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要約

HeLa 細胞を用いた哺乳類細胞周期中に二本鎖 RNA 結合蛋白質キナーゼ rna (PKR) 勉強 RNA インターアクターのための実験的アプローチを提案します。このメソッドは、クロスリンク RNA PKR 錯体と PKR バインド Rna を豊かにする免疫沈降にホルムアルデヒドを利用しています。これらの Rna は、高スループット シーケンスまたは qRT PCR からさらに分析できます。

要約

タンパク質キナーゼ (PKR) rna は生得の免疫反応蛋白質のメンバーであるし、ウイルス Rna の二重鎖の二次構造を認識します。ウイルスの二本鎖 Rna (二本) にバインドされると、PKR は二量体化とそれに続く自己リン酸化を受けます。リン酸化 PKR (pPKR) はアクティブになり、真核生物の開始因子 2 (神経: Eif2) グローバル翻訳を抑制する α サブユニットのリン酸化を誘導します。増加する証拠を PKR を細胞周期の間に生理学的な条件の下で、または感染せず様々 なストレス条件下で起動できるかを示唆しています。しかし、pkr からの RNA の活性剤の私達の理解はキャプチャし、二本の pkr から相互作用を分析する標準化された実験方法の不足のために限られました。ここでは、提案する実験的具体的に豊かにし、PKR を分析するためのプロトコルは HeLa 細胞を用いた細胞周期中に Rna をバインドします。我々 は、PKR RNA 複合体を修正し、免疫沈降で分離するホルムアルデヒドの効率的な架橋アクティビティを利用します。PKR co 沈澱 Rna は、高スループット シーケンス ライブラリを生成するさらに処理することができます。PKR と相互作用する細胞二本鎖 rna の 1 つの主要なクラスは、重鎖と光鎖 Rna の相補的な相互作用による分子鎖 Rna として存在できますミトコンドリア Rna (mtRNAs) です。これらの二重 mtRNAs の strandedness を勉強するには、本鎖固有 qRT PCR のためのプロトコル。私達のプロトコルは PKR バインド Rna の解析に最適化されますが、細胞二本や他の dsRNA の結合蛋白質の RNA インターアクターを研究する簡単に変更できます。

概要

プロテインキナーゼ rna (PKR)、として知られている真核生物の開始因子 2 α キナーゼ 2 (EIF2AK2) はよ特徴付けられた蛋白質キナーゼ Rna によって提供される情報を伝送します。それは真核生物の翻訳開始 2 サブユニット α (神経: Eif2) に属するキナーゼ家族とグローバル翻訳1を抑制して感染への応答でセリン 51 で神経: Eif2 を廃止します。このコンテキスト PKR は PKR 活性化と自己リン酸化2のプラットフォームを提供するウイルスの二本鎖 Rna (二本) によってアクティブ化されます。神経: Eif2、に加えて PKR できますもをリン酸化 p53、インスリン受容体基質 1、阻害剤 B、c 6 月 N 末端キナーゼ (JNK) 多数信号伝達経路3,4、5の活動を規制するには 6。

PKR はもともとポリオ ウイルスの伝染の間にポリオ ウイルスの二本7、8を認識することによって神経: Eif2 をリン酸化するキナーゼとして同定されました。PKR は昨今は免疫応答を超えて多面的な役割を果たすことと多くの人間の病気でその異常活性化や故障はございません。アクティブ/Phosphorylated PKR (pPKR) はアポトーシス中によく見られる、変性疾患、特にハンチントン病などの神経変性疾患、パーキンソンのおよびアルツハイマー病9 患者の共通の特徴 ,,1011,12,13。また、PKR は代謝ストレスや熱衝撃14,15,16,17など様々 なストレス条件下で作動します。その一方で、PKR 阻害は高められた細胞増殖とも悪性転化18,19の結果します。PKR 関数はまた正常な脳機能に重要なと pPKR のレベルとして細胞周期の間に高架 M 相20,21,22時。このコンテキストで pPKR はグローバルな翻訳を抑制する適切な細胞分裂20に必要なキーの分裂シグナル伝達システムへの手がかりを提供しています。また、pkr からの持続性の活性化は中国のハムスターの卵巣の細胞周期の停止細胞23G2/m 期で起因しました。その結果、PKR のリン酸化は、21M/G1 遷移中に急速な不活性化を確保するため負帰還ループによって調整されます。

PKR の広い範囲の機能にもかかわらず PKR 活性化の私達の理解は、キャプチャし、PKR をアクティブにすることができます二本を識別する標準化されたハイスループット実験的アプローチの不足のため制限されています。前の研究は、PKR を二本 2 倒立 Alu 反復 (IRAlus)20,24が、細胞周期の間にまたはの下で PKR をアクティブにすることができます追加の細胞二本鎖 rna の存在の可能性によって形成されるやり取りできること示されています。ひと細胞におけるストレス条件は探検でした。RNA 結合タンパク質 (RBP) の RNA インターアクターを識別するに従来のアプローチは、クロスリンク RNA RBP 錯体25,26,27に紫外光を使用します。最近の研究はマウス システムのこの UV 架橋アプローチを適用し、核小体低分子 Rna が代謝ストレス16の間に PKR 活性化を調節することが識別されます。ホルムアルデヒドの高架橋効率を活用することにより28HeLa 細胞の細胞周期中に PKR と相互作用する Rna を識別する方法を提案します。同様のアプローチは、シュタウフェン Drosha29,30,31など他の dsRBPs を研究に適用されています。短い散在させていて核要素 (正弦波)、長い散在核要素 (ライン)、内在性レトロ ウイルス要素 (ERV) とも α サテライト Rna など PKR が非翻訳 Rna のさまざまな種類と対話できるとわかった。また、PKR がミトコンドリア Rna (mtRNAs)、重鎖と光の相補的な相互作用を介してどのフォームの分子間二本鎖 Rna28と対話できることを示した。最近の出版物は、さらにいくつかの mtRNAs が二重のフォームに存在し、dsRNA センサー32インターフェロンを誘発する分化関連タンパク質悪性黒色腫 5 などをアクティブにすることができます私たちのデータをサポートしました。もっと重要なは、表現と mtRNAs の細胞内局変調細胞周期の間に、様々 なストレスによって28PKR 活性化を調節する能力に重要な可能性があります。

この記事で提案する架橋結合する最近開発されたホルムアルデヒドと免役沈降法 (fCLIP) のための詳しいプロトコルを取り込み、細胞周期中に PKR と相互作用する Rna を解析するメソッド。チミジンとノコダゾールを用いた細胞周期停止試料を準備する方法を示す.これらの Rna を識別する高スループット シーケンス ライブラリを準備する PKR バインド Rna とメソッドを特定する fCLIP プロセスを提案する.さらに、我々 は qRT PCR を使用して PKR バインド Rna を分析する手順の詳細を描きます。具体的には、mtRNAs の strandedness を分析するアンチセンス逆転写法を紹介します。記述されていたプロトコルは HeLa 細胞の PKR、最適化されますが、細胞周期サンプル、fCLIP、アンチセンス qRT PCR 解析の準備などの重要なステップは、携帯電話の二本を勉強するまたは他の dsRBPs の RNA インターアクターを識別するために簡単に変更できます。

プロトコル

1. ソリューションおよびセルの準備

  1. ソリューションの準備
    1. 細胞培養液の 500 ml ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) の牛胎児血清 (FBS) の 50 mL を追加することによって HeLa 細胞培養のためメディアを準備します。
      注: 抗生物質は、細胞培養液に追加できますが、我々 は抗生物質を使用しないでください。
    2. 0.1% パラホルムアルデヒド解散 1 で 4% (w/v) パラホルムアルデヒド x Phosphate-Buffered 生理食塩水 (PBS) ホット プレート上、希は暖房装置を持つ 1x PBS を追加して 0.1% (v/v) パラホルムアルデヒドの 30 mL をすること。
      注意: ヒューム フードのすべての手順を実行、パラホルムアルデヒド ソリューションを沸騰しないように注意してください。0.1% 溶液を光から保護し、4 ° C で保存ソリューションを使用して、1 ヶ月以内。
      注: 最後の 0.1% (v/v) パラホルムアルデヒド溶液の pH は約 7 をする必要があります。
    3. FCLIP の換散バッファーの準備: トリス-HCl (pH 7.5) 20 mM 15 mM 0.1% (v/v) トリトン X-100, 10 ミリメートルの EDTA、0.5% (v/v) ノニデット p40 (NP-40)、塩化ナトリウム 0.1% (v/v) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) とデオキシ コール酸ナトリウム 0.1% (w/v)。40 mL にトリプル蒸留水 (TDW) を追加します。4 ° C でのストア
    4. FCLIP 洗浄バッファーを準備: トリス-HCl (pH 7.5) 20 mM 150 mM、0.1% (w/v) 0.1% (v/v) SDS、0.1% (v/v) トリトン X-100 0.1% (v/v) NP 40 塩化ナトリウム、10 ミリメートルの EDTA、デオキシ コール酸ナトリウム。TDW を 40 mL に追加します。4 ° C でのストア
    5. 4 x PK バッファーを準備: 400 mM トリス-HCl (pH 7.5)、200 mM の NaCl、40 ミリメートルの EDTA および 4% (v/v) SDS。TDW を 40 mL に追加します。常温で保存します。
    6. FCLIP 溶出バッファーを準備: PK バッファー、尿素、21 g、TDW 8.5 mL x 4 の 20 mL。新鮮な準備します。
    7. RNA 溶出バッファーを準備: 0.3 M NaOAc と 2% (w/v) SDS。常温で保存します。
    8. RNA のローディングの染料 × 2 の準備: 95% (v/v) ホルムアミド、0.05% (w/v) SDS 5 mM EDTA 0.025% (w/v) キシレンシアノール 0.025% (w/v) ブロモフェノールの青。-20 ° C にてストア
    9. 1 x TBE バッファーを準備: 0.089 M Tris ホウ酸塩と 0.002 M EDTA。500 mL の TBE バッファーを準備します。
  2. S または M 相逮捕細胞の調製
    1. 種子の 750,000 ~ または ~ 1,000,000 hela 細胞はそれぞれ S または M 相逮捕サンプルの細胞します。24 h の CO2を 37 ° C、5% で細胞を成長します。
    2. 2 mM チミジンで細胞を治療し、37 ° C で 18 h インキュベート
    3. PBS で 2 回細胞を洗浄します。新鮮なメディアを追加し、37 ° C で 9 時間インキュベート
    4. S 相逮捕細胞、2 mM チミジンとセルを扱います。M 相逮捕細胞 100 ng/mL ノコダゾールとセルを扱います。37 ° C と収穫の細胞で 15 時間孵化させなさい。
      注: 細胞周期サンプルの均質性は、FACS を使用して確認できます。

2. ホルムアルデヒド架橋と免役沈降法

  1. セル収穫
    1. S の段階のサンプルでは、15 mL の円錐管に細胞スクレーパーと転送細胞を収集します。M 相サンプル、M 相逮捕細胞をデタッチし、15 mL の円錐管にそれらを転送する細胞培養皿の側面をタップします。
      注: M 相逮捕細胞の均一性を高めるため細胞スクレーパーを使用しないでください。
    2. 3 分削除のため室温で 380 x gで細胞上清を遠心し、再 1 ml の PBS 寒くて 1.5 mL 遠心チューブに転送の中断します。
    3. 遠心 10,000 x gで 4 ° C でセル 30 s. 削除の上清完全に。
  2. 架橋結合するホルムアルデヒド
    1. セルを修正するために室温で 10 分間 0.1% パラホルムアルデヒドの 750 μ L を追加します。
    2. 1 M のグリシンの 250 μ L を追加し、反応を抑制するために室温でさらに 10 分間インキュベートします。遠心 10,000 x gで 4 ° C でセル 30 s. 削除の上清完全に。
    3. 1 mL の PBS を再停止できます。遠心分離機の 10,000 のセル 30 s や削除、上清のための 4 ° C でg x。
    4. 0.2% (v/v) プロテアーゼ阻害剤と 2% (v/v) RNase 阻害剤を添加した fCLIP 換散バッファーの 400 μ L を再停止できます。氷上で 10 分間インキュベートし、ultrasonicator を用いた超音波照射します。
    5. ~ 150 mm の NaCl 濃度を調整する 5 M の NaCl の 11 μ L を追加します。簡単に渦と 21,130 x gで 4 ° C で 15 分間遠心上清を中古冷蔵 1.5 mL 遠心チューブに転送します。
      注: は、入力サンプルとして新しい遠心管の上澄みの 40 μ L を保持します。4 ° C で入力のサンプルを保存します。
  3. 免疫沈降
    1. 1.5 mL 遠心チューブにプロテイン A ビーズの 20 μ L を追加します。
    2. 400 μ fCLIP 換散バッファーのビードを洗います。4 ° c で 1 分間削除 1,000 x gでビーズの上澄みを遠心し、慎重に fCLIP 換散バッファーの 400 μ L を追加します。優しく再反転 3 でビーズを中断 ~ 4 回。
    3. 洗浄ステップを 3 回繰り返します。最終的な洗浄の後、上清を完全に取り外します。
    4. 再 fCLIP 換散バッファーの 300 μ L でビーズを中断します。~ 150 mm の NaCl 濃度を調整する 5 M の NaCl の 8.3 μ L を追加します。PKR 抗体の 10 μ L を追加し、4 ° C でローテーター上 3 時間インキュベート
    5. 4 ° c で 1 分間削除 1,000 x gでビーズの上澄みを遠心し、fCLIP 洗浄バッファーの 400 μ L を追加します。優しく再反転 3 でビーズを中断 ~ 4 回。
    6. 洗浄ステップを 2 回繰り返します。最終的な洗浄の後、上清を完全に取り外します。
      注: は、渦のミキサーを使用しないでください。手で軽くチューブを反転します。
    7. ライセート 300 μ L を追加し、回転の 4 ° C で 3 時間インキュベートします。
      注: 長いインキュベーション時間増加の背景バインド可能性があります。
    8. 4 ° c で 1 分間削除 1,000 x gでビーズの上澄みを遠心し、fCLIP 洗浄バッファーの 400 μ L を追加します。優しく再反転 3 でビーズを中断 ~ 4 回。
    9. 洗浄ステップを 3 回繰り返します。最終的な洗浄の後、上清を完全に取り外します。
    10. FCLIP 溶出バッファーの 300 μ L を追加します。ビーズから PKR を溶出する 25 の ° C で 3 時間 thermomixer で孵化させなさい。
      注: fCLIP 溶出バッファー フレッシュを準備します。
    11. 常温 1,000 × gで遠心し、上清をきれいなシリコーン チューブに転送します。
      注: 微量遠心チューブも ok、ですが、デ架橋ステップ (ステップ 2.3.12) 中に蒸発を防ぐためにシリコーン チューブを優先します。
    12. プロティナーゼ K の 300 μ L (20 mg/mL) を追加し、65 ° C で一晩インキュベート
      注: 温水カバー蒸発を避けるために、thermomixer を使用します。
  4. RNA の抽出
    1. 1 h の 37 ° C で 30 s. 加温の酸フェノール クロロホルムおよび渦の 580 μ L を追加します。
    2. 渦 30 s と常温 12,000 × gで 10 分間遠心します。
    3. きれいな 1.5 mL 遠心チューブに最上位のレイヤーを転送します。3 M NaOAc、クロム (例えば、Glycoblue) の 0.5 μ L と等量のイソプロパノールの 1/10 量を追加します。-20 ° C で一晩インキュベートします。
    4. ペレットの 1 h の 4 ° C で最大速度で遠心分離による沈殿物します。
      注: RNA/DNA ペレットが認められない場合は、RNA ・ DNA ペレットが観察されるまでクロムと追加 1 h 続行このステップの遠心分離機の追加 0.5 μ を追加します。
    5. 上澄みを除去し、75% エタノール 1 mL を加えます。4 ° C、12,000 × gで 5 分間遠心は洗浄ステップをあと 1 回繰り返します。清を完全に除去し、室温でペレットを乾燥します。
    6. 1 h の 37 ° C で 42 μ TDW、DNase 私はバッファリングの 5 μ L、RNase 阻害剤の 1 μ L、DNase I. 孵化の 2 μ L を追加します。
    7. TDW の 150 μ L、200 μ L 酸フェノール クロロホルムを追加します。常温 12,000 × gで 10 分間 30 s. 遠心の渦。
    8. きれいな 1.5 mL 遠心チューブに最上位のレイヤーを転送します。3 M NaOAc、クロム、0.5 μ と 100% エチルアルコールの 1 mL の 20 μ L を追加します。-80 ° C で一晩インキュベートします。
    9. ペレットを沈殿させる、2.4.4 に 2.4.5 の手順で説明するよう 75% エチルアルコールを洗ってください。
    10. 再 TDW の適切な量を中断します。

3. シーケンス ライブラリの準備

  1. rRNA 除去
    1. 再手順 2.4.10 を TDW 28 μ から RNA ペレットを中断します。
      注: 最大総 RNA 量未満 5 μ g をする必要があります。
    2. RRNA を削除する rRNA 除去キットのリファレンス ・ ガイドによって提供される手順に従います。
    3. RRNA をクリーンアップ磁気ビーズの 160 μ L の追加によって Rna を枯渇しました。
      1. 〜 15 回のピペッティングして混合し、15 分間室温でインキュベートします。
      2. 磁気バーにチューブを接続し、上清を除去します。
      3. 80% エチルアルコールの 300 μ L を付加し、ビーズ、磁気バーにまだ接続されている間インキュベートする 30 秒。
      4. 新鮮な 300 μ L ソリューションでエチルアルコールを置き換えます。空気は乾燥室温で 12 分間磁気バーのビーズです。
      5. 再 TDW とミックスの 12 μ L で 15 回のピペッティングでビーズを中断します。
      6. 磁気バーのビーズを添付し、きれいな PCR チューブに上清を移動します。
    4. 断片化されたリボソーム Rna (Rrna) の枯渇はキット rRNA によって提供される手順を使い果たします。
    5. 磁性ビーズおよび繰り返し手順 3.1.3.1 に 3.1.3.6 110 μ L の追加によって Rna をクリーンアップします。
  2. RNA のラベリングとアダプターの結紮
    1. RRNA 枯渇 Rna 上 10 x CIAP バッファーの 2 μ L、RNase 阻害剤の 1 μ L と南極のアルカリホスファターゼの 2 μ L を追加します。1 h の 37 ° C で、その後、脱燐酸化酵素を不活化する 5 分の 65 ° C を孵化させなさい。
    2. 10 x PNK バッファーの 3 μ L、RNase 阻害剤 1.5 μ L、1.5 μ T4 PNK 酵素、r-ATP の 0.8 μ L と 1.7 μ TDW を追加します。50 分の 37 ° C で孵化させなさい。
    3. 10 mM ATP の 1.5 μ L を追加し、さらに 40 分の 37 ° C で孵化させなさい。
    4. RNA 溶出バッファーの 170 μ L の追加によって反作用を停止します。
    5. 常温 12,000 × gで 10 分間 30 s. 遠心の酸フェノール クロロホルムおよび渦の 200 μ L を追加します。
    6. きれいな 1.5 mL 遠心チューブに最上位のレイヤーを転送します。3 M NaOAc、クロム、0.5 μ と 100% エチルアルコールの 1 mL の 20 μ L を追加します。-80 ° C で一晩インキュベートします。
    7. RNA のペレットを沈殿させる、2.4.4 に 2.4.5 の手順で説明するよう 75% エチルアルコールを洗ってください。再 TDW の 4.5 μ L で中断および RNA 読み込み染料 × 2 の 9 μ L を追加します。
    8. 95 ° C、5 分および 10% 尿素ページのゲルにロードでサンプルを加熱します。
    9. 40 分間 370 V でゲルを実行します。
      注: は、事前サンプルをロードする前に 90 分の 370 V でゲルを実行します。
    10. 〜 100-500 塩基領域でゲルをカットして、ゲルを破る。
    11. 0.3 M の NaCl の 700 μ L を追加し、4 ° C で回転で一晩インキュベートします。
    12. 列と室温での最高速度で 5 分間遠心するソリューションに転送します。
    13. きれいな 1.5 mL 遠心チューブに溶出液を転送します。3 M NaOAc、クロム、0.5 μ と等量のイソプロパノールの 1/10 量を追加します。-20 ° C で一晩インキュベートします。
  3. 3' アダプター結紮
    1. RNA のペレットを沈殿させる、2.4.4 に 2.4.5 の手順で説明するよう 75% エチルアルコールを洗ってください。
    2. 再 TDW の 6.5 μ L の RNA ペレットを中断し、1 μ 10 μ M 3' アダプターを追加します。
    3. PCR チューブに溶液を移および 2 分の 70 ° C で孵化させなさい。
    4. 10 x 結紮バッファーの 1 μ L、RNase 阻害剤 0.5 μ L および T4 RNA リガーゼ 2 の 1 μ L を追加します。1 h、6 h、25 ° C そして 22 ° C、6 h 28 ° C の孵化させなさい。
    5. 95 ° C、5 分で 12 μ L の RNA ローディングの染料と熱 × 2 を追加します。
    6. ゲルの浄化 3' 3.2.9 へ 3.2.13 で説明するように、アダプターが Rna を結紮します。
  4. 5' アダプター結紮
    1. RNA のペレットを沈殿させる、2.4.4 に 2.4.5 の手順で説明するよう 75% エチルアルコールを洗ってください。
    2. 再 TDW の 4.2 μ L の RNA ペレットを中断し、5 μ M 5' アダプターの 1 μ L を追加します。
    3. PCR チューブに溶液を移および 2 分の 70 ° C で孵化させなさい。
    4. 10 x リガーゼ バッファー、RNase 阻害剤, 0.8 μ 10 mM ATP、T4 RNA リガーゼ 1 0.8 μ の 0.4 μ L の 0.8 μ L を追加します。1 h、6 h、25 ° C そして 22 ° C、6 h 28 ° C の孵化させなさい。
  5. 逆のトランスクリプションおよび PCR の拡大
    1. 5' アダプター結紮 Rna は 4 μ M の逆のトランスクリプションのプライマーの 1 μ L を追加します。2 分の 70 の ° C で、すぐに 4 ° C に冷却
    2. 5 x FS バッファーの 4 μ L、2.5 mM dNTP の 4 μ L、0.1 M の DTT、RNase 阻害剤の 1 μ L と逆転写酵素の 1 μ L の 1 μ L を追加します。50 ° c 1 時間、70 ° C、15 分間インキュベートします。
    3. PCR の拡大を準備します。
      1. RT 製品のミックス 1 μ、25 μ M RPI プライマーの 1 μ L、25 μ M RP1 プライマーの 1 μ L、HF バッファー、2.5 mM dNTP の 4 μ L、インスタレーション、32.5 μ x 5 の 10 μ L、忠実度の高いポリメラーゼの 0.5 μ L。
      2. 11 の PCR プログラムを実行 〜 13 サイクル。
        注意: PCR のためのプログラムは: 98 ° C、30 秒ホット スタート、10 98 ° C で s、60 ° C、30 s と 45 のための 72 ° C s 増幅、および 5 分の 72 ° C。11-13 サイクルに拡大のステップを繰り返します。
    4. 磁気ビーズと次の手順 3.1.3.1 に 3.1.3.6 40 μ L を使用が、DNA を溶出する TDW の 10 μ L の PCR の製品をクリーンアップします。
    5. 10 x DNA ローディングの染料の 2 μ L を追加します。6% アクリルアミドのゲルにサンプルをロードし、30 分間 200 V で実行します。
    6. 室温で 5 分間 Sybr ゴールド (0.01% (v/v) 1 x TBE バッファー) で染色します。
    7. 室温で 5 分間 1 x TBE バッファーの染色解除。
    8. ~ 200-700 塩基領域でゲルをカットして、ゲルを破る。
    9. 0.3 M の NaCl の 700 μ L を追加し、DNA を溶出する室温で一晩インキュベートします。
    10. すべてのロードに列と室温での最高速度で 5 分間遠心します。
    11. きれいな 1.5 mL 遠心チューブに溶出液を転送します。3 M NaOAc、クロム、0.5 μ と等量のイソプロパノールの 1/10 量を追加します。-20 ° C で一晩インキュベートします。
    12. DNA ペレットを沈殿させる、2.4.4 に 2.4.5 の手順で説明するよう 75% エチルアルコールを洗ってください。再 TDW の 20 μ l を中断します。
    13. シーケンサーを使用してサンプルを分析します。

4. qRT PCR を使用して相互作用の pkr からの Rna の解析

  1. 方法 1: ランダムな hexamer 逆のトランスクリプション
    1. 再手順 2.4.10 を TDW 8.5 μ から RNA ペレットを中断し、ソリューションを PCR チューブに転送します。
    2. 100 μ M のランダムな hexamers の 0.5 μ L と 2.5 mM dNTP の組合せの 4 μ L を追加します。
    3. 熱ソリューション 65 ° c 5 分のため、すぐには、少なくとも 1 分間氷の上孵化させなさい。
    4. ミックス反応: 5 x SSIV バッファーの 4 μ L、100 mM DTT、RNase 阻害剤の 1 μ L と逆転写酵素 (200 U/μ L) の 1 μ L の 1 μ L。RNA 溶液に反応混合物を追加します。
    5. 10 分、50 ° C 10 分の 23 ° c 混合物をインキュベートし、80 ° C, 10 分。
    6. リアルタイム PCR を用いた cDNA を分析します。
      注: リアルタイム PCR のためのプログラムは: 95 ° C、3 分ホット スタート、95 ° C、5 s と 60 ° C、10 増幅、および 95 ° C、30 秒 s、65 ° C、30 s、および 95 ° C、30 メルトの s。40 サイクルに拡大のステップを繰り返します。
  2. 方法 2: 鎖固有の逆のトランスクリプション
    1. 逆のプライマーのマスター ミックスを調製: CMV プロモーター配列を含む遺伝子特定の逆のトランスクリプション プライマーの同量は続く 〜 20 ヌクレオチド遺伝子特定シーケンスのミックス。
      注: 結合されたすべての遺伝子特定 RT プライマー濃度は 4 μ M です。
    2. 再手順 2.4.10 を TDW 8.5 μ から RNA ペレットを中断し、ソリューションを PCR チューブに転送します。
    3. 逆のトランスクリプションのプライマーの 4 μ M のマスター ミックスと 2.5 mM dNTP の組合せの 4 μ L の 0.5 μ L を追加します。
    4. 熱ソリューション 65 ° c 5 分のため、すぐには、少なくとも 1 分間氷の上孵化させなさい。
    5. 5 x SSIV バッファーの 4 μ L、100 mM DTT、RNase 阻害剤の 1 μ L と逆転写酵素 (200 U/μ L) の 1 μ L の 1 μ L を混合することによって反応液を準備します。RNA プライマー ミックスに反応液を追加します。
    6. 50 ° C 10 分、10 分の 80 ° C でソリューションを孵化させなさい。
    7. リアルタイム PCR を用いた cDNA を分析します。
      注: リアルタイム PCR のためのプログラムは、方法 1 で説明したものと同じです。

結果

HeLa 細胞を細胞周期の S または M の段階で逮捕するプロセスの模式図を図 1に示します。M 相逮捕のサンプルでは、(図 2 a) 顕微鏡の下で円形の形をした細胞を明確に視覚化できます。細胞周期の停止の効率を調べる、FACS (図 2 b) を使用してセルの核の内容を分析できます。D7F7 抗体が immunoprecipitate PKR する優れた性能を示す免疫沈?...

ディスカッション

S または M 相逮捕のサンプルを準備するプロセスを図 1に示します。S 期の細胞を逮捕、逮捕高効率 (図 1 a) を確保する間に 9 h のリリースで 2 回チミジンと細胞を扱ってチミジンの二重ブロック メソッドを使用しました。チミジンと一度セルを扱って M 相の逮捕のため 9 h のリリースに続いて、ブロック prometaphase (図 1 b) 細胞...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 韓国政府科学省と ICT (NRF 2016R1C1B2009886) によって資金を供給によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9260G
1 M Tris, pH 7.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1 M Tris, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1.7 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40)BiosolutionBN015
10X DNA loading bufferTaKaRa9157
15 mL conical tubeSPL50015
3' adaptor5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'
3 M Sodium Acetate pH 5.5Thermo Fisher ScientificAM9740
5' adaptor5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaClThermo Fisher ScientificAM9760G
50 mL conical tubeSPL50050
Acid-phenol chloroform, pH 4.5Thermo Fisher ScientificAM9722
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Magnetic beads DNA/RNA clean up
Antarctic alkaline phosphataseNew England BiolabsM0289S
Anti-DGCR8Made in house
Anti-PKR (D7F7)Cell signaling technology12297S
Anti-PKR (Milli)Millipore EMD07-151
ATP (100 mM)GE HealthcareGE27-2056-01
Bromophenol blue sodium saltSigma-aldrichB5525
Calf intestinal alkaline phosphataseTaKaRa2250A
Cell scraper 25 cm 2-positionSarstedt83.183
CMV promoter sequence5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
Dulbecco's modified eagle mediumWelgeneLM001-05
dNTP mixture (2.5 mM)TaKaRa4030
Ethanol, Absolute, ACS GradeAlfa-AesarA9951
Fetal bovine serumMerckM-TMS-013-BKR
FormamideMerck104008
GlycineBio-basicGB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL)Thermo Fisher ScientificAM9516
IsopropanolMerck8.18766.1000
NEBNext rRNA Depletion KitNew England BiolabsE6318rRNA Depletion Kit
NocodazoleSigma-AldrichM1404
Normal rabbit IgGCell signaling technology2729S
ParaformaldehydeSigma-Aldrich6148
PCR forward primer (RP1)5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCR index reverse primer (RPI)5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'
PCR tubes with flat cap, 0.2 mLAxygenPCR-02-C
Phosphate bufered saline (PBS) TabletTaKaRaT9181
Phusion high-fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530High-fidelity polymerase
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotorBenchmarkc2000
Polynucleotide kinase (PNK)TaKaRa2021A
Proteinase K, recombinant, PCR GradeSigma-Aldrich3115879001
qPCR primer sequence: CO1 HeavyForward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO1 LightForward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 HeavyForward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 LightForward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 HeavyForward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 LightForward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB HeavyForward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB LightForward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: GAPDHForward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 HeavyForward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 LightForward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 HeavyForward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 LightForward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 HeavyForward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 LightForward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 HeavyForward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 LightForward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Random hexamerThermo Fisher ScientificSO142
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL)TaKaRa2270A
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL)TaKaRa2313A
Ribo-Zero rRNA Removal KitIlluminaMRZH116rRNA Removal Kit
RotatorFINEPCR, ROTATOR AGD1.5-32
RT primer sequence: CO1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RT primer sequence: CO1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RT primer sequence: CO2 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RT primer sequence: CO2 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RT primer sequence: CO3 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RT primer sequence: CO3 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
RT primer sequence: CYTB Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RT primer sequence: CYTB Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
RT primer sequence: GAPDH5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
RT primer sequence: ND1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′
RT primer sequence: ND1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
RT primer sequence: ND4 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
RT primer sequence: ND4 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
RT primer sequence: ND5 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
RT primer sequence: ND5 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RT primer sequence: ND6 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RT primer sequence: ND6 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tubeBio Plas4167SLS50
Sodium dedecyl sulfateBiosesangS1010
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
SUPERase In Rnase inhibitorThermo Fisher ScientificAM2694
SuperScript III reverse transcriptaseThermo Fisher Scientific18080093Reverse transcriptase for library preparation
SuperScript IV reverse transcriptaseThermo Fisher Scientific18090010Reverse transcriptase for qRT-PCR
SYBR gold nucleic acid gl stainThermo Fisher ScientificS11494
T4 polynucleotide kinaseNew England BiolabsM0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)New England BiolabsM0204
T4 RNA ligase 2, truncated KQNew England BiolabsM0373
ThermomixerEppendorf ThermoMixer C with ThermoTop
ThymidineSigma-AldrichT9250
Tris-borate-EDTA buffer (TBE)TaKaraT9122
Triton X-100PromegaH5142
Ultralink Protein A sepharose beadsThermo Fisher Scientific22810Protein A beads
UltrasonicatorBioruptor
UreaBio-basicUB0148
Vortex mixerDAIHAN ScientificVM-10
Xylene cyanolSigma-AldrichX4126
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM)PerkinElmerBLU502A100UC

参考文献

  1. Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
  2. Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
  3. Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
  4. Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
  5. Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
  6. Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
  7. Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
  8. Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
  9. Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
  10. Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
  11. Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
  12. Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
  13. Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
  14. Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
  15. Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
  16. Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
  17. Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
  18. Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
  19. Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
  20. Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
  21. Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
  22. Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
  23. Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
  24. Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
  25. Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
  26. Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
  27. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  28. Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
  29. Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
  30. Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
  31. Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
  32. Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).

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