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요약

우리는 HeLa 세포를 사용 하 여 포유류 세포 주기 동안 이중 가닥 RNA 바인딩 단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR)의 공부 RNA-인터에 대 한 실험적인 접근을 제시. 이 방법은 포름알데히드 crosslink RNA PKR 단지 및 PKR 바인딩된 RNAs를 풍부 하 게 하는 immunoprecipitation를 사용 합니다. 이러한 RNAs는 더 높은 처리량 시퀀싱 또는 qRT-PCR을 통해 분석할 수 있습니다.

초록

단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR) 타고 난 면역 반응 단백질의 회원 이며, 바이러스 성 RNAs의 더블-좌초 이차 구조를 인식 합니다. 때 바이러스 이중 가닥 RNAs (dsRNAs)에 바인딩된, PKR는 이합체 화 및 후속 autophosphorylation를 겪 습. Phosphorylated PKR (pPKR) 활성화 되 고 진 핵 개시 요인 2 (eIF2α) 글로벌 번역 억제의 알파 소 단위의 인 산화를 유도 한다. PKR 세포 주기 동안과 같은 생리 적인 조건 하에서 또는 감염 없이 다양 한 스트레스 조건 하에서 활성화 될 수 있다 제안 증거를 증가. 그러나, PKR의 RNA 활성 제에 대 한 우리의 이해를 캡처하고 dsRNAs PKR 상호 작용 분석 표준화 된 실험 방법의 부족으로 인해 제한 됩니다. 여기, 우리는 실험 현재 구체적으로 풍부 하 고 PKR 분석 프로토콜 바인딩된 RNAs HeLa 세포를 사용 하 여 세포 주기 동안. 우리는 PKR RNA 복합물을 수정 하 고 immunoprecipitation를 통해 그들을 격리 포름알데히드의 효율적인 가교 활동을 활용 합니다. PKR 공동 immunoprecipitated RNAs 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 생성 하기 위해 추가 처리 수 다음. 세포질 dsRNAs PKR 상호 작용의 1 개의 주요 클래스는 미토 콘 드 리아 RNAs (mtRNAs), 무거운 가닥 빛 가닥 RNAs는 보완 상호작용을 통해 intermolecular dsRNAs 존재할 수 있습니다. 공부 하 고 이러한 이중 mtRNAs의 strandedness, 또한 선물이 가닥 특정 qRT-PCR를 위한 프로토콜. PKR 바인딩된 RNAs의 분석을 위해 우리의 프로토콜 최적화 하지만 셀룰러 dsRNAs 또는 다른 dsRNA 바인딩 단백질의 RNA 인터 공부를 쉽게 수정할 수 있습니다.

서문

단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR), 일컬어 진 핵 개시 요인 2 알파 니 2 (EIF2AK2), RNAs에 의해 제공 된 정보를 전송 하는 특징이 잘 단백질 키 니 아가입니다. 그것은 진 핵 번역 개시 2 소 단위 알파 (eIF2α)에 속하는 키 가족 고 떠들고 51 글로벌 번역1을 억제 하는 감염에 대 한 응답에서에서 eIF2α phosphorylates. 이러한 맥락에서 PKR PKR 이합체 화 및 autophosphorylation2에 대 한 플랫폼을 제공 하는 바이러스 성 더블-좌초 RNAs (dsRNAs)에 의해 활성화 됩니다. EIF2α, 외 PKR 수 phosphorylate 또한 p53, 인슐린 수용 체 기질 1, 억제 물 κB, 및 c 6 월 N 맨끝 키 니 아 제 (설립) 수많은 신호 변환 통로3,,45의 활동을 규제 하 6.

PKR 원래 소아마비의 dsRNAs7,8를 인식 하 여 소아마비 감염 시 eIF2α phosphorylated 키로 확인 되었다. PKR은 점점 면역 반응을 넘어 다각적인 역할을 발견 하 고 그것의 탈 선 활성화 또는 오작동 수많은 인간의 질병에서 함축 된다. 활성화/Phosphorylated PKR (pPKR) 자주 apoptosis 동안 관찰 하 고 퇴행 성 질환, 헌팅턴의 같은 특히 신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병의, 그리고 알 츠 하이 머 병9 환자의 일반적인 특성은 ,,1011,,1213. 또한, PKR 대사 스트레스와 열 충격14,15,,1617등 다양 한 스트레스 조건 하에서 활성화 됩니다. 다른 한편으로, PKR의 금지 증가 세포 증식에도 악성 변환18,19결과입니다. PKR 함수는 또한 정상적인 뇌 기능에 중요 한 이며 pPKR의 수준으로 세포 주기 동안 높은 M 단계20,,2122동안. 이러한 맥락에서 pPKR와 글로벌 번역을 억제 키 mitotic 신호 시스템에 적절 한 세포 분열20에 필요한 단서를 제공 합니다. 또한, PKR의 장기간된 활성화 G2/M 단계에 중국 햄스터 난소 세포 주기 검거 세포23에서 결과. 따라서, PKR 인 산화는 M/g 1 전환21동안 빠른 비활성화 되도록 부정적인 피드백 루프에 의해 통제 된다.

PKR의 넓은 범위 기능에도 불구 하 고 PKR 활성화에 대 한 우리의 이해를 캡처하고 dsRNAs PKR 활성화할 수 있는 식별 표준화 높은 처리량 실험적인 접근의 부족으로 인해 제한 됩니다. 이전 학문은 보여주었다 PKR dsRNAs 두 거꾸로 Alu 반복 (IRAlus)20,24, 그러나 세포 주기 동안 또는 PKR을 활성화할 수 있는 추가 셀룰러 dsRNAs의 존재의 가능성에 의해 형성 된와 상호 작용할 수 있습니다. 인간 세포에 스트레스 조건 탐험 되지 않았습니다. RNA-인터 RNA 의무적인 단백질 (RBP)의 식별에 기존의 접근 crosslink RNA RBP 단지25,,2627에 UV 빛을 사용 합니다. 최근 연구 마우스 시스템에 자외선 가교 이렇게 적용 하 고 확인 작은 nucleolar RNAs 대사 스트레스16동안 PKR 활성화를 조절할 수 있습니다. 활용 하 여 포름알데히드의 높은 가교 효율, 우리는 HeLa 세포28에서 세포 주기 동안 상호 작용 하는 PKR RNAs를 식별 하는 대체 방법 제시. 비슷한 접근 방식은 공부 스타 우 펜 및 Drosha29,,3031같은 다른 dsRBPs에 적용 되었습니다. 우리와 같은 짧은 산재 된 핵 성분 (사인), 긴 interspersed 핵 요소 (선), 내 인 성 레트로 바이러스 요소 (ERV), 그리고 심지어 알파 위성 RNAs PKR noncoding RNAs의 다양 한 종류 상호 작용 수 있습니다 발견. 또한, 우리는 PKR 미토 콘 드 리아 RNAs (mtRNAs), 어떤 양식을 intermolecular dsRNAs 무거운 물가 빛 사이의 상호 보완 작용을 통해 물가 RNAs28와 상호 작용할 수 있습니다 보였다. 최근 간행물은 더 일부 mtRNAs 이중 형태로 존재 하 고 흑색 종 분화 관련 단백질 5 interferons32유도 등 dsRNA 센서를 활성화할 수 있습니다 우리의 데이터 지원. 더 중요 한 것은, 식 및 mtRNAs의 subcellular 지 방화는 변조와 다양 한 스트레스에 의해 세포 주기 동안는 PKR 활성화28을 조절 하는 기능에 중요 한 있을 수 있습니다.

이 문서에서는 최근에 개발 된 포름알데히드 가교 및 immunoprecipitation (fCLIP)에 대 한 자세한 프로토콜 소개 캡처 및 세포 주기 동안 상호 작용 하는 PKR RNAs를 분석 하는 방법. 티 미 딘 및 nocodazole를 사용 하 여 세포 주기 검거 샘플을 준비 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 다음 PKR 바인딩된 RNAs 및 방법 이러한 RNAs를 식별 하기 위해 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 준비 하 분리 fCLIP 프로세스를 제시. 또한, 우리는 PKR 바인딩된 RNAs qRT-PCR를 사용 하 여 분석 하는 자세한 절차를 나타냅니다. 특히, 우리는 mtRNAs의 strandedness를 분석 하는 물가 관련 반전 녹음 방송 절차 제시. 설명된 프로토콜은 HeLa 세포 및 PKR, 최적화 하지만 셀룰러 dsRNAs 공부 하거나 다른 dsRBPs의 RNA 인터 식별 키 단계의 세포 주기 샘플, fCLIP, 및 물가 관련 qRT-PCR 분석 준비 쉽게 수정할 수 있습니다.

프로토콜

1. 솔루션 및 세포 준비

  1. 솔루션 준비
    1. 세포 배양에 대 한 준비 매체 헬러 세포 배양에 대 한 소 태아 혈 청 (FBS) 50 mL를 추가 하 여 500 mL Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의.
      참고: 항생제는 세포 배양에 추가 될 수 있지만 우리는 항생제를 사용 하지 않습니다.
    2. 0.1 %paraformaldehyde 대 1에서 4% (w/v) paraformaldehyde 분해 x Phosphate-Buffered 염 분 (PBS) 난방 및 희석 뜨거운 접시에 1 x PBS를 추가 하 여 0.1% (v/v) paraformaldehyde 30 mL를 만들려고.
      주의: 증기 두건에서 모든 단계를 수행 하 고 paraformaldehyde 솔루션 비등 하지 않도록 주의 하십시오. 빛에서 0.1%의 솔루션을 보호 하 고 4 ° c.에 저장 솔루션을 사용 하 여 1 개월 이내.
      참고: 마지막 0.1% (v/v) paraformaldehyde 해결책의 pH는 약 7 이어야 한다.
    3. FCLIP 세포의 용 해 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0.1% (v/v) 트라이 톤 X-100 0.1% (v/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 및 0.1% (w/v) 나트륨 deoxycholate. 트리플 증류수 (TDW) 40 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에 게
    4. FCLIP 워시 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl (pH 7.5), 150 m m NaCl, 10 mM EDTA, 0.1% (v/v) NP-40, 0.1% (v/v) 트라이 톤 X-100, 0.1% (v/v) SDS, 및 0.1% (w/v) 나트륨 deoxycholate. TDW 40 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에 게
    5. PK 버퍼 x 4 준비: 400 mM Tris HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 40 m m EDTA, 그리고 4% (v/v) SDS. TDW 40 mL를 추가 합니다. 실내 온도에 상점.
    6. FCLIP 차입 버퍼 준비: PK 버퍼, 우 레 아의 21 g 및 TDW 8.5 mL x 4의 20 mL. 신선한 준비.
    7. RNA 차입 버퍼 준비: 0.3 M NaOAc와 2% (w/v) SDS. 실내 온도에 상점.
    8. RNA 로드 염료 x 2 준비: 0.025% (w/v) bromophenol 블루, 0.025% (w/v) 자일 렌 cyanol, 5 mM EDTA, 0.05% (w/v) SDS, 및 95% (v/v) formamide. -20 ° c.에 게
    9. 1 x TBE 버퍼 준비: 0.089 M Tris-붕 산 염 및 0.002 M EDTA. TBE 버퍼의 500 mL를 준비 합니다.
  2. S 또는 M 단계 체포 셀의 준비
    1. 씨앗 ~ 750000 또는 ~ 1000000 헬러 각각 S 또는 M 단계 체포 샘플에 대 한 세포. 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 세포 성장.
    2. 2mm 티 미 딘 셀 하 고 37 ° c.에 18 h에 대 한 품 어
    3. 두 번 PBS로 세포 세척. 신선한 미디어를 추가 하 고 37 ° c.에 9 h에 대 한 품 어
    4. S 단계 체포 셀, 셀 2mm 티 미 딘을 취급 합니다. M 단계 체포 셀, 셀 100 ng/mL nocodazole 취급 합니다. 15 h 37 ° C와 수확 셀에서 품 어.
      참고: 세포 주기 샘플의 동질성 확인할 수 있습니다 FACS를 사용 하 여.

2. 포름알데히드 cross-linking 및 immunoprecipitation

  1. 셀 수확
    1. S 단계 샘플에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 세포 스 크레이 퍼와 전송 셀을 수집 합니다. M 단계 샘플, M 단계 체포 세포를 분리 하 여 15 mL 원뿔 튜브로 그들을 전송 셀 문화 접시의 측면을 누릅니다.
      참고: M 단계 체포 셀의 동질성을 늘리려면 셀 스 크레이 퍼를 사용 하지 마십시오.
    2. 원심 380 x g 3 분 제거에 대 한 실내 온도에서 세포는 상쾌한 고 다시 차가운 PBS와 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 전송의 1 mL와 함께 일시 중단.
    3. 원심 4 ° C에서 10000 x g 에서 셀 30 미 제거에는 상쾌한 완전히.
  2. 포름알데히드 가교
    1. 세포를 해결 하기 위해 실 온에서 10 분 동안 0.1 %paraformaldehyde 750 μ를 추가 합니다.
    2. 250 μ 1 M 글리신의 추가 하 고 반응을 풀기 위해 상 온에서 추가 10 분을 품 어. 원심 4 ° C에서 10000 x g 에서 셀 30 미 제거에는 상쾌한 완전히.
    3. 다시 1 mL의 PBS로 일시 중단 합니다. 10, 000에서 세포를 원심 30 s 및 제거는 상쾌한 4 ° C에서 g x.
    4. 다시 0.2% (v/v) protease 억제제와 2% (v/v) RNase 억제제 보충 하는 fCLIP 세포의 용 해 버퍼의 400 μ와 일시 중단 합니다. 10 분 동안 얼음에 incubate 고 sonicate는 ultrasonicator를 사용 하 여.
    5. ~ 150 m m NaCl 농도 조정 하려면 5 M NaCl의 11 μ를 추가 합니다. 짧게 소용돌이 및 15 분에 대 한 21,130 x g 4 ° C에서 원심 분리기는 상쾌한 미리 냉장된 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 전송.
      참고: 입력된 샘플으로 상쾌한 새로운 원심 분리기 튜브에서의 40 μ를 유지 합니다. 4 ° c.에 입력된 샘플 저장
  3. Immunoprecipitation
    1. 1.5 mL microcentrifuge 관으로 단백질 A 구슬의 20 μ를 추가 합니다.
    2. 워시 fCLIP 세포의 용 해 버퍼의 400 μ와 구슬. 원심 1 분 제거를 위한 4 ° C에서 1000 x g 에서 비즈는 상쾌한 고 fCLIP 세포의 용 해 버퍼의 400 μ를 신중 하 게 추가 합니다. 3 반전 하 여 부드럽게 다시 중단 구슬 ~ 4 번.
    3. 세 번 세척 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후에 상쾌한을 완전히 제거 합니다.
    4. 다시 fCLIP 세포의 용 해 버퍼의 300 μ에 비즈를 일시 중단 합니다. ~ 150 m m NaCl 농도 조정 하려면 5 M NaCl의 8.3 μ를 추가 합니다. PKR 항 체의 10 μ를 추가 하 고 3 h 4 ° c.에 회전에 대 한 품 어
    5. 원심 1 분 제거를 위한 4 ° C에서 1000 x g 에서 비즈는 상쾌한 고 fCLIP 워시 버퍼의 400 μ를 추가 합니다. 3 반전 하 여 부드럽게 다시 중단 구슬 ~ 4 번.
    6. 두 번 세척 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후에 상쾌한을 완전히 제거 합니다.
      참고: 소용돌이 믹서를 사용 하지 마십시오. 손으로 부드럽게 튜브를 반전.
    7. Lysate의 300 μ를 추가 하 고는 회전에 4 ° C에서 3 시간 품 어.
      참고: 더 이상 보육 시간 증가 배경 바인딩을 발생할 수 있습니다.
    8. 원심 1 분 제거를 위한 4 ° C에서 1000 x g 에서 비즈는 상쾌한 고 fCLIP 워시 버퍼의 400 μ를 추가 합니다. 3 반전 하 여 부드럽게 다시 중단 구슬 ~ 4 번.
    9. 세 번 세척 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후에 상쾌한을 완전히 제거 합니다.
    10. FCLIP 차입 버퍼의 300 μ를 추가 합니다. 구슬에서 PKR elute를 25 ° C에서 3 h thermomixer에서 품 어.
      참고: fCLIP 차입 버퍼 신선한 준비.
    11. 실 온에서 1000 x g 에서 centrifuge 하 고 깨끗 한 시 관에는 상쾌한 전송.
      참고: microcentrifuge 관은 또한 좋다, 하지만 시 튜브 드 가교 단계 (단계 2.3.12) 증발을 방지 하기 위해 선호 된다.
    12. 가수분해 K의 300 μ (20 mg/mL)을 추가 하 고 65 ° c.에서 밤새 품 어
      참고: 온수 커버는 thermomixer를 사용 하 여 증발을 피하기 위해.
  4. RNA 추출
    1. 1 시간 동안 37 ° C에서 30 미 품 대 산 페 놀 클로 프롬 및 소용돌이의 580 μ를 추가 합니다.
    2. 30 s와 10 분 동안 실 온에서 12000 x g 에서 원심 분리기와 동.
    3. Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 상위 계층을 전송 합니다. 3m NaOAc, coprecipitant (예: Glycoblue)의 0.5 μ와 소 프로 파 놀의 동일한 볼륨의 1/10 볼륨을 추가 합니다. -20 ° c.에서 밤새 품 어
    4. 1 시간에 4 ° C에서 최대 속도로 centrifuging 여 펠 릿을 침전.
      참고: 경우 RNA/DNA 펠 릿 했다 하지, RNA/DNA 펠 릿은 관찰 될 때까지 coprecipitant와 추가 1 h. 계속이이 단계에 대 한 원심 분리기의 추가적인 0.5 μ를 추가 합니다.
    5. 제거는 상쾌한 고 75% 에틸 알코올의 1 mL를 추가 합니다. 5 분에 4 ° C에서 12000 x g 에서 원심 분리기에서 한 번 더 세척 단계를 반복 합니다. 상쾌한을 완전히 제거 하 고 건조 한 실 온에서 펠 릿.
    6. 1 시간 동안 37 ° C에서 TDW, DNase 나 버퍼의 5 μ, RNase 억제제의 1 μ DNase I. 품 어의 2 μ의 42 μ를 추가 합니다.
    7. TDW의 150 μ와 200 μ 산 페 놀 클로 프롬의 추가 합니다. 10 분 동안 실 온에서 12000 x g 에서 30 s. 원심 분리기에 대 한 소용돌이.
    8. Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 상위 계층을 전송 합니다. 3 M NaOAc, coprecipitant의 0.5 μ 그리고 100% 에틸 알코올의 1 mL의 20 μ를 추가 합니다. 밤새-80 ° c.에 품 어
    9. 펠 릿을 침전 하 고 단계 2.4.4 2.4.5에에서 설명 된 대로 75% 에틸 알코올로 씻어.
    10. 다시 TDW의 적절 한 금액에서을 일시 중단 합니다.

3. 시퀀싱 라이브러리 준비

  1. rRNA 제거
    1. 다시 단계 2.4.10 TDW의 28 μ에서에서 RNA 펠 릿을 일시 중단 합니다.
      참고: 총 RNA의 최대 금액 미만 5 μ g 이어야 한다.
    2. RRNA를 제거 하는 rRNA 제거 키트의 참조 가이드에서 제공 하는 절차를 따릅니다.
    3. RRNA 청소 자석 구슬의 160 μ를 추가 하 여 RNAs를 고갈.
      1. ~ 15 회를 pipetting으로 혼합 하 고 15 분 동안 실 온에서 품 어.
      2. 마그네틱 바에 튜브를 부착 하 고 제거는 상쾌한.
      3. 구슬과 마그네틱 바에 여전히 연결 되어 30 품 어 하는 동안 추가할 수 80% 에틸 알코올의 300 μ s.
      4. 신선한 300 μ 솔루션에 에틸 알코올 바꿉니다. 공기 건조 실 온에서 12 분 동안 자기 바에 구슬.
      5. 다시 일시 중단 구슬 TDW와 섞어 12 μ에 15 번 pipetting으로.
      6. 마그네틱 바에 비즈를 연결 하 고 깨끗 한 PCR 튜브에는 상쾌한 이동.
    4. 고갈 고갈 키트 rRNA에서 제공 하는 절차를 따라 조각난된 리보솜 RNAs (rRNAs) 합니다.
    5. 마그네틱 구슬 및 반복 단계 3.1.3.1 3.1.3.6의 110 μ를 추가 하 여는 RNAs를 정리.
  2. RNA 라벨 및 어댑터 결 찰
    1. RRNA 고갈 RNAs에 10 x CIAP 버퍼의 2 μ, RNase 억제제의 1 μ 그리고 남극 알칼리 성 인산 가수분해 효소의 2 μ를 추가 합니다. 그리고 5 분은 인산 가수분해 효소 비활성화 65 ° C에서 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
    2. 추가 10 x PNK 버퍼의 3 μ, RNase 억제제의 1.5 μ, T4 PNK 효소, r-ATP의 0.8 μ 그리고 TDW의 1.7 μ의 1.5 μ. 50 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    3. 10mm ATP의 1.5 μ를 추가 하 고 추가 40 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    4. RNA 차입 버퍼의 170 μ를 추가 하 여 반응을 중지 합니다.
    5. 10 분 동안 실 온에서 12000 x g 에서 30 s. 원심 분리기에 대 한 산 페 놀 클로 프롬 및 소용돌이의 200 μ를 추가 합니다.
    6. Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 상위 계층을 전송 합니다. 3 M NaOAc, coprecipitant의 0.5 μ 그리고 100% 에틸 알코올의 1 mL의 20 μ를 추가 합니다. 밤새-80 ° c.에 품 어
    7. 펠 릿 RNA 침전 하 고 단계 2.4.4 2.4.5에에서 설명 된 대로 75% 에틸 알코올로 씻어. TDW의 4.5 μ에서 다시 중단 하십시오 고 RNA 로드 염료 x 2의 9 μ를 추가 합니다.
    8. 95 ° C 5 분 및 10% 우 레 아-페이지 젤에 부하에서 샘플을 열.
    9. 370 V 40 분에 젤을 실행 합니다.
      참고: 미리 샘플을 로드 하기 전에 370 V 90 분에 젤을 실행 합니다.
    10. ~ 100-500 뉴클레오티드 지역에서 젤 고 젤을 휴식.
    11. 0.3 M NaCl의 700 μ를 추가 하 고는 회전에 4 ° C에서 밤새 품 어.
    12. 열을 5 분 동안 실 온에서 최고 속도로 원심 분리기 솔루션을 전송 합니다.
    13. Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 eluate 전송. 3m NaOAc, coprecipitant의 0.5 μ와 소 프로 파 놀의 동일한 볼륨의 1/10 볼륨을 추가 합니다. -20 ° c.에서 밤새 품 어
  3. 3' 어댑터 결 찰
    1. 펠 릿 RNA 침전 하 고 단계 2.4.4 2.4.5에에서 설명 된 대로 75% 에틸 알코올로 씻어.
    2. 다시 TDW의 6.5 μ에 RNA 알 약을 중단 하 고 10 μ M 3' 어댑터의 1 μ를 추가 합니다.
    3. PCR 튜브에 솔루션을 전송 하 고 2 분 동안 70 ° C에서 품 어.
    4. 10 x 결 찰 버퍼 1 μ, RNase 억제제의 0.5 μ 그리고 T4 RNA 리가 2의 1 μ를 추가 합니다. 1 시간, 6 시간, 25 ° C 그리고 22 ° C 6 h 28 ° C에서 품 어.
    5. 5 분 동안 95 ° C에서 RNA 로딩 염색과 열 x 2의 12 μ를 추가 합니다.
    6. 젤 정화 3' 어댑터 출혈 RNAs 3.2.9 3.2.13에 설명 된 대로.
  4. 5' 어댑터 결 찰
    1. 펠 릿 RNA 침전 하 고 단계 2.4.4 2.4.5에에서 설명 된 대로 75% 에틸 알코올로 씻어.
    2. 다시 TDW의 4.2 μ에 RNA 알 약을 중단 하 고 5 μ M 5' 어댑터의 1 μ를 추가 합니다.
    3. PCR 튜브에 솔루션을 전송 하 고 2 분 동안 70 ° C에서 품 어.
    4. 10 x 리가 버퍼, RNase 억제제, 10mm ATP, T4 RNA 리가 1의 0.8 μ의 0.8 μ의 0.4 μ의 0.8 μ를 추가 합니다. 1 시간, 6 시간, 25 ° C 그리고 22 ° C 6 h 28 ° C에서 품 어.
  5. 반전 녹음 방송 및 PCR 증폭
    1. 5' 어댑터에 합자 RNAs는 4 μ M 반전 녹음 방송 뇌관의 1 μ를 추가 합니다. 2 분 동안 70 ° C에서 품 어 고 즉시 4 ° c
    2. 5 x FS 버퍼 4 μ, 2.5 m m dNTP의 4 μ, 0.1 m M DTT, RNase 억제제의 1 μ 및 역전사의 1 μ 1 μ를 추가 합니다. 50 ° C 1 시간 및 15 분 동안 70 ° C에서 품 어.
    3. PCR 확대 준비
      1. RT 제품의 믹스 1 μ, 25 μ M RPI 뇌관의 1 μ, 25 μ M RP1 뇌관의 1 μ, HF 버퍼, 2.5 m m dNTP의 4 μ, TDW, 32.5 μ x 5 10 μ 그리고 높은 중 합 효소의 0.5 μ.
      2. PCR 프로그램 11 실행 ~ 13 주기.
        참고: PCR에 대 한 프로그램은: 98 ° C 30에 대 한 뜨거운 시작, 98 ° C 10 s s, 60 ° C 30에 대 한 s와 45 72 ° C 확대, 그리고 5 분 동안 72 ° C에 대 한 s. 증폭 단계 11-13 사이클 반복 됩니다.
    4. 마그네틱 구슬과 다음 단계 3.1.3.1 3.1.3.6의 40 μ를 사용 하 여 하지만 TDW의 10 μ elute DNA를 사용 하 여 PCR 제품을 청소.
    5. 10 x DNA 로드 염료의 2 μ를 추가 합니다. 6% 아크릴 아 미드 젤에 샘플을 로드 하 고 200 V 30 분 실행 합니다.
    6. 실 온에서 5 분 동안 Sybr 골드 (0.01% (v/v) 1 x TBE 버퍼에) 얼룩.
    7. 드 실 온에서 5 분 동안 1 x TBE 버퍼에 얼룩.
    8. ~ 200-700 뉴클레오티드 지역에서 젤 고 젤을 휴식.
    9. 0.3 M NaCl의 700 μ를 추가 하 고 밤새 elute DNA를 실 온에서 품 어.
    10. 열 및 5 분 동안 실 온에서 최고 속도로 원심 분리기에 모든 것을 로드 합니다.
    11. Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 eluate 전송. 3m NaOAc, coprecipitant의 0.5 μ와 소 프로 파 놀의 동일한 볼륨의 1/10 볼륨을 추가 합니다. -20 ° c.에서 밤새 품 어
    12. 펠 릿 DNA를 침전 하 고 단계 2.4.4 2.4.5에에서 설명 된 대로 75% 에틸 알코올로 씻어. TDW의 20 μ에서 다시 일시 중단 합니다.
    13. 시퀀서를 사용 하 여 샘플을 분석 합니다.

4. qRT-PCR를 사용 하 여 상호 작용 하는 PKR RNAs의 분석

  1. 방법 1: 임의의 hexamer 반전 녹음 방송
    1. 다시 단계 2.4.10 TDW의 8.5 μ에서에서 RNA 펠 릿을 일시 중단 하 고 PCR 튜브에 솔루션을 전송.
    2. 100 μ M 임의의 hexamers의 0.5 μ와 2.5 m m dNTP 혼합의 4 μ 추가 합니다.
    3. 열에서 65 ° C 5 분 하 고 즉시 솔루션 적어도 1 분 동안 얼음에 품 어.
    4. 혼합 반응 확인: 5 x SSIV 버퍼 4 μ, 100 m DTT, RNase 억제제의 1 μ 그리고 역전사 (200 U/μ)의 1 μ m의 1 μ. 반응 혼합 RNA 솔루션에 추가 합니다.
    5. 23 ° C 10 분, 10 분, 50 ° C에서 혼합물을 품 어와 10 분 동안 80 ° C.
    6. 실시간 PCR 시스템을 사용 하 여 cDNA를 분석 합니다.
      참고: 실시간 PCR 위한 프로그램은: 뜨거운 시작, 5 95 ° C에 대 일 분 동안 95 ° C s와 60 ° C 10에 대 한 확대, 그리고 95 ° C 30에 대 한 s s, 30 위한 65 ° C s, 그리고 95 ° C 30에 대 한 용융에 대 한 s. 증폭 단계 40 주기 반복 됩니다.
  2. 방법 2: 물가 관련 반전 녹음 방송
    1. 반전 뇌관의 마스터 믹스 준비: ~ 20 뉴클레오티드 유전자 특정 시퀀스의 뒤에 동일한 양의 유전자 특정 반전 녹음 방송 뇌관 CMV 발기인 순서를 포함 하는 혼합.
      참고: 모든 유전자 특정 RT 뇌관의 결합된 농도 4 μ M.
    2. 다시 단계 2.4.10 TDW의 8.5 μ에서에서 RNA 펠 릿을 일시 중단 하 고 PCR 튜브에 솔루션을 전송.
    3. 반전 녹음 방송 뇌관의 4 μ M 마스터 믹스와 2.5 m m dNTP 혼합의 4 μ의 0.5 μ를 추가 합니다.
    4. 열에서 65 ° C 5 분 하 고 즉시 솔루션 적어도 1 분 동안 얼음에 품 어.
    5. 5 x SSIV 버퍼 4 μ, 100 m DTT, RNase 억제제의 1 μ 그리고 역전사 (200 U/μ)의 1 μ m의 1 μ를 혼합 하 여 반응 솔루션을 준비 합니다. RNA 뇌관 혼합 반응 솔루션을 추가 합니다.
    6. 50 ° C 10 분 및 10 분 동안 80 ° C에서 솔루션을 품 어.
    7. 실시간 PCR 시스템을 사용 하 여 cDNA를 분석 합니다.
      참고: 실시간 PCR 위한 프로그램은 방법 1에 설명 된 것과 동일 합니다.

결과

HeLa 세포의 세포 주기 S 또는 M 단계에서 체포 하는 과정에 대 한 개략도 그림 1에 표시 됩니다. M 단계 체포 샘플, 우리 명확 하 게 둥근 모양의 세포 (그림 2A) 현미경을 시각화할 수 있습니다. 세포 주기 검거의 효율성 검토, FACS (그림 2B)를 사용 하 여 셀의 핵 콘텐츠를 분석 수 있습니다. 그림 3 은 D7F7 항 체 immunoprecipitate PKR?...

토론

S 또는 M 단계 체포 샘플을 준비 하는 과정은 그림 1에 나와 있습니다. S 단계에서 셀을 체포, 우리 어디 우리가 두 번 높은 체포 효율 (그림 1A)를 보장 하기 위해 사이 9 h 출시와 함께 티 미 딘과 세포 치료 티 미 딘 더블 블록 메서드를 사용 합니다. M 단계 체포, 우리 한번 티 미 딘과 세포 치료 9 h 릴리스 및 nocodazole prometaphase (그림 1B

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 작품은 기본적인 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 한국 정부 교육부의 과학 및 ICT (NRF-2016R1C1B2009886)에 의해 자금에 의해 지원 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9260G
1 M Tris, pH 7.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1 M Tris, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1.7 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40)BiosolutionBN015
10X DNA loading bufferTaKaRa9157
15 mL conical tubeSPL50015
3' adaptor5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'
3 M Sodium Acetate pH 5.5Thermo Fisher ScientificAM9740
5' adaptor5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaClThermo Fisher ScientificAM9760G
50 mL conical tubeSPL50050
Acid-phenol chloroform, pH 4.5Thermo Fisher ScientificAM9722
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Magnetic beads DNA/RNA clean up
Antarctic alkaline phosphataseNew England BiolabsM0289S
Anti-DGCR8Made in house
Anti-PKR (D7F7)Cell signaling technology12297S
Anti-PKR (Milli)Millipore EMD07-151
ATP (100 mM)GE HealthcareGE27-2056-01
Bromophenol blue sodium saltSigma-aldrichB5525
Calf intestinal alkaline phosphataseTaKaRa2250A
Cell scraper 25 cm 2-positionSarstedt83.183
CMV promoter sequence5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
Dulbecco's modified eagle mediumWelgeneLM001-05
dNTP mixture (2.5 mM)TaKaRa4030
Ethanol, Absolute, ACS GradeAlfa-AesarA9951
Fetal bovine serumMerckM-TMS-013-BKR
FormamideMerck104008
GlycineBio-basicGB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL)Thermo Fisher ScientificAM9516
IsopropanolMerck8.18766.1000
NEBNext rRNA Depletion KitNew England BiolabsE6318rRNA Depletion Kit
NocodazoleSigma-AldrichM1404
Normal rabbit IgGCell signaling technology2729S
ParaformaldehydeSigma-Aldrich6148
PCR forward primer (RP1)5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCR index reverse primer (RPI)5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'
PCR tubes with flat cap, 0.2 mLAxygenPCR-02-C
Phosphate bufered saline (PBS) TabletTaKaRaT9181
Phusion high-fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530High-fidelity polymerase
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotorBenchmarkc2000
Polynucleotide kinase (PNK)TaKaRa2021A
Proteinase K, recombinant, PCR GradeSigma-Aldrich3115879001
qPCR primer sequence: CO1 HeavyForward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO1 LightForward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 HeavyForward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 LightForward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 HeavyForward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 LightForward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB HeavyForward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB LightForward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: GAPDHForward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 HeavyForward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 LightForward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 HeavyForward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 LightForward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 HeavyForward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 LightForward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 HeavyForward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 LightForward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Random hexamerThermo Fisher ScientificSO142
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL)TaKaRa2270A
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL)TaKaRa2313A
Ribo-Zero rRNA Removal KitIlluminaMRZH116rRNA Removal Kit
RotatorFINEPCR, ROTATOR AGD1.5-32
RT primer sequence: CO1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RT primer sequence: CO1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RT primer sequence: CO2 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RT primer sequence: CO2 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RT primer sequence: CO3 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RT primer sequence: CO3 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
RT primer sequence: CYTB Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RT primer sequence: CYTB Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
RT primer sequence: GAPDH5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
RT primer sequence: ND1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′
RT primer sequence: ND1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
RT primer sequence: ND4 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
RT primer sequence: ND4 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
RT primer sequence: ND5 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
RT primer sequence: ND5 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RT primer sequence: ND6 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RT primer sequence: ND6 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tubeBio Plas4167SLS50
Sodium dedecyl sulfateBiosesangS1010
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
SUPERase In Rnase inhibitorThermo Fisher ScientificAM2694
SuperScript III reverse transcriptaseThermo Fisher Scientific18080093Reverse transcriptase for library preparation
SuperScript IV reverse transcriptaseThermo Fisher Scientific18090010Reverse transcriptase for qRT-PCR
SYBR gold nucleic acid gl stainThermo Fisher ScientificS11494
T4 polynucleotide kinaseNew England BiolabsM0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)New England BiolabsM0204
T4 RNA ligase 2, truncated KQNew England BiolabsM0373
ThermomixerEppendorf ThermoMixer C with ThermoTop
ThymidineSigma-AldrichT9250
Tris-borate-EDTA buffer (TBE)TaKaraT9122
Triton X-100PromegaH5142
Ultralink Protein A sepharose beadsThermo Fisher Scientific22810Protein A beads
UltrasonicatorBioruptor
UreaBio-basicUB0148
Vortex mixerDAIHAN ScientificVM-10
Xylene cyanolSigma-AldrichX4126
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM)PerkinElmerBLU502A100UC

참고문헌

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