利用成熟的细胞隔离试剂盒快速分离脂滴器

摘要

该方案建立了一种新的方法, 从小鼠肝脏脂滴分离和纯化, 使用一个完善的内质网隔离试剂盒。

摘要

脂质液滴 (Ld) 是在最真核细胞和一些原核细胞的细胞溶胶中发现的生物活性细胞器。Ld 由中性脂质组成, 由磷脂和蛋白质的单层包裹。肝 ld 脂 (如神经酰胺) 和蛋白质与导致肝脂肪变性的几种疾病有关。尽管以前已经建立了 LD 隔离的方法, 但它们需要耗时的试剂制备, 而不是为隔离多个亚细胞隔间而设计的。我们试图建立一个新的协议, 以便能够从一个小鼠肝脏分离 ld, 内质网 (ER) 和溶酶体。

此外, 此处介绍的协议中使用的所有试剂都可在商业上获得, 并且在不牺牲 LD 纯度的情况下需要最少的试剂制备。在这里, 我们提出的数据, 比较这个新的协议作为一个标准的蔗糖梯度协议, 证明了相当的纯度, 形态和产量。此外, 我们可以使用相同的样本分离 ER 和溶酶体, 提供详细的洞察脂质及其相关蛋白质的形成和细胞内通量。

引言

Ld 是大多数真核细胞和一些原核细胞 1^{, 2,3的}细胞溶胶中发现的生物活性细胞^器.LD 核心由中性脂质 (如甘油三酯 (TG) 和胆固醇酯组成。它们还含有神经酰胺, 参与细胞信号转导途径^4,5的生物活性脂质。Ld 被磷脂单层包围, 并涂有蛋白质, 包括环素蛋白环素 2 (plin2) 和 3 (plin3)^{1,5, 6.}此外, 还存在与几种肝性脂肪病有关的脂原酶、脂肪酶和膜贩运蛋白, 包括非酒精性脂肪肝疾病、酒精性肝病和丙型肝炎^{3-5 ,6,7,8,9, 10.}

Ld 被认为是由 ER 的外膜形成的, 含有新合成的 TG, 来自 er 衍生的游离脂肪酸¹¹。然而, 目前尚不清楚汇集的脂质是否芽, 保持连接, 或从 ER^6,11被切除, 使 ld 从 er 摆脱技术上具有挑战性。通过表面脂肪酶的作用, 游离脂肪酸可以从 Ld 中释放, 从而提供能源生产或膜合成。此外, Ld 可以通过脂质体作为调节机制降解, 并产生游离脂肪酸¹²。

除了 ER 和溶酶体, 还有其他细胞器--如线粒体、内生体、过氧化物酶体和质膜--在 LDs¹¹的紧密关联中发现。这种严格的一夫多妻制使得它很难执行一个纯粹的 LD 提取。然而, 中性脂的先天低密度可以通过离心5加以利用.

传统上, ld 是使用蔗糖密度梯度^1,5,13隔离的。然而, 这些方法并没有被设计用来分离其他细胞器。此外, 它们还需要耗时的试剂制备。该协议调整了商业上可用的 ER 隔离套件 (请参阅材料表), 以允许 ld 隔离。我们使用套件提供的提取缓冲区, 添加 ld 隔离步骤。此外, 该协议还可用于使用相同样本的 ER 和溶酶体隔离, 从而更全面地了解 Ld 的生命周期。为了验证这一新方法, 我们对 LD 的收率、形态、大小和纯度进行了分析。我们将这里给出的结果与使用蔗糖梯度进行 LD 隔离的广泛使用的协议的结果进行了比较。

我们使用了一个10至12周的, 20 克女性 c57bl6 老鼠禁食16小时 (食物清除在下午5:00 上午 9:00 ld 隔离时间), 可以免费获得水。TG 的典型产率为 0.6 mgg 肝脏, ld 蛋白的典型产率为 0.25 mg g。这为 sds page 为 ~ 10个免疫细胞提供了足够的材料。下面的协议详细介绍了所使用的试剂和适用于单个1克肝脏的协议。蔗糖梯度隔离协议适用于佐藤14号和吴15^.

研究方案

所有实验都是在实验室的长凳上进行的, 配备了适合生物安全1级的个人防护设备, 包括实验室外套、手套和安全护目镜。实验是根据宾夕法尼亚大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 批准的协议进行的。所有的努力都是为了尽量减少动物的不适, 动物们受到了人道的照顾。

1. 使用 ER 隔离套件进行 LD 隔离

1. 制备
   注: 列出的金额适用于单个1克小鼠肝脏。
   1. 从 er 隔离套件中稀释2毫升的 5x ie 缓冲液和8毫升的超纯水, 制备1x 同位素提取缓冲液 (IE 缓冲液) 的10毫升。将缓冲区放在冰上冷却。
   2. 在90毫升的超纯水中稀释10毫升的 10倍 PBS, 制备100倍磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。把它放在冰上冷却。
   3. 通过在9.5 毫升的超纯水中稀释500μl 的 pgpe, 制备5% 乙二醇 p-(1, 3, 3-四甲基丁基)-苯醚 (pgpe) 的10毫升。使用1毫升注射器测量 PGPE, 因为它是粘性的。把它放在冰上冷却。
   4. 将所有管放在冰上冷却: 1.7 mL 微型离心管、15毫升离心管、50毫升高速离心管和13毫升超离心管。
   5. 冷却所有所需的离心机至 4°C: 一台微型离心机、一台用于15毫升管的大容量离心机、一台用于 50 mL 管的高速离心机和一台超离心机。
   6. 消毒钳子和解剖剪刀高压灭菌。
2. 组织制备
   1. 将鼠标放入充满 100% co2 的室内 10分钟, 使鼠标安乐死 10分钟 . 通过进行颈椎脱位确认安乐死。
   2. 使用无菌钳和解剖剪刀, 切断后部-前轴上的腹部皮肤和肌肉层, 以暴露肝脏。
   3. 切断连接肝脏与隔膜和肠道的韧带。使用钳子将肠子从肝脏拉到后部, 露出韧带。
   4. 在肝脏和背上的胸腔之间切割, 从前到后部移动, 直到肝脏被解放。
   5. 将肝脏转移到一个冷的5厘米培养皿与10毫升的冷 1x PBS。
   6. 在5厘米的 petri 培养皿中, 在 1 x Pbs 的10毫升的摇页上清洗肝脏 2倍, 在4°c 时清洗5分钟。最后洗完后倒出1x 的 p b s。
   7. 使用大小为10的无菌手术刀片 (参见材料表), 将肝脏切割成3-5 毫米的碎片, 在5厘米的 petri 培养皿中 (图 1 a)。
   8. 用10毫升的冷 1x PBS 清洗切碎的肝脏 2x, 在4°c 下, 在5厘米的培养皿中清洗5分钟。
      注: 对于溶酶体分离, 将0.5 克肝脏转移到干净的45毫升均质机中, 并遵循溶酶体提取试剂盒提供的说明 (见材料表)。
   9. 分解 1x PBS, 并将切碎的肝脏块转移到冷的45毫升弹跳均质机。确保所有部件都进入均质机的底部。
   10. 加入7毫升冷 1x ie 缓冲液 (从 ER 隔离套件), 并通过上下移动 20x, 在冰上均匀化。确保在每次行程中, 伟囊都进入均质机的底部。
   11. 将均质体 (图 1b) 转移到冷的15毫升离心管中。
   12. 用1毫升冷 1x ie 缓冲液 (从 ER 隔离套件) 冲洗均质机, 并将其添加到均质体的其余部分。
3. LD 隔离
   1. 在 1, 000 x 克的大容量离心机中离心共质, 在 4°c 下 10分钟, 取出细胞核 (图 1c)。
   2. 将后核上清液 (PNS) 转移到新的、冷的50毫升离心管中。为了防止 LD 损失, 请确保在转移 Pns 之前, 在15毫升管的顶部聚集的任何脂质被重新悬浮。
   3. 取100μl 的 PNS, 进行纯度分析, 并将其放入冷 1.7 mL 的微离心管中。把它放在冰上。
   4. 在 12, 000 x g 的冷冻高速离心机中, 以 12, 000 x g的速度, 在4°c 下, 以15分钟的速度去除线粒体, 将 pns 样品而不是 aliquot 离心。
      1. 可选:对于粗 LD (cld) 分离物 (带有细胞溶胶和细胞膜污染), 使用玻璃移液器收集顶部脂质层, 并将其转移到1.7 毫升的微离心管中。继续执行第1.4 节。
   5. 将线粒体后上清液 (PMS) 转移到超离心管中。为了防止 LD 损失, 请确保在转移 PMS 之前, 在顶部收集的任何脂质都将重新悬浮。
   6. 取100Μl 的 PMS 进行纯度分析, 并将其放入冷 1.7 mL 的微离心管中。把它放在冰上。
   7. 用冷的 1x ie 缓冲液将超离心管填充到边缘, 以防止超离心过程中的管塌陷。
   8. 在4°c 条件下, 以 100, 000 x 克的超离心机将样品平衡并离心, 时间为 60分钟 (图 1d)。
   9. 要去除 LD 层, 请将管倾斜45°角, 然后使用玻璃移液器吸气。将颗粒转移到一个冷1.7 毫升的微离心管。
      注: 颗粒含有隔离的 ER。使用此分数下游的 ER 隔离。
   10. 在脂质层下收集100μl 后 er 上清液 (PER), 用于纯度分析。
4. LD 洗涤
   1. 在1.7 微离心管中收集的 LD 分数中添加 1个 PBS, 总体积为 1.3 mL。
   2. 将样品旋涡。
   3. 在4°c 下, 以最高速度离心 5分钟, 将任何细胞碎片颗粒状。用双手轻轻加热管, 以帮助重新悬挂 LD 层。将上清液 (包括脂质层) 转移到新的 1.7 mL 微离心管中。
   4. 重复步骤 1.4.1-1.4.3 2x–3x, 直到颗粒不再可见。
   5. 在无颗粒 ld 上清液中加入 1个 PBS, 最终体积为 1.5 mL。在4°C 条件下, 用最高速度在微型离心机中离心5分钟清洗脂质分数。
   6. 用玻璃移液器取出1毫升的 1x PBS (脂质层下方), 而不会干扰脂质层。
   7. 重复步骤1.4.5 和 1.4.6 4x–5x, 直到 1x PBS 在视觉上是透明的, 没有浊度。
   8. 使用玻璃移液器取出脂质层下方的所有 1x PBS (图 1x)。
   9. 使用结果, 一个纯 LD 分数, 用于下游分析。
5. 双链酸法测定 LD 蛋白
   注: 如果要评估 LD 形态, 请不要使用双氯苯酸检测 (BCA)。
   1. 将 LD 重新用于500μl 的 5% PGPE。
   2. 在95°c 下将样品煮沸 5分钟, 使其变热, 并在室温下孵育样品5分钟冷却。
   3. 重复步骤1.5.2 额外的2倍。
   4. 以中等强度的30秒循环对样品进行5分钟的取样。
   5. 通过 BCA 法测量所有纯度分析样品和 LD 组分中的蛋白质浓度, 使样品正常化。

2. 使用蔗糖密度梯度的 LD 隔离

1. 制备
   1. 制造200毫升的 te 缓冲液 (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8.0])。把它放在冰上冷却。
   2. 通过在 TE 缓冲液中溶解60克蔗糖, 使最终体积达到100毫升, 使 te 缓冲液中的蔗糖溶液达到100毫升。把它放在冰上冷却。
   3. 在 TE 缓冲液的2毫升中加入4毫升的60% 蔗糖溶液, 使 40% (w/v) 的蔗糖溶液为6毫升。把它放在冰上冷却。
   4. 在 TE 缓冲液 3.5 mL 中加入 2.5 mL 的60% 蔗糖溶液, 使 25% (w/v) 蔗糖溶液的6毫升。把它放在冰上冷却。
   5. 在 TE 缓冲液 3.3 ml 中加入 0.7 mL 的60% 蔗糖, 使 10% (w/v) 蔗糖溶液的4毫升。把它放在冰上冷却。
   6. 在 TE 缓冲液的10毫升中加入一片蛋白酶和磷酸酶抑制剂, 制备蛋白酶和磷酸酶抑制剂溶液10毫升。
   7. 在60% 蔗糖库存溶液的50毫升中加入4毫升蛋白酶和磷酸酶抑制剂溶液, 制备组织均质缓冲液。把它放在冰上冷却。
   8. 在 te 缓冲液的50毫升加入2毫升蛋白酶和磷酸酶抑制剂溶液, 制备覆盖缓冲液。把它放在冰上冷却。
   9. 在90毫升的超纯水中稀释 10倍 pbs 的10毫升, 制备100毫升的 1x PBS。把它放在冰上冷却。
   10. 在9.5 毫升的超纯水中稀释500Μl 的 PGPE, 制备10% 的 5% PGPE。使用1毫升注射器测量 PGPE, 因为它是粘性的。把它放在冰上冷却。
   11. 将下列离心管放在冰上冷却: 1.7 mL 微离心管、15毫升离心管、50毫升高速离心管和13毫升超离心管。
   12. 将所需的离心机冷却到 4°c: 微型离心机、大容量离心机 (适用于 15 mL 管)、高速离心机 (适用于 50 mL 管) 和超离心机。
2. 组织制备
   1. 使用步骤1.2.1 –1.2.9 为组织的均质化做好准备。
   2. 加入7毫升的冷组织均质缓冲液, 并通过上下移动20x 将其在冰上均匀化。在前五次冲程中, 确保伟尼剂进入均质机的底部。
   3. 将均质化转移到冷的15毫升离心管中。
   4. 用1毫升的冷组织均质缓冲液冲洗均质机, 并将其转移到以前使用的15毫升离心管。
   5. 使均质体的体积高达10毫升与组织均质缓冲液。
   6. 在 1, 000 x克的大容量离心机中离心样品, 在4°c 下进行10分钟的离心。
   7. 将8毫升上清液转移到50毫升离心管中。
   8. 将剩余的上清液转移100Μl 作为 PNS 样品进行纯度分析。
3. 蔗糖梯度
   1. 将含有8毫升 PNS 的50毫升离心管倾斜45°角。小心加入6毫升的40% 蔗糖溶液, 确保这两个阶段保持分离。
   2. 以类似的方式, 慢慢加入6毫升的25% 蔗糖溶液;然后加入4毫升的10% 蔗糖溶液;最后, 添加8毫升的覆盖缓冲区。
   3. 在4°c 条件下, 在 30, 000 x g 的高速离心机中离心样品30分钟。
   4. 将含有 Ld 的顶层转移到 1.7 mL 的微离心管中。
   5. 对于 LD 清洗, 请按照第1.4 节中的步骤操作。

结果

我们在大约30只小鼠身上用 ER 试剂盒进行了 LD 隔离, 并将结果与遵循蔗糖隔离协议的结果进行了比较。所报告的结果是典型的两个协议。小鼠连夜禁食, 可以自由获得水, 以增加 LD 产量。使用蔗糖梯度的 LD 隔离与 ER 套件 ld 隔离协议并行运行。在整个 ER 套件 LD 隔离协议中收集了 PNS、PMS、PER、Cld 和 Ld 的样本。由于蔗糖隔离协议的工作流限制, 只收集了 PNS 和 LD 隔离。

讨论

肝 LD 生物学正日益被认为是健康和疾病中肝细胞生理学的关键调节剂。作为真正的细胞器, Ld 是动态的, 与其他细胞结构相互作用, 并包含在它们里面的生物活性成分参与脂质和葡萄糖的稳态。蔗糖梯度通常用于 LD 隔离, 使研究人员能够研究 LD 结构, 但它要求他们制造大量的缓冲。我们已经证明, 使用商用 ER 隔离套件是另一种工具, 不仅可用于 LD 隔离, 还可用于 ER 和溶酶体的串联隔离, 从而能够更?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioExpress Vortex Mixer	GeneMate	S-3200-1	Vortex Mixer
Centrifuge 54242 R	Eppendorf	54242 R	Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 +	Thermo Scientific	RC6+	Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+	Thermo Scientific	Legend RT+	Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	04 693 116 001	Protease Inhibitor Tablets
Diagenode Bioruptur UCD-200	Diagenode	UCD-200	Sonication System
Dounce Tissue Grinder (45 mL)	Wheaton	357546	Use Loose pestle
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x)	Corning	21-031-CM
Endoplasmic Reticulum Isolation Kit	Sigma Aldrich	ER0100	For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea.
External light source for flourescent excitation	Leica	Leica EL6000
Hydrochloric acid	Sigma Aldrich	H1758	Hydrochloric Acid
ImageJ			Image Analysis Software
Inverted Modulating Contrast Microscope	Leica	Leica DM IRB
Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells	Thermo Fisher Scientific	89839	For Lysosome Isolation
Microscope Camera	Qimaging	QICAM fast 1394
Optima XL-100K Ultracentrifuge	Beckman-Coulter	XL-100K	Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	22-042817
Petri Dish 5 cm	Fisher Scientific	FB0875713A
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
PhosSTOP	Sigma Aldrich	04 906 845 001	Phosphatase Inhibior Tablets
Sterile Surgical Blade #10	Pioneer	S2646
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500	Crystalline/Certified ACS
Triglyceride Liquicolor Kit	Stanbio	2200-225	Colorimetric Triglyceride kit
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	For TE buffer
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151-100	5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)	Thermo Fisher Scientific	15575-038	For TE buffer