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Resumen

Presentamos aproximaciones experimentales para estudiar interactianos de RNA de doble cadena RNA Unión proteína quinasa RNA-activado (PKR) durante el ciclo celular mamífero con células HeLa. Este método utiliza formaldehído complejos RNA-PKR la reticulación y la inmunoprecipitación para enriquecer PKR-limite RNAs. Estos RNAs pueden analizarse más a través de la secuenciación de alto rendimiento o qRT-PCR.

Resumen

Kinase de proteína RNA-activado (PKR) es un miembro de las proteínas de la respuesta inmune innata y reconoce la estructura secundaria de doble cadena de ARN viral. Cuando se enlaza a los RNAs virales de doble hebra (dsARN), PKR experimenta la dimerización y autophosphorylation posterior. PKR fosforilada (pPKR) se activa e induce la fosforilación de la subunidad alfa del factor de iniciación eucariota 2 (eIF2α) para suprimir el traductor global. Creciente evidencia sugiere que PKR puede activarse en condiciones fisiológicas durante el ciclo celular o bajo diferentes condiciones de estrés sin infección. Sin embargo, nuestra comprensión de los activadores de RNA de PKR es limitado debido a la falta de un método experimental estandarizado para capturar y analizar la interacción PKR dsRNAs. Aquí, presentamos un experimental protocolo específicamente enriquecer y analizar PKR obligado RNAs durante el ciclo celular con células HeLa. Utilizamos la actividad eficiente de la reticulación de formaldehído para fijar complejos ARN-PKR y aislarlos mediante inmunoprecipitación. PKR co-immunoprecipitated RNAs pueden entonces ser procesados para generar una biblioteca de secuenciación de alto rendimiento. Una clase importante de dsRNAs celular interactuando PKR es RNAs mitocondriales (mtRNAs), que pueden existir como dsRNAs intermolecular a través de la interacción complementaria entre la cadena pesada y las RNAs de filamento de la luz. Para estudiar el strandedness de estos mtRNAs duplex, también presentamos un protocolo específico de filamento qRT-PCR. Nuestro protocolo está optimizado para el análisis de PKR-limite RNAs, pero puede ser fácilmente modificado para estudiar celular dsRNAs o RNA-interactianos de otras proteínas de Unión dsRNA.

Introducción

La proteína quinasa RNA-activado (PKR), también conocido como eucariótico de iniciación factor 2-alfa 2 (EIF2AK2), es una quinasa bien caracterizado que transmite informaciones de RNAs. Pertenece a la alfa de la subunidad de iniciación 2 traducción en eucariotas (eIF2α) familia cinasa y fosforila eIF2α en serina 51 en respuesta a la infección para suprimir traductor global1. En este contexto, el PKR es activado por RNAs virales de doble hebra (dsARN), que proporcionan una plataforma para PKR dimerización y autophosphorylation2. Además de eIF2α, PKR puede también fosforilan p53, sustrato del receptor de insulina 1, inhibidor κB y c-Jun N-terminal quinasa (JNK) para regular la actividad de numerosas señales de transducción vías3,4,5, 6.

PKR fue identificado originalmente como una quinasa que fosforila eIF2α durante la infección por poliovirus por reconocimiento dsRNAs7,8 de poliovirus. PKR se encuentra cada vez más para jugar múltiples roles más allá de la respuesta inmune, y su activación aberrante o mal funcionamiento está implicado en numerosas enfermedades humanas. Activado/Phosphorylated PKR (pPKR) se observa con frecuencia durante la apoptosis y es una característica común de pacientes con enfermedades crónico-degenerativas, particularmente las enfermedades neurodegenerativas como la de Huntington, Parkinson y la enfermedad de Alzheimer9 ,10,11,12,13. Además, PKR se activa bajo diferentes condiciones de estrés como la tensión metabólica y calor choque14,15,16,17. Por otra parte, inhibición de PKR resultado creciente de la célula proliferación y transformación maligna hasta18,19. Función PKR también es importante en la función normal del cerebro y durante el ciclo celular como el nivel de pPKR es elevada durante la fase M20,21,22. En este contexto, pPKR suprime traductor global y proporciona señales para sistemas de señalización mitóticos clave que se requieren para la correcta división celular20. Por otra parte, la activación prolongada de PKR resultó en fase G2/M23de las células de la detención del ciclo celular de ovario de hámster chino. En consecuencia, la fosforilación PKR está regulada por el bucle de retroalimentación negativa para asegurar la rápida desactivación durante de transición M/G121.

A pesar de la función de la amplia gama de PKR, nuestro entendimiento de la activación de PKR es limitado debido a la falta de un enfoque experimental estandarizado de alto rendimiento para capturar e identificar los dsRNAs que puede activar PKR. Estudios anteriores han demostrado que PKR puede interactuar con dsRNAs formado por dos invertido Alu repeticiones (IRAlus)20,24, pero la posibilidad de la existencia de dsRNAs celular adicional que puede activar PKR durante el ciclo celular o bajo condiciones de estrés en células humanas era inexplorado. El enfoque convencional en la identificación de RNA-interactianos de una proteína de unión a RNA (RBP) utiliza luz ultravioleta para reticulación RNA-RBP complejos25,26,27. Un estudio reciente había aplicado este método de reticulación UV en un sistema de ratón e identificó que RNAs nucleolares pequeño pueden regular la activación de PKR durante el estrés metabólico16. Utilizando eficiencia alta reticulación de formaldehído, presentamos un método alternativo para identificar RNAs PKR interactuando durante el ciclo celular en células de HeLa28. Un enfoque similar se ha aplicado para estudiar otras dsRBPs como Staufen y Drosha29,30,31. Encontramos que PKR puede interactuar con varios tipos de RNAs noncoding como corto elemento nuclear entremezclado (seno), largo había entremezclado elemento nuclear (línea), el elemento de retrovirus endógeno (ERV) y RNAs incluso alfa satélite. Además, nos demostró que PKR puede interactuar con el ARN mitocondrial (mtRNAs), que forma de dsRNAs intermolecular a través de la interacción complementaria entre la cadena pesada y la luz del filamento RNAs28. Una publicación reciente apoyado nuestros datos que algunos mtRNAs en forma de dos caras y puede activar sensores de dsARN como melanoma diferenciación asociada a proteina 5 inducir interferones32. Más importante aún, la expresión y localización subcelular de mtRNAs son moduladas durante el ciclo celular y por diversos factores de estrés, que puede ser importante en su capacidad para regular la activación de PKR28.

En este artículo, presentamos un protocolo detallado para una reticulación de formaldehído desarrollado recientemente y la inmunoprecipitación (fCLIP) método para capturar y analizar RNAs PKR interactuando durante el ciclo celular. Se demuestra el método para preparar muestras de detención del ciclo celular mediante timidina y nocodazole. A continuación presentamos el proceso de fCLIP para aislar RNAs PKR-limite y un método para preparar la biblioteca de secuenciación de alto rendimiento para identificar estos RNAs. Además, delinean los procedimientos detallados para analizar RNAs PKR-limita uso de qRT-PCR. En concreto, presentamos un procedimiento de transcripción reversa filamento específico para analizar el strandedness de mtRNAs. El protocolo descrito está optimizado para las células HeLa y PKR, pero pasos como la preparación de la muestra del ciclo celular, fCLIP y análisis específicos de filamento qRT-PCR pueden modificarse fácilmente para estudiar celular dsRNAs o identificar interactianos de RNA de otros dsRBPs.

Protocolo

1. solución y célula preparación

  1. Preparación de la solución
    1. Para el medio de cultivo celular, preparar medio de cultivo de células HeLa añadiendo 50 mL de suero bovino fetal (FBS) a 500 mL de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM).
      Nota: Pueden añadirse antibióticos al medio de cultivo celular, pero no utilizamos antibióticos.
    2. Para el 0,1% paraformaldehido, disolver paraformaldehído al 4% (p/v) de 1 x Phosphate-Buffered salino (PBS) con calefacción en un plato caliente y diluido para hacer 30 mL de paraformaldehído al 0,1% (v/v) mediante la adición de 1 x PBS.
      PRECAUCIÓN: Realizar todos los pasos en una campana de humos y tenga cuidado de no hervir la solución de paraformaldehído. Proteger la solución al 0.1% de la luz y almacenar a 4 ° C. Usar la solución dentro de un mes.
      Nota: El pH de la solución de paraformaldehído al final de 0,1% (v/v) debe ser alrededor de 7.
    3. Preparación de buffer de lisis de fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1% Tritón X-100, (v/v) 0,1% (v/v) sodio dodecil sulfato (SDS) y desoxicolato de sodio 0,1% (p/v). Añadir agua destilada triple (TDW) a 40 mL. Almacenar a 4 ° C.
    4. Preparar el tampón de lavado fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% (v/v) NP-40, 0,1% Tritón X-100 (v/v) 0,1% (v/v) SDS y 0.1% (p/v) desoxicolato de sodio. Añadir capacidad a 40 mL. Almacenar a 4 ° C.
    5. Preparar 4 x buffer de PK: 400 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA y SDS 4% (v/v). Añadir capacidad a 40 mL. Almacenar a temperatura ambiente.
    6. Preparar el tampón de elución de fCLIP: 20 mL de 4 x PK tampón, 21 g de urea y 8,5 mL de capacidad. Preparar fresco.
    7. Preparar el tampón de elución de RNA: 0,3 M NaOAc y SDS 2% (w/v). Almacenar a temperatura ambiente.
    8. Preparar 2 x tinte de carga RNA: azul de bromofenol 0.025% (w/v), 0.025% (w/v) xileno cyanol, EDTA 5 mM, 0.05% (p/v) de SDS y formamida de 95% (v/v). Almacenar a-20 ° C.
    9. Preparación de buffer de x TBE 1: 0.089 M Tris borato y 0.002 M EDTA. Preparar 500 mL de tampón TBE.
  2. Preparación de células detenidas en fase S o M
    1. Semilla 750.000 ~ o ~ 1.000.000 HeLa células para muestras detenido en fase S o M, respectivamente. Crecen las células a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 h.
    2. Tratar las células con timidina de 2 mM e incubar durante 18 h a 37 ° C.
    3. Lavan las células dos veces con PBS. Añadir medio fresco e incubar de 9 h a 37 ° C.
    4. Para las células detenidas en fase S, tratar las células con timidina 2 mM. Para las células detenidas en fase M, tratar las células con 100 ng/mL nocodazole. Incubar por 15 h a 37 ° C y la cosecha de las células.
      Nota: La homogeneidad de las muestras del ciclo celular puede ser comprobada utilizando FACS.

2. formaldehído Cross-linking e inmunoprecipitación

  1. Cosecha de células
    1. Para una muestra de fase S, recoger las células con un raspador celular y transferencia en un tubo cónico de 15 mL. Para una muestra de fase M, toque en el lado de la placa de cultivo celular para separar células detenidas en fase M y transferirlos a un tubo cónico de 15 mL.
      Nota: Para aumentar la homogeneidad de las células detenidas en fase M, use un raspador celular.
    2. Centrifugar las células a 380 x g a temperatura ambiente durante 3 minutos Retire el sobrenadante y resuspender con 1 mL de PBS frío y la transferencia en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    3. Centrifugar las células a 10.000 x g a 4 ° C durante 30 s. Retire el sobrenadante completamente.
  2. Reticulación de formaldehído
    1. Añadir 750 μL de paraformaldehído al 0.1% durante 10 min a temperatura ambiente para fijar las células.
    2. Añadir 250 μL de glicina de 1 M e incubar un adicional 10 min a temperatura ambiente para calmar la reacción. Centrifugar las células a 10.000 x g a 4 ° C durante 30 s. Retire el sobrenadante completamente.
    3. Vuelva a suspender con 1 mL de PBS. Centrifugar las células a 10.000 x g a 4 ° C para 30 s y eliminar el sobrenadante.
    4. Resuspender con 400 μL de tampón de lisis fCLIP suplementado con 0.2% (v/v) inhibidor de la proteasa y el 2% (v/v) inhibidor de la Rnasa. Incubar en hielo por 10 min y someter a ultrasonidos usando un ultrasonicador.
    5. Añadir 11 μL de 5 M de NaCl para ajustar la concentración de NaCl a ~ 150 mM. Vortex brevemente y centrifugue a 21.130 x g a 4 ° C durante 15 minutos transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL previamente enfriada.
      Nota: Conservar 40 μL del sobrenadante en un tubo de centrífuga nueva como la muestra de entrada. Tienda la entrada muestra a 4 ° C.
  3. Inmunoprecipitación
    1. Añadir 20 μL de perlas de proteína A en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Lavar los granos con 400 μL de tampón de lisis fCLIP. Centrifugue los granos a 1.000 x g a 4 ° C durante 1 minuto, retirar el sobrenadante y añadir 400 μL de tampón de lisis fCLIP cuidadosamente. Suavemente, vuelva a suspender las cuentas invirtiendo 3 ~ 4 veces.
    3. Repetir el lavado tres veces. Después del último lavado, eliminar completamente el sobrenadante.
    4. Vuelva a suspender las cuentas en 300 μL de tampón de lisis de fCLIP. Añadir 8,3 μL de 5 M de NaCl para ajustar la concentración de NaCl a ~ 150 mM. Añadir 10 μL del anticuerpo PKR e incubar durante 3 h en un rotador a 4 ° C.
    5. Centrifugue los granos a 1.000 x g a 4 ° C durante 1 minuto, retirar el sobrenadante y añadir 400 μL de tampón de lavado fCLIP. Suavemente, vuelva a suspender las cuentas invirtiendo 3 ~ 4 veces.
    6. Repetir el lavado dos veces. Después del último lavado, eliminar completamente el sobrenadante.
      Nota: Nunca use un mezclador de tipo vórtex. Invertir el tubo suavemente con las manos.
    7. Añadir 300 μL de lisado e incubar durante 3 h a 4 ° C en un agitador.
      Nota: Tiempo de incubación más largo puede resultar en el enlace de mayor fondo.
    8. Centrifugue los granos a 1.000 x g a 4 ° C durante 1 minuto, retirar el sobrenadante y añadir 400 μL de tampón de lavado fCLIP. Suavemente, vuelva a suspender las cuentas invirtiendo 3 ~ 4 veces.
    9. Repetir el lavado tres veces. Después del último lavado, eliminar completamente el sobrenadante.
    10. Añadir 300 μL de tampón de elución de fCLIP. Incubar en un Termomezcladores de 3 h a 25 ° C a fin de eluir PKR de los granos.
      Nota: Preparar el fresco de buffer de elución de fCLIP.
    11. Centrifugar a 1.000 x g a temperatura ambiente y transferir el sobrenadante a un tubo siliconado limpio.
      Nota: Un tubo de microcentrífuga es también aceptable, pero es preferible tubo siliconado para evitar la evaporación durante el reticulación de paso (2.3.12).
    12. Añadir 300 μL de proteinasa K (20 mg/mL) e incubar durante la noche a 65 ° C.
      Nota: Utilice un Termomezcladores con cubierta climatizada para evitar la evaporación.
  4. Extracción de RNA
    1. Añadir 580 μL de ácido fenol cloroformo y agitar por 30 s. incubar a 37 ° C durante 1 hora.
    2. Vortex por 30 s y centrifugar a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    3. Transferir la capa superior en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL. Añadir el 1/10 volumen de NaOAc 3 M, 0,5 μL de coprecipitant (e.g., Glycoblue) y un volumen igual de isopropanol. Incubar durante una noche a-20 ° C.
    4. Precipitar el pellets por centrifugación a velocidad máxima a 4 ° C durante 1 hora.
      Nota: Si no se observaron gránulos de ARN/ADN, agregar un adicional 0,5 μL de coprecipitant y centrifugar durante un adicional 1 h. continuar este paso hasta que se observan gránulos de ARN/ADN.
    5. Quite el sobrenadante y agregar 1 mL de alcohol etílico al 75%. Centrifugar a 12.000 x g a 4 ° C por 5 min repetir el lavado una vez más. Quite completamente el sobrenadante y secar el precipitado a temperatura ambiente.
    6. Añadir 42 μL de TDW, 5 μL de DNasa buffer, 1 μL de inhibidor de la Rnasa y 2 μL de DNasa I. incubar a 37 ° C durante 1 hora.
    7. Añadir 150 μL de TDW y 200 μL de ácido fenol cloroformo. Vortex por 30 s. Centrifugar a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    8. Transferir la capa superior en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL. Añadir 20 μL de 3 M NaOAc, 0.5 μL de coprecipitant y 1 mL de alcohol etílico de 100%. Incubar durante una noche a-80 ° C.
    9. Pellets de precipitar y lavar con alcohol etílico al 75% como se describe en pasos 2.4.4 para 2.4.5.
    10. Vuelva a suspender en la cantidad apropiada de TDW.

3. secuencia biblioteca elaboración

  1. retiro de rRNA
    1. Vuelva a suspender los pellets de RNA de paso 2.4.10 con 28 μL del PST.
      Nota: La máxima cantidad de ARN total debe ser menos de 5 μg.
    2. Seguir los procedimientos previstos por la guía de referencia del kit de extracción de rRNA para quitar rRNA.
    3. Limpiar rRNA había agotado ARN mediante la adición de 160 μL de bolas magnéticas.
      1. Mezclar mediante pipeteo ~ 15 veces e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
      2. Conecte el tubo de una barra magnética y eliminar el sobrenadante.
      3. Añadir 300 μL de alcohol etílico 80% mientras que los granos estén fijados en la barra magnética e incuban durante 30 s.
      4. Reemplazar el alcohol etílico con una solución fresca de 300 μL. Secar los granos en la barra magnética durante 12 minutos a temperatura ambiente.
      5. Vuelva a suspender las cuentas en 12 μL de TDW y mezclar mediante pipeteo 15 veces.
      6. Coloque los granos en la barra magnética y trasladar el sobrenadante a un tubo limpio de PCR.
    4. Agotan las fragmentada RNAs ribosomal (rRNAs) siguiendo los procedimientos previstos por rRNA Kit de agotamiento.
    5. Limpiar el ARN añadiendo 110 μL de granos magnéticos y repitiendo pasos 3.1.3.1 a 3.1.3.6.
  2. Ligadura de etiquetado y adaptador de RNA
    1. En RNAs rRNA-agotado, añadir 2 μL de tampón de x CIAP 10, 1 μL de inhibidor de la Rnasa y 2 μL de la fosfatasa alcalina Antártica. Incubar a 37 ° C por 1 h y luego a 65 ° C por 5 min inactivar la fosfatasa.
    2. Agregar 3 μL de tampón de x PNK 10, 1,5 μL de inhibidor de la Rnasa, 1,5 μL de enzima T4 PNK, 0,8 μL de r-ATP y 1,7 μL del PST. Incubar a 37 ° C por 50 minutos.
    3. Añadir 1,5 μL de 10 mM ATP e incubar a 37 ° C durante 40 minutos adicionales.
    4. Detener la reacción agregando 170 μL del buffer de elución de RNA.
    5. Añada 200 μL de ácido fenol cloroformo y agitar durante 30 s. Centrifugar a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    6. Transferir la capa superior en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL. Añadir 20 μL de 3 M NaOAc, 0.5 μL de coprecipitant y 1 mL de alcohol etílico de 100%. Incubar durante una noche a-80 ° C.
    7. Precipitar el pellet de RNA y lavar con alcohol etílico al 75% como se describe en pasos 2.4.4 para 2.4.5. Vuelva a suspender en 4.5 μL del PST y añadir 9 μL de 2 x tinte carga de RNA.
    8. Calentar la muestra a 95 ° C por 5 min y carga en un gel de Urea-PAGE 10%.
    9. Correr el gel a 370 V durante 40 minutos.
      Nota: Ejecutar previamente el gel a 370 V durante 90 minutos antes de cargar la muestra.
    10. Corte el gel en la región de nucleótido de ~ 100 – 500 y romper el gel.
    11. Añadir 700 μL de 0,3 M de NaCl e incubar durante una noche a 4 ° C en un agitador.
    12. Transferir la solución a una columna y centrifugar a máxima velocidad a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    13. Transferir el eluido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL limpio. Añadir el 1/10 volumen de NaOAc 3 M, 0,5 μL de coprecipitant y un volumen igual de isopropanol. Incubar durante una noche a-20 ° C.
  3. 3' ligadura de adaptador
    1. Precipitar el pellet de RNA y lavar con alcohol etílico al 75% como se describe en pasos 2.4.4 para 2.4.5.
    2. Resuspender el pellet de RNA en 6,5 μL del PST y añadir 1 μL de 10 μM 3' adaptador.
    3. Transferir la solución a un tubo PCR e incubar a 70 ° C por 2 min.
    4. Añadir 1 μL de tampón de ligadura de 10 x, 0.5 μL de inhibidor de la Rnasa y 1 μL de ligasa de T4 RNA 2. Incubar a 28 ° C por 1 h, 25 ° C por 6 h y 22 ° C por 6 h.
    5. Añadir 12 μL de 2 x RNA carga tinte y calor a 95 ° C durante 5 minutos.
    6. Purificar de gel 3' adaptador ligarse RNAs como se describe en 3.2.9 a 3.2.13.
  4. 5' ligadura de adaptador
    1. Precipitar el pellet de RNA y lavar con alcohol etílico al 75% como se describe en pasos 2.4.4 para 2.4.5.
    2. Resuspender el pellet de RNA en μL 4,2 del PST y añadir 1 μL de 5 μM 5' adaptador.
    3. Transferir la solución a un tubo PCR e incubar a 70 ° C por 2 min.
    4. Agregar 0,8 μL de tampón de ligasa de x 10, 0.4 μL de inhibidor de la Rnasa, 0,8 μL de 10 mM ATP, 0,8 μL de ligasa de T4 RNA 1. Incubar a 28 ° C por 1 h, 25 ° C por 6 h y 22 ° C por 6 h.
  5. Transcripción reversa y amplificación por PCR
    1. 5' adaptador RNAs ligados, añadir 1 μL de cebador de transcripción inversa de 4 μM. Incubar a 70 ° C por 2 min y enfriar inmediatamente a 4 ° C.
    2. Añadir 4 μL de tampón de FS de x 5, 4 μL de 2.5 mM dNTP, 1 μL de 0,1 M TDT 1 μL de inhibidor de la Rnasa y 1 μL de transcriptasa reversa. Incubar a 50 ° C por 1 h y a 70 ° C por 15 minutos.
    3. Preparar la amplificación por PCR
      1. Mezclar 1 μL del producto de RT, 1 μL de cebador RPI de 25 μM, 1 μL de cebador de RP1 de 25 μM, 10 μL de 5 x buffer de HF, 4 μL de 2.5 mM dNTP, 32,5 μL del PST y 0,5 μL de polimerasa de alta fidelidad.
      2. Ejecutar programa PCR para 11 ~ 13 ciclos.
        Nota: El programa de la polimerización en cadena es: 98 ° C por 30 s para un arranque en caliente, 98 ° C por 10 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 45 s para la amplificación y 72 ° C durante 5 minutos. La etapa de amplificacion se repite por ciclos de 11-13.
    4. Limpiar los productos PCR usando 40 μL de los granos magnéticos y siguientes pasos 3.1.3.1 a 3.1.3.6 pero con 10 μL de capacidad a fin de eluir el ADN.
    5. Añadir 2 μL de colorante de carga de ADN de x 10. Cargar la muestra en un gel de acrilamida de 6% y ejecutar a 200 V durante 30 minutos.
    6. Tinción con Sybr oro (0.01% (v/v) en solución tampón de x TBE 1) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    7. La mancha en 1 x TBE solución tampón durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    8. Corte el gel en la región de ~ 200 – 700 nucleótidos y romper el gel.
    9. Añadir 700 μL de 0,3 M de NaCl e incubar durante la noche a temperatura ambiente a fin de eluir el ADN.
    10. Cargar todo en una columna y centrifugar a máxima velocidad a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    11. Transferir el eluido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL limpio. Añadir el 1/10 volumen de NaOAc 3 M, 0,5 μL de coprecipitant y un volumen igual de isopropanol. Incubar durante una noche a-20 ° C.
    12. Precipitar el DNA pellets y lavar con alcohol etílico al 75% como se describe en pasos 2.4.4 para 2.4.5. Resuspender en 20 μL del PST.
    13. Analizar la muestra utilizando un secuenciador.

4. Análisis de RNAs PKR interactuando mediante qRT-PCR

  1. Método 1: Random hexamer transcripción reversa
    1. Resuspender el pellet de RNA de paso 2.4.10 con 8,5 μL de TDW y transfiera la solución a un tubo PCR.
    2. Añadir 0,5 μL de 100 μM random hexamers y 4 μL de mezcla de dNTP 2,5 mM.
    3. Calor la solución a 65 ° C por 5 min e inmediatamente incubar en hielo durante al menos 1 minuto.
    4. Hacer la reacción de la mezcla: 4 μL de tampón de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM DTT, 1 μL de inhibidor de la Rnasa y 1 μL de transcriptasa reversa (200 U/μL). Añadir la mezcla de reacción a la solución de RNA.
    5. Incubar la mezcla a 23 ° C durante 10 min, 50 º C durante 10 min y 80 ° C durante 10 minutos.
    6. Analizar el cDNA utilizando un sistema PCR en tiempo real.
      Nota: El programa de la PCR en tiempo real es: 95 ° C por 3 min para arranque en caliente, 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 10 s para la amplificación y 95 ° C por 30 s, 65 ° C durante 30 s y 95 ° C para 30 s para derretir. La etapa de amplificacion se repite para 40 ciclos.
  2. Método 2: Filamento específico transcripción reversa
    1. Preparar una mezcla maestra de cartillas inversas: mezclar cantidades iguales de cartillas de reversa de la transcripción específico gen que contenga CMV promotor secuencia seguidas de ~ 20 nucleótidos de secuencias específicas de genes.
      Nota: La concentración combinada de todos los iniciadores RT de genes específicos es 4 μM.
    2. Resuspender el pellet de RNA de paso 2.4.10 con 8,5 μL de TDW y transfiera la solución a un tubo PCR.
    3. Agregar 0.5 μL de mezcla maestro de 4 μM de iniciadores de reversa de la transcripción y 4 μL de mezcla de dNTP 2,5 mM.
    4. Calor la solución a 65 ° C por 5 min e inmediatamente incubar en hielo durante al menos 1 minuto.
    5. Preparar la solución de reacción mezclando 4 μL de tampón de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM DTT, 1 μL de inhibidor de la Rnasa y 1 μL de transcriptasa reversa (200 U/μL). Añadir la solución de reacción a la mezcla de RNA cebador.
    6. Incubar la solución a 50 ° C por 10 min y 80 ° C durante 10 minutos.
    7. Analizar el cDNA usando el sistema PCR en tiempo real.
      Nota: El programa de la PCR en tiempo real es igual que el descrito en el método 1.

Resultados

Un esquema para el proceso de detención de las células HeLa en la fase S o M del ciclo celular se muestra en la figura 1. Para una muestra de fase detenido M, claramente podemos visualizar células redondas formadas bajo el microscopio (figura 2A). Para examinar la eficacia de la detención del ciclo celular, el contenido nuclear de la célula puede ser analizado utilizando FACS (figura 2B). La figura 3 muestra datos re...

Discusión

El proceso de preparación de muestras detenidas en fase S o M se ilustra en la figura 1. Para detener las células en la fase S, se utilizó un método de doble bloque de timidina donde tratamos las células con timidina dos veces con un lanzamiento de 9 h en el medio para asegurar eficacia de detención alto (figura 1A). De detención de la fase de M, tratamos a las células una vez con timidina seguido de un lanzamiento de 9 h y después se aplicaron nocodazo...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el gobierno de Corea Ministerio de ciencia y TIC (NRF-2016R1C1B2009886).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9260G
1 M Tris, pH 7.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1 M Tris, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1.7 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40)BiosolutionBN015
10X DNA loading bufferTaKaRa9157
15 mL conical tubeSPL50015
3' adaptor5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'
3 M Sodium Acetate pH 5.5Thermo Fisher ScientificAM9740
5' adaptor5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaClThermo Fisher ScientificAM9760G
50 mL conical tubeSPL50050
Acid-phenol chloroform, pH 4.5Thermo Fisher ScientificAM9722
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Magnetic beads DNA/RNA clean up
Antarctic alkaline phosphataseNew England BiolabsM0289S
Anti-DGCR8Made in house
Anti-PKR (D7F7)Cell signaling technology12297S
Anti-PKR (Milli)Millipore EMD07-151
ATP (100 mM)GE HealthcareGE27-2056-01
Bromophenol blue sodium saltSigma-aldrichB5525
Calf intestinal alkaline phosphataseTaKaRa2250A
Cell scraper 25 cm 2-positionSarstedt83.183
CMV promoter sequence5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
Dulbecco's modified eagle mediumWelgeneLM001-05
dNTP mixture (2.5 mM)TaKaRa4030
Ethanol, Absolute, ACS GradeAlfa-AesarA9951
Fetal bovine serumMerckM-TMS-013-BKR
FormamideMerck104008
GlycineBio-basicGB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL)Thermo Fisher ScientificAM9516
IsopropanolMerck8.18766.1000
NEBNext rRNA Depletion KitNew England BiolabsE6318rRNA Depletion Kit
NocodazoleSigma-AldrichM1404
Normal rabbit IgGCell signaling technology2729S
ParaformaldehydeSigma-Aldrich6148
PCR forward primer (RP1)5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCR index reverse primer (RPI)5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'
PCR tubes with flat cap, 0.2 mLAxygenPCR-02-C
Phosphate bufered saline (PBS) TabletTaKaRaT9181
Phusion high-fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530High-fidelity polymerase
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotorBenchmarkc2000
Polynucleotide kinase (PNK)TaKaRa2021A
Proteinase K, recombinant, PCR GradeSigma-Aldrich3115879001
qPCR primer sequence: CO1 HeavyForward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO1 LightForward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 HeavyForward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 LightForward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 HeavyForward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 LightForward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB HeavyForward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB LightForward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: GAPDHForward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 HeavyForward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 LightForward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 HeavyForward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 LightForward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 HeavyForward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 LightForward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 HeavyForward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 LightForward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Random hexamerThermo Fisher ScientificSO142
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL)TaKaRa2270A
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL)TaKaRa2313A
Ribo-Zero rRNA Removal KitIlluminaMRZH116rRNA Removal Kit
RotatorFINEPCR, ROTATOR AGD1.5-32
RT primer sequence: CO1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RT primer sequence: CO1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RT primer sequence: CO2 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RT primer sequence: CO2 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RT primer sequence: CO3 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RT primer sequence: CO3 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
RT primer sequence: CYTB Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RT primer sequence: CYTB Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
RT primer sequence: GAPDH5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
RT primer sequence: ND1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′
RT primer sequence: ND1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
RT primer sequence: ND4 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
RT primer sequence: ND4 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
RT primer sequence: ND5 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
RT primer sequence: ND5 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RT primer sequence: ND6 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RT primer sequence: ND6 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tubeBio Plas4167SLS50
Sodium dedecyl sulfateBiosesangS1010
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
SUPERase In Rnase inhibitorThermo Fisher ScientificAM2694
SuperScript III reverse transcriptaseThermo Fisher Scientific18080093Reverse transcriptase for library preparation
SuperScript IV reverse transcriptaseThermo Fisher Scientific18090010Reverse transcriptase for qRT-PCR
SYBR gold nucleic acid gl stainThermo Fisher ScientificS11494
T4 polynucleotide kinaseNew England BiolabsM0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)New England BiolabsM0204
T4 RNA ligase 2, truncated KQNew England BiolabsM0373
ThermomixerEppendorf ThermoMixer C with ThermoTop
ThymidineSigma-AldrichT9250
Tris-borate-EDTA buffer (TBE)TaKaraT9122
Triton X-100PromegaH5142
Ultralink Protein A sepharose beadsThermo Fisher Scientific22810Protein A beads
UltrasonicatorBioruptor
UreaBio-basicUB0148
Vortex mixerDAIHAN ScientificVM-10
Xylene cyanolSigma-AldrichX4126
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM)PerkinElmerBLU502A100UC

Referencias

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