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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole établit une nouvelle méthode d’isolement de gouttelettes lipidiques et la purification du foie de souris, à l’aide d’un kit d’isolation bien établie du réticulum endoplasmique.

Résumé

Gouttelettes lipidiques (LDs) sont des organites bioactifs trouvés dans le cytosol de la plupart des eucaryotes et certaines cellules procaryotes. LDs sont composées de lipides neutres enveloppés par une monocouche de phospholipides et de protéines. Les lipides LD hépatiques, tels que les céramides et les protéines sont impliquées dans plusieurs maladies qui causent une stéatose hépatique. Bien que les méthodes précédentes ont été établies pour l’isolement de la LD, ils nécessitent une longue préparation des réactifs et ne sont pas conçus pour l’isolement de plusieurs compartiments subcellulaires. Nous avons cherché à établir un nouveau protocole permettant l’isolement de LDs, réticulum endoplasmique (re) et de lysosomes une seule foie de souris.

En outre, tous les réactifs utilisés dans le protocole présenté ici sont disponibles commercialement et requièrent une préparation minimale réactif sans sacrifier la pureté de la LD. Ici, nous présentons des données comparant ce nouveau protocole à un protocole de gradient de saccharose standard, démontrant le rendement, la morphologie et la pureté comparable. En outre, nous pouvons isoler ER et les lysosomes en utilisant le même exemple, donnant un aperçu détaillé dans la formation et le flux intracellulaire des lipides et les protéines associées.

Introduction

LDs sont des organites bioactifs dans le cytosol des cellules eucaryotes plus et certaines cellules procaryotes1,2,3. L’âme de LD est composée de lipides neutres tels que les esters de cholestérol et de triglycérides (TG). Elles contiennent également des céramides, lipides bioactifs impliqués dans cellulaire signalisation voies4,5. LDs sont entourés d’une monocouche de phospholipides et recouvert de protéines, y compris le perilipin protéines perilipin 2 (PLIN2) et 3 (PLIN3)1,5,6. Sont également présents lipogenic enzymes lipases et des protéines membranaires trafic qui ont été associées à plusieurs maladies de stéatose hépatiques, y compris la stéatose hépatique non-alcoolique, maladie alcoolique du foie et l’hépatite C3,5 ,6,7,8,9,10.

LDs sont censés se forment de la membrane externe de l’ER et contiennent nouvellement synthétisée TG provenant des acides gras dérivés ER11. Cependant, il reste inconnu si les lipides regroupées IUN, connectés en permanence, ou sont excisés de l’ER6,11, rendant l’isolement de LDs exempts de ER techniquement difficile. Acides gras libres peut être libérées de LDs par l’action des lipases surfaces de prévoir la production d’énergie ou de la synthèse de la membrane. En outre, LDs peuvent être dégradées par l’intermédiaire de lipophagy comme un mécanisme de régulation et de produire des acides gras libres,12.

Outre l’ER et les lysosomes, il y a des autres organites — comme les mitochondries, endosomes, peroxysomes et la membrane plasmique — qui se trouvent au sein de l’association étroite de LDs11. Cette polygamie serrée, il est difficile d’effectuer une extraction pure de la LD. Cependant, densité faible innée des lipides neutres peut être mises à profit par centrifugation5.

Traditionnellement, le LDs ont été isolés à l’aide d’un saccharose densité gradient1,5,13. Cependant, ces méthodes n’ont pas été conçus pour isoler les autres organites. En outre, ils exigent la longue préparation des réactifs. Ce protocole s’adapte un isolement ER commercialement disponible nécessaire (voir la Table des matières) pour permettre à l’isolement de la LD. Nous utilisons le tampon d’extraction fourni par le kit, en ajoutant une étape d’isolement de LD. En outre, le protocole peut également servir pour ER et l’isolement lysosomal en utilisant les mêmes échantillons, ce qui permet une image plus complète du cycle de vie de LDs. Pour valider cette nouvelle méthode, nous dosage LD rendement, morphologie, taille et la pureté. Nous comparons les résultats présentés ici à celles obtenues avec un protocole largement utilisé en utilisant un gradient de saccharose pour l’isolement de la LD.

Nous avons utilisé un 10 à 12-week-old, souris C57BL/6 femelle de 20 g à jeun pendant 16 h (retrait de nourriture à 17:00 pendant une période d’isolement de LD 09:00) avec un accès gratuit à l’eau. Le rendement typique de TG est de 0,6 mg/g de foie, et pour la protéine LD, c’est 0,25 mg/g de foie. Ceci fournit suffisamment d’éléments pour l’immuno-blot ~ 10 par SDS PAGE. Le protocole ci-dessous détaille les réactifs utilisés et un protocole adapté à un foie unique de 1 g. Le protocole d’isolement dégradé de saccharose est adapté de Sato,14 et15de la Wu.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées sur un banc de laboratoire avec des équipements de protection individuelle appropriés pour la prévention des risques biotechnologiques, niveau 1, y compris une blouse, des gants et des lunettes de sécurité. Des expériences ont été réalisés selon les protocoles approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Pennsylvanie. Tous les efforts ont été faits pour minimiser l’inconfort animale et les animaux ont été traités avec soins compatissants.

1. isolement de LD à l’aide d’un kit d’isolation ER

  1. Préparation
    Remarque : Les montants indiqués sont adaptés pour un foie de souris unique de 1 g.
    1. Préparer 10 mL de 1 x extraction isotonique tampon (buffer IE, de la trousse d’isolement ER) en diluant 2 mL de tampon de IE 5 x 8 ml d’eau ultrapure. Cool le tampon en le plaçant sur la glace.
    2. Préparer 100 mL 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en diluant 10 mL de PBS de x 10 dans 90 mL d’eau ultrapure. Refroidir en le plaçant sur la glace.
    3. Préparer 10 mL d’éther de phényle-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) p5 % polyéthylèneglycol (PGPE) en diluant 500 µL du PGPE à 9,5 mL d’eau ultrapure. Utiliser une seringue de 1 mL pour doser comme il est visqueux PGPE. Refroidir en le plaçant sur la glace.
    4. Cool tous les tubes en les plaçant sur la glace : tubes de microcentrifuge de 1,7 mL, tubes à centrifuger 15 mL, tubes de centrifugeuse à grande vitesse de 50 mL et 13 mL ultracentrifugeuse tubes.
    5. Cool tous les centrifugeuses à 4 ° c : une micro-centrifugeuse, une centrifugeuse de haute capacité pour 15 mL tubes, une centrifugeuse à grande vitesse pour tubes de 50 mL et une ultracentrifugeuse.
    6. Stériliser les ciseaux pincette et la dissection à l’autoclave.
  2. Préparation du tissu
    1. Euthanasier la souris en le plaçant dans une chambre remplie de 100 % CO2 pendant 10 min. confirmer l’euthanasie en effectuant la dislocation cervicale.
    2. À l’aide d’une pince stérile et ciseaux de dissection, couper les couches de la peau et des muscles de l’abdomen sur l’axe antérieur/postérieur pour exposer le foie.
    3. Couper les ligaments reliant le foie à la membrane et l’intestin. Avec pince pour tirer l’intestin de la foie, vers la partie postérieure, d’exposer les ligaments.
    4. Couper entre le foie et la cage thoracique dorsale, passant d’antérieur postérieur jusqu'à ce que le foie est libéré.
    5. Transférer le foie d’un froid 5 cm boîte de pétri avec 10 mL de PBS 1 x contre le rhume.
    6. Laver le foie 2 x sur une plate-forme bascule dans 10 mL de PBS 1 x contre le rhume pendant 5 min à 4 ° C dans la boîte de pétri de 5 cm. Décanter la solution PBS 1 x après le lavage final.
    7. Utilisez une lame chirurgicale stérile de taille-10 (voir la Table des matières) à couper en dés le foie en morceaux de 3 à 5 mm dans les 5 cm boîte de pétri (Figure 1 a).
    8. Laver le foie en dés de 2 x 10 ml de PBS 1 x contre le rhume pendant 5 min à 4 ° C dans la boîte de pétri de 5 cm.
      Remarque : Pour l’isolement du lysosome, transférer 0,5 g de foie dans un homogénéisateur propre 45 mL et suivre les indications fournies par l’extraction de lysosome nécessaire (voir la Table des matières).
    9. Décanter la solution 1 PBS x et transférer les morceaux de foie en dés à la froide 45 mL Dounce homogénéisateur. S’assurer que toutes les pièces vont au fond de l’homogénéisateur.
    10. Ajouter 7 mL de tampon IE froid 1 x (à partir de la trousse d’isolement ER) et homogénéiser sur glace en déplaçant le pilon et descendre de 20 x. Veiller à ce que le pilon va au fond de l’homogénéisateur pendant chaque course.
    11. Transférer l’homogénat (Figure 1 b) dans un tube à centrifuger froid 15 mL.
    12. Rincer l’homogénéisateur avec 1 mL de froid 1 x tampon de IE (à partir de la trousse d’isolement ER) et l’ajouter au reste de l’homogénat.
  3. Isolement de LD
    1. Enlever les noyaux en CENTRIFUGEANT l’homogénat dans une centrifugeuse de haute capacité à 1 000 x g pendant 10 min à 4 ° C (Figure 1).
    2. Transférer le surnageant post-nucléaire (PNS) dans un tube à centrifuger nouvelle, froid 50 mL. Pour éviter toute perte de LD, faire en sorte que tout lipide se sont réuni au sommet du tube de 15 mL est resuspendu avant de transférer le PNS.
    3. Prendre une 100 µL aliquote de la PNS pour analyse de pureté et le placer dans un tube de microcentrifuge froid 1,7 mL. Mettre de coté sur la glace.
    4. Pour supprimer des mitochondries, centrifuger l’échantillon PNS, pas l’aliquote, dans une centrifugeuse à grande vitesse à 12 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
      1. En option: pour les isolats de LD (CLD) brut (avec contamination cytosol et membrane cellulaire), recueillir la couche lipidique haut de la page à l’aide d’une pipette de verre et transférez-le dans un tube de microcentrifuge de 1,7 mL. Continuez à la section 1.4.
    5. Transférer le surnageant postmitochondrial (PMS) dans un tube ultracentrifugeuse. Pour éviter toute perte de LD, veiller à ce que les lipides se sont réunis au sommet est resuspendu avant de transférer le PMS.
    6. Prendre une 100 µL aliquote de la PMS pour analyse de pureté et le placer dans un tube de microcentrifuge froid 1,7 mL. Mettre de coté sur la glace.
    7. Remplir un tube ultracentrifugeuse à ras bord avec froid 1 x tampon de IE pour empêcher le tube s’effondrer pendant l’ultracentrifugation.
    8. Équilibrer les échantillons et les centrifuger dans une ultracentrifugeuse à 100 000 x g pendant 60 min à 4 ° C (Figure 1).
    9. Pour enlever la couche de LD, le tube à un angle de 45° d’inclinaison et utiliser une pipette de verre pour aspirer. Transférer le culot dans un tube de microcentrifuge froid 1,7 mL.
      Remarque : Le culot contient ER isolé. Utilisez cette fraction en aval pour l’isolement de l’ER.
    10. Prélever 100 µL de surnageant post-ER (PER) sous la couche lipidique pour analyse de pureté.
  4. Lavage de LD
    1. Ajouter 1 x PBS à la fraction de LD recueillie dans un tube de microcentrifuge 1,7, pour un volume total de 1,3 mL.
    2. Vortex de l’échantillon.
    3. Centrifuger dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant 5 min à 4 ° C pour granuler les débris cellulaires. Chauffer le tube doucement avec les mains afin de remettre la couche de LD. Transférer le surnageant, y compris la couche lipidique, dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,7 mL.
    4. Répétez les étapes 1.4.1–1.4.3 2 x x-3, jusqu'à ce que le culot n’est plus visible.
    5. Ajouter 1 x PBS à la LD exempt de pellet surnageant pour un volume final de 1,5 mL. Laver la fraction lipidique par centrifugation dans un microcentrifuge à vitesse maximale pendant 5 min à 4 ° C.
    6. Retirer 1 mL de solution de 1 PBS x (en dessous de la couche lipidique) avec une pipette de verre sans déranger la couche lipidique.
    7. Répétez les étapes 1.4.5 et 1.4.6 4 x x-5, jusqu'à ce que le PBS 1 x est visuellement transparent avec aucune turbidité.
    8. Supprimer tous les PBS 1 x sous la couche de lipides, à l’aide d’une pipette de verre (Figure 1E).
    9. Utiliser le résultat, une proportion de LD pur pour analyse en aval.
  5. Dosage de protéines LD par dosage acide bicinchoninic
    Remarque : N’utilisez pas un dosage d’acide bicinchoninic (BCA) si la morphologie LD doit être évaluée.
    1. Resuspendre le LD dans 500 μL de PGPE 5 %.
    2. Faire bouillir les échantillons pendant 5 min à 95 ° C, vortex et incuber les échantillons à la température ambiante pendant 5 min refroidir.
    3. Répétez l’étape 1.5.2 un x 2 supplémentaires.
    4. Laisser agir les échantillons pendant 5 min avec un 30 s on/off cycle, à intensité moyenne.
    5. Normaliser les échantillons en mesurant la concentration de protéines dans tous les échantillons d’analyse de pureté et de la fraction de LD par dosage de la BCA.

2. isolement de LD à l’aide de gradient de densité de saccharose

  1. Préparation
    1. Faire 200 mL de tampon TE (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM EDTA [pH 8.0]). Refroidir en le plaçant sur la glace.
    2. Faire 100 mL de solution de sucrose à 60 % (p/v) dans un tampon TE dissoudre 60 g de saccharose en tampon TE, ce qui porte le volume final à 100 mL. Refroidir en le plaçant sur la glace.
    3. Faire 6 mL de solution de sucrose à 40 % (p/v) en ajoutant 4 mL de 60 % de sucrose à 2 mL de tampon TE. Refroidir en le plaçant sur la glace.
    4. Faire 6 mL de solution de saccharose de 25 % (p/v) en ajoutant 2,5 mL de 60 % de sucrose à 3,5 mL de tampon TE. Refroidir en le plaçant sur la glace.
    5. Faire 4 mL de solution sucrée 10 % (p/v) en ajoutant 0,7 mL de 60 % de sucrose à 3,3 mL de tampon TE. Refroidir en le plaçant sur la glace.
    6. Faire 10 mL de solution d’inhibiteur de la protéase et la phosphatase en ajoutant une pastille d’inhibiteurs de la protéase et la phosphatase dans 10 mL de tampon de TE.
    7. Préparer, tampon homogénat tissulaire en ajoutant 4 mL de solution d’inhibiteur de la protéase et la phosphatase à 50 mL de solution mère 60 % de saccharose. Refroidir en le plaçant sur la glace.
    8. Préparer, tampon de superposition en ajoutant 2 mL de solution d’inhibiteur de la protéase et de la phosphatase dans 50 mL de tampon de TE. Refroidir en le plaçant sur la glace.
    9. Préparer 100 mL de solution 1 PBS x en diluant 10 mL de PBS de x 10 dans 90 mL d’eau ultrapure. Refroidir en le plaçant sur la glace.
    10. Préparer 10 mL de 5 % PGPE en diluant 500 µL du PGPE à 9,5 mL d’eau ultrapure. Utiliser une seringue de 1 mL pour doser comme il est visqueux PGPE. Refroidir en le plaçant sur la glace.
    11. Refroidir les tubes de centrifugeuse suivants en les plaçant sur la glace : tubes de microcentrifuge de 1,7 mL, tubes à centrifuger 15 mL, tubes de centrifugeuse à grande vitesse de 50 mL et 13 mL ultracentrifugeuse tubes.
    12. Cool les centrifugeuses nécessaires à 4 ° c : une micro-centrifugeuse, une centrifugeuse de haute capacité (pour les tubes de 15 mL), une centrifugeuse à grande vitesse (pour les tubes de 50 mL) et une ultracentrifugeuse.
  2. Préparation du tissu
    1. 1.2.1–1.2.9 étapes permet de préparer le tissu pour l’homogénéisation.
    2. Ajouter 7 mL de tampon d’homogénat tissulaire froid et il homogénéiser sur glace en déplaçant le pilon et descendre de 20 x. Pendant les cinq premières courses, assurer que le pilon va au fond de l’homogénéisateur.
    3. Transférer l’homogénat dans un tube à centrifuger froid 15 mL.
    4. Rincez l’homogénéisateur avec 1 mL de tampon d’homogénat tissulaire froid et transférez-le dans le tube à centrifuger précédemment utilisé 15 mL.
    5. Porter le volume de l’homogénat jusqu'à 10 mL avec du tampon de l’homogénat tissulaire.
    6. Centrifuger l’échantillon dans une centrifugeuse de haute capacité à 1 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
    7. Transfert 8 mL du surnageant dans un tube à centrifuger 50 mL.
    8. Transférer 100 µL de surnageant restant comme échantillon PNS pour analyse de pureté.
  3. Gradient de saccharose
    1. Incliner le tube de centrifuger de 50 mL contenant les 8 mL de billets à ordre à un angle de 45°. Ajouter avec précaution les 6 mL de solution de sucrose à 40 %, assurant que les deux phases restent séparés.
    2. De manière similaire, ajouter lentement 6 mL de solution de 25 % de saccharose ; puis, ajouter 4 mL de solution de 10 % de saccharose ; Enfin, ajoutez 8 mL de tampon de superposition.
    3. Centrifuger l’échantillon dans une centrifugeuse à grande vitesse à 30 000 x g à 4 ° C pendant 30 min.
    4. Transférer la couche supérieure contenant le LDs dans un tube de microcentrifuge de 1,7 mL.
    5. Pour le lavage de la LD, suivez les étapes dans la section 1.4.

Résultats

Nous avons effectué l’isolement de LD avec le kit ER sur environ 30 souris et comparé les résultats avec ceux qui suivent le protocole d’isolement de saccharose sur environ 40 souris. Les résultats obtenus sont typiques pour les deux protocoles. Souris ont jeûné pendant la nuit avec libre accès à l’eau, pour augmenter le rendement de la LD. Isolement de LD à l’aide d’un gradient de saccharose a été exécuté en parallèle avec le kit ER protocole d’isolement de LD. ...

Discussion

Biologie hépatique de LD n’est plus en plus reconnue comme un régulateur critique de physiologie hépatocellulaire dans santé et maladie. Organites de bonne foi, LDs sont dynamiques, interagir avec d’autres structures cellulaires et contiennent au sein des composants bioactifs eux impliqués dans l’homéostasie des lipides et de glucose. Le gradient de saccharose est couramment utilisé pour l’isolement de la LD et permet aux chercheurs d’étudier la structure de la LD, mais aurait besoin de faire de nombreu...

Déclarations de divulgation

Dr Carr bénéficie du soutien de la recherche de produits pharmaceutiques d’intercepter.

Remerciements

Nous remercions la famille de Abramson Cancer Research Institute. Ce travail est soutenu par les subventions suivantes : NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos Medical Faculty Development Award, 7158, IDOM RDC pilote prix P30 DK019525 (R.M.C.) ; NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Ce travail a été soutenu en partie par le NIH P30-DK050306 et ses installations de base (pathologie moléculaire et Imaging Core, biologie moléculaire/Gene Expression Core et Core de Culture de cellules) et son projet pilote du programme de subventions. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
BioExpress Vortex MixerGeneMateS-3200-1Vortex Mixer
Centrifuge 54242 REppendorf54242 RRefrigerated Counter Microcentrifuge
Rotor: FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 +Thermo ScientificRC6+Refrigerated High Speed Centrifuge
Rotor: F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+Thermo ScientificLegend RT+Refrigerated High Capacity Centrifuge
Rotor: 75006445 Bucket: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor CocktailSigma Aldrich04 693 116 001Protease Inhibitor Tablets
Diagenode Bioruptur UCD-200DiagenodeUCD-200Sonication System
Dounce Tissue Grinder (45 mL)Wheaton357546Use Loose pestle
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x)Corning21-031-CM
Endoplasmic Reticulum Isolation KitSigma AldrichER0100For ER kit Extraction:
Contains:
Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL
Hypotonic Extraction Buffer 10 mL
Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL
OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL
Blunt Nosed Needle 1 ea.
External light source for flourescent excitationLeicaLeica EL6000
Hydrochloric acidSigma AldrichH1758Hydrochloric Acid
ImageJImage Analysis Software
Inverted Modulating Contrast MicroscopeLeicaLeica DM IRB
Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured CellsThermo Fisher Scientific89839For Lysosome Isolation
Microscope CameraQimagingQICAM fast 1394
Optima XL-100K UltracentrifugeBeckman-CoulterXL-100KUltracentrifuge
Rotor: SW41Ti
Pasteur PipettesFisher Scientific22-042817
Petri Dish 5 cmFisher ScientificFB0875713A
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
PhosSTOPSigma Aldrich04 906 845 001Phosphatase Inhibior Tablets
Sterile Surgical Blade #10PioneerS2646
SucroseFisher ScientificS5-500Crystalline/Certified ACS
Triglyceride Liquicolor KitStanbio 2200-225Colorimetric Triglyceride kit
Tris BaseFisher ScientificBP152-1For TE buffer
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151-1005%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)Thermo Fisher Scientific15575-038For TE buffer

Références

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