음 세포 기관이 격리 키트를 사용 하 여 급속 한 지질 작은 물방울 격리 프로토콜

요약

이 프로토콜 지질 작은 물방울 고립과 확고 바인딩과 그물 격리 키트를 사용 하 여 마우스 간에서 정화의 새로운 방법을 설정 합니다.

초록

지질 작은 물방울 (LDs)는 가장 진 핵 어떤 prokaryotic 세포의 cytosol 내 생리 세포. LDs는 인지질과 단백질의 단층에 의해 쌌 다 중립 지질 구성 됩니다. 간장 LD 지질, ceramides, 및 단백질 등 간 steatosis의 원인이 여러 가지 질병에 연루 됩니다. 이전 방법 LD 격리에 대 한 설립 되었습니다, 하지만 그들은 시 약의 준비 시간이 필요 하 고 여러 subcellular 구획의 격리에 대 한 설계 되지 않았습니다. 우리 민 변, 바인딩과 그물 (응급실), 및 단일 마우스 간에서 리소좀의 격리 수 있도록 새로운 프로토콜을 확립 하고자 했다.

더, 여기에 제시 된 프로토콜에 사용 된 모든 시 약 상업적으로 사용할 수 있으며 LD 순수성을 희생 하지 않고 최소한의 시 약 준비 필요. 여기 우리가 비교 순 결, 형태학, 고 수율을 보여주는 데이터를이 새로운 프로토콜 표준 자당 그라데이션 프로토콜을 비교 제시. 또한, 우리가 격리 수 응급실과 같은 샘플을 사용 하 여 리소좀 형성 및 지질 및 그들의 관련 된 단백질의 세포내 유량으로 상세한 통찰력을 제공.

서문

LDs는 생리 세포 가장 진 핵 세포의 cytosol 그리고 어떤 prokaryotic 세포^1,,23에서 발견. LD 코어 triglyceride (TG) 및 콜레스테롤 에스테 르와 같은 중립 지질으로 구성 된다. 그들은 또한 ceramides, 생리 활성 지질 세포 신호 통로^4,5에 포함 되어 있습니다. LDs는 인지질 단층으로 둘러싸여 있으며 perilipin 단백질 perilipin 2 (PLIN2) 및 3 (PLIN3)^1,,56을 포함 하 여 단백질 코팅. 또한 현재는 lipogenic 효소, lipases, 그리고 무 알콜 지방 간 질환, C 형 간염^{3,5, 알코올 간 질환 등 여러 가지 간장 steatotic 질병에 연결 된 멤브레인 밀매 단백질 ,6,,78,,910}.

LDs는 응급실의 외부 막에서 형성 새로 합성된 안내 무료 지방산 응급실 파생¹¹에서 공급을 포함 하 고 생각 된다. 그러나, 그것은 알 수 없는 남아 여부 풀링된 지질 버드, 연결, 유지 또는 ER^6,11, LDs 기술적으로 도전적인 응급실에서의 절연을 만드는에서 excised. 무료 지방산 에너지 생산 또는 막 합성 제공할 수 표면 lipases의 행동에 의해 LDs에서 해방 될 수 있습니다. 또한, LDs 무료 지방산¹²를 생산 하 고 규제 메커니즘으로 lipophagy를 통해 메시지를 저하 수 있습니다.

ER와 리소좀, 다른 세포는-미토 콘 드리 아, endosomes, peroxisomes, 원형질 막 등-는 LDs¹¹의 가까운 협회에서 찾을 수 있습니다. 이 꽉 일부 다 처 제는 순수한 LD 추출 하기 어려운 있습니다. 그러나, 중립 지질 타고 난 낮은 밀도 원심 분리⁵를 통해의 이점을 취할 수 있습니다.

전통적으로, LDs는 자당 밀도 그라데이션^1,,513를 사용 하 여 격리 되었습니다. 그러나, 이러한 방법은 하지 다른 세포를 격리 하기 위해 설계 되었습니다. 또한, 그들은 시 약의 시간이 걸리는 준비가 필요합니다. 이 프로토콜 적응 상용 ER 격리 (참조 테이블의 재료) LD 격리 수 있도록 키트. LD 격리 단계 추가 추출 버퍼는 키트에 의해 제공 된 사용 합니다. 또한, 프로토콜 또한 응급실 및 lysosomal 격리 LDs의 라이프 사이클의 보다 포괄적인 이미지에 대 한 수 있도록 동일한 샘플을 사용 하 여 사용할 수 있습니다. 이 새로운 방법의 유효성을 검사 하려면 우리는 LD 생산량, 형태, 크기, 및 순도 분석 결과. 우리는 여기에 제시 된 LD 격리에 대 한 자당 기온 변화도 활용 하 여 널리 사용 되는 프로토콜을 얻은 그 결과 비교 합니다.

우리는 10-에 12 주 된 사용, 물에 자유 접근을 16 h (LD 격리 동안 오전 9 시 오후 5 시에 식품 제거) 20 g 여성 C57BL/6 마우스 금식. 안내에 대 한 일반적인 수익률 0.6 mg/g 간 이며 LD 단백질, 그것은 0.25 mg/g 간. 이 SDS 페이지 ~ 10 immunoblots에 대 한 충분 한 자료를 제공합니다. 아래의 프로토콜 사용 시 약 및 적합 한 단일 1 g 간 프로토콜을 자세히 설명 합니다. 자당 그라데이션 격리 프로토콜 사토¹⁴ 와 우¹⁵에서 적응 이다.

프로토콜

모든 실험 biosafety 수준 1, 실험실 외 투, 안전 고글, 장갑, 등에 대 한 적절 한 개인 보호 장비와 실험실 벤치에서 실시 했다. 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 펜실베니아 대학에 의해 찬성 하는 프로토콜에 따라 수행 했다. 모든 노력, 동물 불편을 최소화 하 고 동물 인도적인 치료로 치료 했다.

1. LD 격리 응급실 격리 키트를 사용 하 여

1. 준비
   참고: 나열 된 금액은 단일 1 g 마우스 간에 적합 합니다.
   1. 초순의 8 mL와 5 x IE 버퍼의 2 개 mL를 희석 하 여 1 x isotonic 추출 버퍼 (IE 버퍼, 응급실 격리 키트에서) 10 mL를 준비 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 버퍼를 냉각 하십시오.
   2. 초순의 90 mL에 10 x PBS의 10 mL를 diluting 하 여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 100 mL를 준비 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.
   3. Diluting 500 µ L PGPE의 초순 9.5 mL에 의해 5% 폴 리 에틸렌 글리콜 p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-페 닐 에테르 (PGPE)의 10 mL를 준비 합니다. 1 mL 주사기를 사용 하 여 PGPE로 점성 측정. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.
   4. 얼음에 그들을 배치 하 여 모든 튜브를 쿨: 1.7 mL microcentrifuge 튜브, 15 mL 원심 분리기 튜브, 50 mL 고속 원심 분리기 튜브, 및 13 mL ultracentrifuge 튜브.
   5. 4 모든 필요한 원심 분리기 쿨 ° c: microcentrifuge, 15 ml 높은-용량 원심 분리기 튜브, 50 mL 튜브, 그리고는 ultracentrifuge에 대 한 고속 원심 분리기.
   6. 압력가 마로 소독 하 여 집게 및 해 부가 위를 소독.
2. 조직 준비
   1. 자 궁 경부 전위를 수행 하 여 10 분 확인 안락사에 대 한 100% CO₂ 로 가득 챔버에 그것을 배치 하 여 마우스를 안락사.
   2. 소독 집게와 해 부가 위, 복 부의 피부와 근육 층 간 노출 후부/앞 축에 잘라 사용 합니다.
   3. 격 막 및 장 간 연결 하는 인 대를 잘라. 집게를 사용 하 여 노출 인 대는 후부 쪽으로 간에서 소장을.
   4. 간 및 간 해방 때까지 후부 앞쪽에서 이동 등 흉 곽 간 절단.
   5. 차가운 5 cm 감기 1 x PBS의 10 mL를 페 트리 접시에 간 전송.
   6. 씻어 간 2 x 5 cm 배양 접시에에서 4 ° C에서 5 분에 대 한 차가운 1 x PBS의 10 mL에 락 플랫폼에. 최종 세척 후 1 x PBS에서 부 어.
   7. 크기-10 메 마른 외과 블레이드를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 간 5 cm 배양 접시 (그림 1A)에서 3-5 밀리미터 조각으로 주사위를.
   8. 세척 절단된 간 2 x 5 cm 배양 접시에에서 4 ° C에서 5 분에 대 한 차가운 1 x PBS의 10 mL와 함께.
      참고: 리소좀 격리, 전송 간 0.5 g 깨끗 한 45 mL 균질 화기 및 리소좀 추출에 의해 제공 된 지시에 따라 키트 ( 재료의 표참조).
   9. 1 x PBS를 가만히 따르다와 찬 45 mL Dounce 균질 화기를 절단된 간 조각 전송. 모든 조각은 균질 화기의 하단에가 서 확인 합니다.
   10. 감기 1 x IE 버퍼 (응급실 격리 kit)의 7 mL을 추가 하 고 20 x 위아래로 유 봉 이동 하 여 얼음에 균질. 유 봉이는 균질 화기의 하단에 각 뇌졸중 동안 확인 합니다.
   11. 차가운 15 mL 원심 분리기 튜브를 homogenate (그림 1B)를 전송 합니다.
   12. 감기 1 IE 버퍼 (응급실 격리 kit)에서 x의 1 mL와 함께 균질 화기를 헹 구 고는 homogenate의 나머지 부분을 추가.
3. LD 절연
   1. 4 ° C (그림 1C)에서 10 분에 1000 x g 대용량 원심 분리기에 homogenate centrifuging 핵을 제거 합니다.
   2. 새로운, 차가운 50 mL 원심 분리기 튜브 postnuclear 상쾌한 (PNS) 전송. LD 손실을 방지 하려면 15 mL 튜브의 상단에 모여 어떤 지질 PNS를 전송 하기 전에 resuspended을 확인 하십시오.
   3. 100 µ L의 순도 분석 PNS aliquot 고 차가운 1.7 mL microcentrifuge 튜브에. 그것은 얼음에 옆으로 설정 합니다.
   4. PNS 샘플, 하지는 약 수, 4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g 에서 냉장된 고속 원심 분리기에 원심 미토 콘 드리 아를 제거 하려면
      1. 옵션:: 원유 LD (CLD)와 (cytosol 세포 막 오염), 격리 유리 피 펫을 사용 하 여 최고의 지질 레이어를 수집 고 1.7 mL microcentrifuge 관에 그것을 전송. 1.4 섹션을 계속 합니다.
   5. Ultracentrifuge 튜브에 postmitochondrial 상쾌한 (PMS)를 전송 합니다. LD 손실을 방지 하려면 상단에 모여 어떤 지질은 PMS를 전송 하기 전에 resuspended는 확인 합니다.
   6. 100 µ L의 순도 분석에 대 한 PMS aliquot 고 차가운 1.7 mL microcentrifuge 튜브에. 그것은 얼음에 옆으로 설정 합니다.
   7. 테두리에는 ultracentrifuge 튜브를 튜브 ultracentrifugation 중 붕괴를 방지 하기 위해 IE 버퍼 x 감기 1 채우십시오.
   8. 샘플을 균형 그리고 100000 x g 4 ° c (그림 1D) 60 분에서 ultracentrifuge에 원심.
   9. LD 계층을 제거 하려면 45 ° 각도에서 튜브를 기울기 고 유리 피 펫을 사용 하 여 발음. 감기 1.7 mL microcentrifuge 튜브에 펠 릿을 전송.
      참고: 펠 릿에는 격리 된 응급실을 포함 되어 있습니다. 다운스트림이 분수를 사용 하 여 응급실 격리에 대 한.
   10. 순도 분석에 대 한 지질 층 아래 게시물-응급실 상쾌한 (당) 100 µ L를 수집 합니다.
4. LD 세척
   1. 1.3 mL의 총 볼륨 1.7 microcentrifuge 튜브에 수집 된 LD 분수 1 x PBS를 추가 합니다.
   2. 소용돌이 샘플입니다.
   3. 펠 렛의 모든 세포 파편을 4 ° C에서 5 분 최고 속도로 microcentrifuge에서 원심. Resuspend LD 레이어 수 있도록 손으로 부드럽게 튜브를 따뜻한. 상쾌한, 지질 층의 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브를 포함 하 여 전송 합니다.
   4. 반복 단계 1.4.1–1.4.3 2 x-3 x, 펠 릿은 더 이상 표시 될 때까지.
   5. 1.5 mL의 최종 볼륨을 표면에 뜨는 펠 렛 무료 LD를 1 x PBS를 추가 합니다. 워시 microcentrifuge 4 ° c.에서 5 분 최고 속도로 원심 분리 하 여 지질 분수
   6. 지질 층을 방해 하지 않고 유리 피 펫 사용 (지질 층) 아래 1 x PBS의 1 mL를 제거 합니다.
   7. 1.4.6, 1.4.5 단계를 반복 4 x-5 x, 1x PBS 시각적으로 투명 없이 탁 될 때까지.
   8. 모두 제거 유리 피 펫 (그림 1E)를 사용 하 여 지질 층 아래 1 x PBS.
   9. 결과, 순수 LD 분수를 사용 하 여 다운스트림 분석에 대 한.
5. Bicinchoninic 산 분석 결과 의해 LD 단백질 정량
   참고: 경우 LD 형태 평가 bicinchoninic 산 분석 결과 (BCA)를 사용 하지 마십시오.
   1. 5 %PGPE 500 μ에서 LD를 resuspend.
   2. 95 ° C에서 5 분에 대 한 샘플을 삶아 소용돌이 그들, 그리고 냉각 5 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어.
   3. 추가 2 x 1.5.2 단계를 반복 합니다.
   4. 30와 함께 5 분에 대 한 샘플을 sonicate s 온/오프 주기, 중간 강도.
   5. BCA 분석 결과 의해 모든 순도 분석 샘플 및 LD 분수 단백질 농도 측정 하 여 샘플을 정상화.

2. LD 격리 자당 밀도 그라디언트를 사용 하 여

1. 준비
   1. TE 버퍼 (10 mM Tris HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8.0]) 200 mL를 확인 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.
   2. 100 mL를 최종 볼륨을 데리고 테 버퍼에 자당의 60 g을 용 해 하 여 테 버퍼에서 60% (w/v) 자당 솔루션의 100 mL를 확인 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.
   3. 60% 자당의 4 mL 테 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 여 40% (w/v) 자당 솔루션의 6 mL를 확인 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.
   4. TE 버퍼의 3.5 mL에 60% 자당의 2.5 mL을 추가 하 여 25% (w/v) 자당 솔루션의 6 mL를 확인 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.
   5. 3.3 ml 테 버퍼의 60% 자당의 0.7 mL을 추가 하 여 10% (w/v) 자당 솔루션의 4 mL를 확인 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.
   6. 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 솔루션의 10 mL 테 버퍼의 10 mL를 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제의 1 개의 정제를 추가 하 여 확인 합니다.
   7. 60% 자당 재고 솔루션 50 mL에 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 솔루션의 4 mL를 추가 하 여 조직 homogenate 버퍼를 준비 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.
   8. TE 버퍼의 50 mL에 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 여 오버레이 버퍼를 준비 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.
   9. 초순의 90 mL에 10 x PBS의 10 mL를 희석 하 여 1 x PBS의 100 mL를 준비 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.
   10. 5%의 10 mL를 준비 diluting 500 µ L PGPE의 초순 9.5 mL에 의해 PGPE. 1 mL 주사기를 사용 하 여 PGPE로 점성 측정. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.
   11. 얼음에 그들을 배치 하 여 다음 원심 분리기 튜브를 쿨: 1.7 mL microcentrifuge 튜브, 15 mL 원심 분리기 튜브, 50 mL 고속 원심 분리기 튜브, 및 13 mL ultracentrifuge 튜브.
   12. 4 필요한 원심 분리기 쿨 ° c: microcentrifuge는, (15 mL 튜브)에 대 한 높은-용량 원심 분리기, 고속 원심 분리기 (50 mL), 튜브에 대 한 및는 ultracentrifuge.
2. 조직 준비
   1. 단계 1.2.1–1.2.9를 사용 하 여 조직 균질에 대 한 준비.
   2. 차가운 조직 homogenate 버퍼의 7 mL을 추가 하 고 20 x 위아래로 유 봉 이동 하 여 그것을 얼음에 균질. 처음 다섯 스트로크 동안는 유 봉이는 균질 화기의 하단을 확인 하십시오.
   3. 감기 15ml 원심 관에는 homogenate를 전송 합니다.
   4. 차가운 조직 homogenate 버퍼의 1 mL와 함께 균질 화기를 헹 구 고 이전에 사용한 15ml 원심 관에 그것을 전송.
   5. homogenate의 볼륨을가지고 조직 homogenate 버퍼와 최대 10 mL.
   6. 샘플 4 ° c.에서 10 분에 1000 x g 대용량 원심 분리기에 원심
   7. 상쾌한 8 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에 전송.
   8. PNS 순도 분석에 대 한 샘플으로 나머지 상쾌한의 100 µ L를 전송 합니다.
3. 자당 기온 변화도
   1. 포함 된 45 ° 각도로 PNS의 8 mL 50 mL 원심 분리기 튜브 기울기. 신중 하 게 두 단계를 별도 유지를 보장 하는 40% 자당 솔루션의 6 mL를 추가 합니다.
   2. 비슷한 패션에 천천히 추가 25% 자당 해결책; 6 mL 그런 다음 추가 4 mL의 10% 자당 해결책; 마지막으로, 오버레이 버퍼의 8 mL를 추가 합니다.
   3. 샘플 30 분에서 4 ° C에서 30000 x g 고속 원심 분리기에 원심
   4. 1.7 mL microcentrifuge 튜브에 LDs를 포함 하는 상위 계층을 전송 합니다.
   5. LD 세척 1.4 절의 단계를 따릅니다.

결과

우리는 약 30 쥐에 어 키트 LD 격리를 수행 하 고 약 40 쥐에 자당 격리 프로토콜을 따르고 그 결과 비교. 보고 된 연구 결과 두 프로토콜에 대 한 전형적인입니다. 마우스는 LD 수율을 높이기 위해 물에 자유 접근에와 함께 하룻밤 금식 했다. 자당 기온 변화도 사용 하 여 LD 격리 응급실 키트 LD 격리 프로토콜와 병렬로 실행 되었습니다. PNS, PMS, 샘플 당, CLDs, 그리고 LDs 응급실 ?...

토론

간장 LD 생물학은 점점 건강 및 질병에 간세포 생리학의 중요 한 레 귤 레이 터로 인식 되 고 있습니다. 타고 난 세포로 LDs는 동적와 상호 작용 다른 세포 구조, 지질 및 포도 당 항상성에서 포함 된 그들 bioactive 구성 요소에서 포함. 자당 그라데이션 LD 격리 일상적으로 사용 하 고 LD 구조, 연구 조사를 가능 하 게 하지만 그것은 수많은 버퍼를 만들기 위해 그들을 요구 한다. 우리는 증명 하고있다 상...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioExpress Vortex Mixer	GeneMate	S-3200-1	Vortex Mixer
Centrifuge 54242 R	Eppendorf	54242 R	Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 +	Thermo Scientific	RC6+	Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+	Thermo Scientific	Legend RT+	Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	04 693 116 001	Protease Inhibitor Tablets
Diagenode Bioruptur UCD-200	Diagenode	UCD-200	Sonication System
Dounce Tissue Grinder (45 mL)	Wheaton	357546	Use Loose pestle
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x)	Corning	21-031-CM
Endoplasmic Reticulum Isolation Kit	Sigma Aldrich	ER0100	For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea.
External light source for flourescent excitation	Leica	Leica EL6000
Hydrochloric acid	Sigma Aldrich	H1758	Hydrochloric Acid
ImageJ			Image Analysis Software
Inverted Modulating Contrast Microscope	Leica	Leica DM IRB
Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells	Thermo Fisher Scientific	89839	For Lysosome Isolation
Microscope Camera	Qimaging	QICAM fast 1394
Optima XL-100K Ultracentrifuge	Beckman-Coulter	XL-100K	Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	22-042817
Petri Dish 5 cm	Fisher Scientific	FB0875713A
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
PhosSTOP	Sigma Aldrich	04 906 845 001	Phosphatase Inhibior Tablets
Sterile Surgical Blade #10	Pioneer	S2646
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500	Crystalline/Certified ACS
Triglyceride Liquicolor Kit	Stanbio	2200-225	Colorimetric Triglyceride kit
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	For TE buffer
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151-100	5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)	Thermo Fisher Scientific	15575-038	For TE buffer