条上, 孵育30秒。
      4. 用新鲜的300μl 溶液取代乙醇。在室温下, 空气干燥磁棒上的珠子12分钟。
      5. 将珠子重新悬浮在12μl 的 tdw 中, 然后通过移液15次混合。
      6. 将磁珠连接在磁条上, 并将上清液移动到干净的 pcr 管上。
    4. 按照 rrna 消耗试剂盒提供的程序, 检测分散的核糖体 rna (rrna)。
    5. 通过添加110μl 磁珠和重复步骤 3.1.3.1 3.1.3.6 来清洁 rna。
  2. rna 标记和适应剂结扎
    1. 在 rra-耗尽 rna 上, 加入2μl 的 10倍 ciap 缓冲液、1μl 的 rnase 抑制剂和2μl 的南极碱性磷酸酶。在37°c 下孵化 1小时, 然后在65°c 下孵化5分钟以激活磷酸酶。
    2. 加入3μl 的 10倍 pnk 缓冲液、1.5μl 的 rnase 抑制剂、1.5μl 的 t4 pnk 酶、0.8μl 的 r-atp 和1.7μl 的 tdw。在37°c 下孵化50分钟。
    3. 加入1.5 μl 的 10 mm atp, 在37°c 孵育, 再延长40分钟。
    4. 通过添加170μl 的 rna 洗脱缓冲液来停止反应。
    5. 加入200μl 的酸性苯酚氯仿和涡旋, 30s. 在室温下离心 10分钟, 离心时间为 12, 000 x 克。
    6. 将顶层转移到干净的 1.5 ml 微离心管中。加入20μl 的 3 m naoac, 0.5μl 的共沉淀剂, 和1毫升的100% 乙醇。在-80°c 下过夜。
    7. 沉淀 rna 颗粒, 并在 2.4.4 2.4.5 的步骤中所述, 用75% 的乙醇进行洗涤。在 tdw 的4.5μl 中重新悬浮, 并加入9μl 的 2x rna 加载染料。
    8. 在95°c 下加热样品 5分钟, 并在 10% urea-page 凝胶上加载。
    9. 在 370 v 处运行凝胶40分钟。
      注: 在加载样品之前, 请将凝胶在 370 v 处预置90分钟。
    10. 在 ~ 100–500核苷酸区域切割凝胶并破坏凝胶。
    11. 加入 300μl 0.3 m 氯化钠, 在4°c 下旋转孵育过夜。
    12. 在室温下以最高速度将溶液转移到色谱柱和离心机上5分钟。
    13. 将洗脱液转移到干净的 1.5 ml 微离心管中。加入 3 m naoac 的半体积, 0.5μl 的共沉淀剂, 和等量的异丙醇。在-20°c 下过夜。
  3. 3 ' 适配器结扎
    1. 沉淀 rna 颗粒, 并在 2.4.4 2.4.5 的步骤中所述, 用75% 的乙醇进行洗涤。
    2. 在6.5μl 的 tdw 中重新悬浮 rna 颗粒, 并添加 1μl 10μm3 的适配器。
    3. 将溶液转移到 pcr 管, 在70°c 孵育2分钟。
    4. 加入1μl 的10倍结扎缓冲液, 0.5μl 的 rnase 抑制剂, 1μl 的 t4 rna 连接酶2。在28°c 下培养 1小时, 25°c 6小时, 22°c 6年。
    5. 加入12μl 的 2x rna 加载染料, 并在95°c 下加热5分钟。
    6. 凝胶净化 3 ' 适配器结扎的 rna, 如3.2.9 所述, 以3.2.13。
  4. 5 ' 适配器结扎
    1. 沉淀 rna 颗粒, 并在 2.4.4 2.4.5 的步骤中所述, 用75% 的乙醇进行洗涤。
    2. 在 tdw 的4.2μl 中重新悬浮 rna 颗粒, 并添加 1μl 5μm 5 的适配器。
    3. 将溶液转移到 pcr 管, 在70°c 孵育2分钟。
    4. 加入0.8μl 的10倍连接酶缓冲液, 0.4μl 的 rnase 抑制剂, 0.8μl 的 10 mm atp, 0.8μl 的 t4 rna 连接酶1。在28°c 下培养 1小时, 25°c 6小时, 22°c 6年。
  5. 逆转录酶和 pcr 扩增
    1. 在 5 ' 适配器连接 rna 上, 加入 1μl 4μm 逆转录引物。在70°c 下孵化 2分钟, 立即冷却至4°c。
    2. 加入4μl 的 5x fs 缓冲液、4μl 的 2.5 mm dntp、1μl 的 0.1 m dNTP、1μl 的 rnase 抑制剂和1μl 的逆转录酶。在50°c 下孵化 1小时, 70°c 孵化15分钟。
    3. 准备 pcr 扩增
      1. 混合 rt 产品的1μl、25μm rpi 底漆的1μl、25μm rp1 底漆的1μl、5xhf 缓冲液的10μl、2.5 mm dntp 的4μl、32.5μl 的 tdw 和0.5μl 的高保真聚合物酶。
      2. 运行 pcr 程序 11 ~ 13个周期。
        注: pcr 程序为: 98°c 为 30秒, 98°c 为 10秒, 60°c 为 30秒, 72°c 为 45秒, 72°c 为5分钟。放大步骤重复11-13 周期。
    4. 使用40μl 的磁珠清洁 pcr 产品, 并按照以下步骤 3.1.3.1 3.1.3.6 但使用10μl 的 tdw 来清除 dna。
    5. 加入2μl 的 10倍 dna 加载染料。将样品装上6% 的丙烯酰胺凝胶, 以 200 v 的速度运行30分钟。
    6. 在室温下, 用 sybr 金染色 5分钟 (1x tbe 缓冲液中的 0.01% (v/v)。
    7. 在室温下在 1x tbe 缓冲液中脱层5分钟。
    8. 在 ~ 200–700核苷酸区域切割凝胶并破坏凝胶。
    9. 加入 300μl 0.3 m 氯化碳, 在室温下孵育一夜, 以洗脱 dna。
    10. 在室温下, 以最高速度将所有内容加载到立柱和离心机上, 时间为5分钟。
    11. 将洗脱液转移到干净的 1.5 ml 微离心管中。加入 3 m naoac 的半体积, 0.5μl 的共沉淀剂, 和等量的异丙醇。在-20°c 下过夜。
    12. 如 2.4.4 2.4.5 的步骤所述, 用75% 的乙醇沉淀 dna 颗粒并进行洗涤。在20μl 的 tdw 中重新悬浮。
    13. 使用排序器分析示例。

4. 利用 qrt-pcr 分析 pkr 相互作用的 rna

  1. 方法 1: 随机六边形逆转录酶
    1. 用8.5μl 的 tdw 从步骤2.4.10 重新悬浮 rna 颗粒, 并将溶液转移到 pcr 管中。
    2. 加入0.5μl 的100μm 随机高架, 加入4μl 的 2.5 mm dntp 混合。
    3. 在65°c 下加热溶液 5分钟, 并立即在冰上孵育至少1分钟。
    4. 反应混合: 5x ssiv 缓冲液的4μl、100 mm dtt 的1μl、rnase 抑制剂的1μl 和逆转录酶的 1μl (200uμ-l)。将反应混合物添加到 rna 溶液中。
    5. 将混合物在23°c 下培养 10分钟, 50°c 10分钟, 80°c, 10分钟。
    6. 使用实时 pcr 系统分析 cdna。
      注: 实时 pcr 程序为: 95°c 为热启动 3分钟, 95°c 为 5秒, 60°c 为 10秒, 95°c 为 30秒, 65°c 为 30秒, 95°c 为熔体。放大步骤重复40个周期。
  2. 方法 2: 征方特异性逆转录酶
    1. 制备反向引物的主混合物: 混合含有 cmv 启动子序列的基因特异性逆转录引物的等量, 然后是基因特异性序列的 ~ 20个核苷酸。
      注: 所有基因特异性 rt 引物的联合浓度为4μm。
    2. 用8.5μl 的 tdw 从步骤2.4.10 重新悬浮 rna 颗粒, 并将溶液转移到 pcr 管中。
    3. 加入0.5μl 的4μm 主混合逆转录酶引物和 4μl 2.5 mm dntp 混合。
    4. 在65°c 下加热溶液 5分钟, 并立即在冰上孵育至少1分钟。
    5. 通过混合4μl 的 5倍 ssiv 缓冲液、1μl 的 100 mm dtt、1μl 的 rnase 抑制剂和1μl 的逆转录酶 (200 ueμl) 来制备反应溶液。将反应溶液添加到 rna 底漆混合物中。
    6. 在50°c 下将溶液生也就是 10分钟, 在80°c 下孵化10分钟。
    7. 利用实时 pcr 系统对 cdna 进行分析。
      注: 实时 pcr 程序与方法1中描述的程序相同。

结果

图 1显示了在细胞周期的 s 或 m 阶段逮捕 hela 细胞的过程示意图。对于 m 相抑制样本, 我们可以在显微镜下清楚地显示圆形细胞 (图 2a)。为了检查细胞周期抑制的效率, 可以使用流式细胞仪分析细胞的核含量 (图 2b)。图 3显示了免疫沉淀效率测试的代表性数据, d7f7 抗体显示出优于免疫沉淀 pkr 的能力。免疫沉淀效率的这种差...

讨论

图 1显示了制备 s 或 m 相抑制样本的过程。为了在 s 期的细胞中, 我们使用了胸苷双块法, 我们用胸苷对细胞进行了两次处理, 中间释放了 9小时, 以确保较高的逮捕效率 (图 1 a)。对于 m 期停止, 我们用胸苷治疗细胞一次, 然后释放 9小时, 然后应用诺康唑在启动基中阻断细胞 (图 1b)。准备细胞周期样本的一个关键步骤是在第一个胸苷?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了韩国国家研究基金会通过韩国政府科学和信息通信技术部资助的韩国国家研究基金会 (nrf-2016r1c1b29886) 的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9260G
1 M Tris, pH 7.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1 M Tris, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1.7 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40)BiosolutionBN015
10X DNA loading bufferTaKaRa9157
15 mL conical tubeSPL50015
3' adaptor5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'
3 M Sodium Acetate pH 5.5Thermo Fisher ScientificAM9740
5' adaptor5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaClThermo Fisher ScientificAM9760G
50 mL conical tubeSPL50050
Acid-phenol chloroform, pH 4.5Thermo Fisher ScientificAM9722
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Magnetic beads DNA/RNA clean up
Antarctic alkaline phosphataseNew England BiolabsM0289S
Anti-DGCR8Made in house
Anti-PKR (D7F7)Cell signaling technology12297S
Anti-PKR (Milli)Millipore EMD07-151
ATP (100 mM)GE HealthcareGE27-2056-01
Bromophenol blue sodium saltSigma-aldrichB5525
Calf intestinal alkaline phosphataseTaKaRa2250A
Cell scraper 25 cm 2-positionSarstedt83.183
CMV promoter sequence5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
Dulbecco's modified eagle mediumWelgeneLM001-05
dNTP mixture (2.5 mM)TaKaRa4030
Ethanol, Absolute, ACS GradeAlfa-AesarA9951
Fetal bovine serumMerckM-TMS-013-BKR
FormamideMerck104008
GlycineBio-basicGB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL)Thermo Fisher ScientificAM9516
IsopropanolMerck8.18766.1000
NEBNext rRNA Depletion KitNew England BiolabsE6318rRNA Depletion Kit
NocodazoleSigma-AldrichM1404
Normal rabbit IgGCell signaling technology2729S
ParaformaldehydeSigma-Aldrich6148
PCR forward primer (RP1)5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCR index reverse primer (RPI)5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'
PCR tubes with flat cap, 0.2 mLAxygenPCR-02-C
Phosphate bufered saline (PBS) TabletTaKaRaT9181
Phusion high-fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530High-fidelity polymerase
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotorBenchmarkc2000
Polynucleotide kinase (PNK)TaKaRa2021A
Proteinase K, recombinant, PCR GradeSigma-Aldrich3115879001
qPCR primer sequence: CO1 HeavyForward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO1 LightForward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 HeavyForward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 LightForward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 HeavyForward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 LightForward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB HeavyForward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB LightForward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: GAPDHForward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 HeavyForward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 LightForward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 HeavyForward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 LightForward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 HeavyForward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 LightForward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 HeavyForward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 LightForward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Random hexamerThermo Fisher ScientificSO142
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL)TaKaRa2270A
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL)TaKaRa2313A
Ribo-Zero rRNA Removal KitIlluminaMRZH116rRNA Removal Kit
RotatorFINEPCR, ROTATOR AGD1.5-32
RT primer sequence: CO1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RT primer sequence: CO1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RT primer sequence: CO2 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RT primer sequence: CO2 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RT primer sequence: CO3 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RT primer sequence: CO3 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
RT primer sequence: CYTB Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RT primer sequence: CYTB Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
RT primer sequence: GAPDH5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
RT primer sequence: ND1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′
RT primer sequence: ND1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
RT primer sequence: ND4 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
RT primer sequence: ND4 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
RT primer sequence: ND5 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
RT primer sequence: ND5 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RT primer sequence: ND6 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RT primer sequence: ND6 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tubeBio Plas4167SLS50
Sodium dedecyl sulfateBiosesangS1010
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
SUPERase In Rnase inhibitorThermo Fisher ScientificAM2694
SuperScript III reverse transcriptaseThermo Fisher Scientific18080093Reverse transcriptase for library preparation
SuperScript IV reverse transcriptaseThermo Fisher Scientific18090010Reverse transcriptase for qRT-PCR
SYBR gold nucleic acid gl stainThermo Fisher ScientificS11494
T4 polynucleotide kinaseNew England BiolabsM0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)New England BiolabsM0204
T4 RNA ligase 2, truncated KQNew England BiolabsM0373
ThermomixerEppendorf ThermoMixer C with ThermoTop
ThymidineSigma-AldrichT9250
Tris-borate-EDTA buffer (TBE)TaKaraT9122
Triton X-100PromegaH5142
Ultralink Protein A sepharose beadsThermo Fisher Scientific22810Protein A beads
UltrasonicatorBioruptor
UreaBio-basicUB0148
Vortex mixerDAIHAN ScientificVM-10
Xylene cyanolSigma-AldrichX4126
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM)PerkinElmerBLU502A100UC

参考文献

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