JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот Протокол устанавливает новый метод изоляции капелька липидов и очистки от мыши печень, используя набор для изоляции устоявшихся эндоплазматического ретикулума.

Аннотация

Липидного капель (LDs) являются биологически органеллы в цитозоле наиболее эукариот и некоторые прокариотических клеток. LDs состоят из нейтральных липиды, заключенная в монослое белков и фосфолипидов. Печеночная LD липиды, церамиды, и белки причастны несколько заболеваний, которые вызывают печеночная стеатоз. Хотя предыдущие методы были созданы для изоляции LD, они требуют длительной подготовки реагентов и не предназначены для изоляции несколько субцеллюлярные отсеков. Мы стремились создать новый протокол для включения изоляции LDs, эндоплазматический ретикулум (ER) и лизосом из одной мыши печени.

Кроме того, все реактивы, используемые в протоколе, представленные здесь являются коммерчески доступными и требуют минимальной реагент подготовки без ущерба для LD чистоты. Здесь мы представляем данные сравнения этот новый протокол к стандартным сахарозы градиента протокол, демонстрируя сопоставимых чистоты, морфология и урожайность. Кроме того мы может изолировать ER и лизосомы, с использованием того же образца, обеспечивая подробное понимание формирования и внутриклеточных потока липидов и их связанные белков.

Введение

LDs являются биологически органеллы в цитозоле наиболее эукариотических клеток и2,некоторые прокариотических клеток в1,3. LD ядро состоит из нейтральные липиды как эфиры холестерина и триглицеридов (ТГ). Они также содержат Церамиды, биоактивных липиды, участвующих в клеточном сигнальных путей4,5. LDs окружены фосфолипидного монослоя и покрытием с белками, включая perilipin белки perilipin 2 (PLIN2) и 3 (PLIN3)1,5,6. Также присутствуют lipogenic ферменты, липазы и мембранных белков людьми, которые были связаны с несколькими steatotic заболеваниях печени, включая безалкогольного наварного заболевания печени, алкогольная болезнь печени и гепатит C3,5 ,6,,78,9,10.

Подуманы, что LDs от внешней мембраны ER и содержат заново синтезированные TG, получены из11ER-производные свободных жирных кислот. Однако, остается неизвестным, ли Объединенные липиды бутон, остаются подключенными, или вырезана из ER6,11, делает изоляцию LDs от технически сложных ER. Свободные жирные кислоты могут быть освобождены от LDs действием поверхности липазы для производства энергии или синтеза мембранных. Кроме того может снизиться LDs через lipophagy механизм регулирования, а также производить свободные жирные кислоты12.

Помимо ER и лизосомы, есть другие органеллы — например, митохондрии, endosomes, пероксисомы и плазматической мембраны — которые находятся в тесной взаимосвязи LDs11. Этот плотный полигамии делает его трудным для выполнения чисто LD добычи. Тем не менее нейтральные липиды врожденной низкой плотности могут быть приняты преимущество через центрифугирования5.

Традиционно LDs были изолированы с помощью сахарозы плотность градиента1,5,13. Однако эти методы не предназначены для изоляции другие органеллы. Кроме того они требуют длительной подготовки реагентов. Этот протокол адаптируется коммерчески доступных ER изоляции комплект (см. Таблицу материалов) для изоляции LD. Мы используем извлечения буфер, предоставленный набор, добавив LD изоляции шаг. Кроме того протокол может также использоваться для ER и лизосомальных изоляции с помощью же образцы, позволяющие более подробное изображение жизненного цикла LDs. Чтобы проверить этот новый метод, мы пробирного выход LD, морфология, размер и чистоты. Мы сравниваем результаты, представленные здесь для тех, кто получил с широко используемый протокол, используя градиент сахарозы для изоляции LD.

Мы использовали 10 к 12-week-old, 20 g, женский C57BL/6 мышь постился 16 h (удаление продовольствия в 5:00 вечера время изоляции LD 9.00) с свободный доступ к воде. Типичный выход для TG 0.6 мг/г печени, и LD белка, это 0,25 мг/г печени. Это обеспечивает достаточно материала для ~ 10 иммуноблотов, SDS-страницы. Протокол ниже подробности реагентов, используемых и протокол для одного 1 g печени. Протокол градиента изоляции сахарозы заимствован из Сато14 и15Ву.

протокол

Все эксперименты проводились на лабораторном столе с личного защитного оборудования для биобезопасности уровня 1, включая лаборатории пальто, перчатки и защитные очки. Эксперименты были проведены согласно протоколов, одобренных институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Пенсильвания. Все усилия были сделаны для сведения к минимуму дискомфорт животных, а Животные лечились с гуманной помощи.

1. LD изоляции с помощью набора для изоляции ER

  1. Подготовка
    Примечание: Перечисленные суммы подходят для одного 1 g мыши печени.
    1. Подготовка 10 мл 1 x изотонический экстракция буферу (IE, из комплекта изоляции ER) путем разбавления 2 мл 5 x IE буфера с 8 мл ультрачистая вода. Прохладный буфера, поместив его на льду.
    2. Подготовка путем разбавления 10 мл 10 x PBS в 90 мл ультрачистая вода 100 мл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS). Охладить его, поместив его на льду.
    3. Подготовка 10 мл 5% полиэтиленгликоль p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-фенил эфира (PGPE) путем разбавления 500 мкл PGPE в 9,5 мл ультрачистая вода. Используйте 1 мл шприц для измерения из PGPE как это вязка. Охладить его, поместив его на льду.
    4. Прохладный все трубы, поместив их на льду: трубы microcentrifuge 1,7 мл, 15 мл пробирок, 50 мл высокоскоростной пробирок и 13 мл ультрацентрифуга трубы.
    5. Прохладный все необходимые центрифуги до 4 ° C: microcentrifuge, высокопроизводительные центрифуги для 15 мл пробирок, Высокоскоростные центрифуги для 50 мл трубки и ультрацентрифугирования.
    6. Стерилизация автоклавированием щипцы и Рассечение ножницами.
  2. Подготовка тканей
    1. Усыпить мыши, поместив его в камере заполнены с 100% CO2 на 10 мин подтверждение эвтаназии, выполняя шейки матки дислокации.
    2. Использование стерильный пинцет и Рассечение ножницами, вырезать слои кожи и мышц живота на задней/передней оси подвергать печени.
    3. Вырежьте связки подключения печени диафрагмой и кишечника. Используйте пинцет, чтобы вытащить кишечника от печени, направлении кзади, подвергать связок.
    4. Режут между печени и спинной грудную клетку, переходя от впереди кзади до печени высвобождается.
    5. Передать печени холодной 5 см Петри с 10 мл холодного ПБС.
    6. Вымойте печени 2 x на качающейся платформе в 10 мл холодного ПБС 5 минут при температуре 4 ° C в 5 см Петри. Слить ПБС после окончательной стирки.
    7. Используйте стерильные хирургические лезвия размер-10 (см. Таблицу материалы) нарезать печень на куски 3 – 5 мм в 5 см Петри (рис. 1A).
    8. Мыть кубиками печени 2 x 10 мл холодного ПБС 5 минут при температуре 4 ° C в 5 см Петри.
      Примечание: Для изоляции Лизосома, передать гомогенизатор чистой 45 мл 0,5 г печени и следуйте инструкциям, поставляемых лизосома добыча комплект (см. Таблицу материалов).
    9. Декант ПБС и передать холодных 45 мл Dounce гомогенизатор нарезанные кусочки печени. Убедитесь, что все кусочки перейдите к нижней части гомогенизатора.
    10. Добавление 7 мл холодного 1 x IE буфера (из комплекта изоляции ER) и гомогенизации на льду, перемещая пестик вверх и вниз 20 x. Убедитесь, что толкателем идет к нижней части гомогенизатор во время каждого штриха.
    11. Передать холодной 15 мл пластиковых пробирок огневки (рис. 1B).
    12. Промойте гомогенизатор с 1 мл холодного 1 x IE буфера (из комплекта изоляции ER) и добавить в остальной части огневки.
  3. LD изоляции
    1. Удалите ядер центрифугированием огневки в высокопроизводительные центрифуги на 1000 x g 10 мин при температуре 4 ° C (рис. 1 c).
    2. Передать новый, холодная 50 мл пластиковых пробирок шпагу супернатант (ПНС). Чтобы предотвратить потерю LD, убедитесь, что любой липидов, собрались в верхней части трубки 15 мл высокомобильна перед передачей векселей.
    3. Взять 100 мкл аликвота векселей для чистоты анализа и поместите его в холодной 1,7 мл microcentrifuge. Отложите на льду.
    4. Чтобы удалить митохондрий, центрифуга ПНС образца, не Алиготе, в охлажденных высокоскоростной центрифуги на 12000 x g 15 мин при 4 ° C.
      1. Необязательный: для сырой LD (ХЗЛ) изолятов (загрязненные цитозоле и клеточной мембраны), собирать лучшие липидного слоя с помощью пипетки стеклянные и перенести его на пробки microcentrifuge 1,7 мл. Далее в разделе 1.4.
    5. Передачи postmitochondrial супернатант (PMS) ультрацентрифуга трубки. Чтобы предотвратить потерю LD, убедитесь, что любой липидов, собрались в верхней высокомобильна перед передачей PMS.
    6. Взять 100 мкл аликвота ПМС для чистоты анализа и поместите его в холодной 1,7 мл microcentrifuge. Отложите на льду.
    7. Заполните ультрацентрифуга трубки к brim с холодной 1 x IE буфер для предотвращения трубки, рушится во время ultracentrifugation.
    8. Баланс образцы и центрифуги их в ультрацентрифуга на 100,000 x g 60 мин при температуре 4 ° C (рис. 1 d).
    9. Чтобы удалить слой LD, наклона трубы под углом 45° и использовать Пипетки стеклянные для аспирационная. Передать пробки microcentrifuge холодной 1,7 мл гранул.
      Примечание: Гранулы содержит изолированные ER. Используйте эту часть по течению для ER изоляции.
    10. Сбор 100 мкл супернатант пост ER (PER) под липидного слоя для чистоты анализа.
  4. LD Стиральная
    1. Добавьте ПБС LD дроби, собранных в 1.7 microcentrifuge трубку, чтобы суммарный объем 1,3 мл.
    2. Вихрь образца.
    3. Центрифуга в microcentrifuge за 5 мин при 4 ° C для любой ячейки мусор на гранулах с максимальной скоростью. Теплый трубку осторожно с руки, чтобы помочь Ресуспензируйте LD слой. Передача супернатанта, включая липидного слоя, чтобы новые пробки microcentrifuge 1,7 мл.
    4. Повторите шаги 1.4.1–1.4.3 2 x x-3, до тех пор, пока гранулы больше не видна.
    5. Добавьте ПБС в Пелле бесплатно LD супернатанта окончательный объемом 1,5 мл. Вымойте липидная фракция центрифугированием в microcentrifuge на максимальной скорости в течение 5 мин при 4 ° C.
    6. Удаление 1 мл ПБС (под липидного слоя) с стеклянной пипетки не нарушая липидного слоя.
    7. Повторите шаги 1.4.5 и 1.4.6 4 x x-5, до тех пор, пока ПБС визуально прозрачный с не мутность.
    8. Удалить все ПБС ниже липидного слоя, с помощью стеклянной пипетки (Рисунок 1E).
    9. Используйте результат, чистого долю LD, ниже по течению анализа.
  5. LD белка количественный, bicinchoninic кислоты пробирного
    Примечание: Не используйте Пробирная bicinchoninic кислоты (BCA) Если LD морфология должна оцениваться.
    1. Ресуспензируйте LD в 500 мкл PGPE 5%.
    2. Сварить образцы для 5 мин при 95 ° C, вихрь и Проинкубируйте образцы при комнатной температуре на 5 минут для охлаждения.
    3. Повторите шаг 1.5.2 дополнительные 2 x.
    4. Sonicate образцы для 5 мин с 30 s/выключения цикла, на средней интенсивности.
    5. Нормализовать образцов путем измерения концентрации белка во всех пробах анализ чистоты и в LD фракции пробирного BCA.

2. LD изоляции, используя градиент плотности сахарозы

  1. Подготовка
    1. Сделайте 200 мл TE буфера (10 мм трис-HCl [рН 7,4], 1 мм ЭДТА [рН 8,0]). Охладить его, поместив его на льду.
    2. Сделать 100 мл раствора сахарозы 60% (w/v) в буфере TE, растворяя 60 г сахарозы в TE буфера, в результате чего окончательный объем 100 мл. Охладить его, поместив его на льду.
    3. Сделайте 6 мл раствора сахарозы 40% (w/v) путем добавления 4 мл 60% сахарозы в 2 мл TE буфера. Охладить его, поместив его на льду.
    4. Сделайте 6 мл раствора сахарозы 25% (w/v) путем добавления 2,5 мл 60% сахарозы в 3,5 мл TE буфера. Охладить его, поместив его на льду.
    5. Сделайте 4 мл раствора сахарозы 10% (w/v) путем добавления 0,7 мл 60% сахарозы в 3,3 мл TE буфера. Охладить его, поместив его на льду.
    6. Сделайте 10 мл раствора ингибитор протеазы и фосфатазы, добавив одну таблетку ингибиторов протеаз и фосфатазы 10 мл TE буфера.
    7. Подготовка тканей огневки буфера путем добавления 4 мл раствора ингибитор протеазы и фосфатазы 50 мл 60% раствор сахарозы. Охладить его, поместив его на льду.
    8. Подготовьте оверлея буфера путем добавления 2 мл раствора ингибитор протеазы и фосфатазы 50 мл TE буфера. Охладить его, поместив его на льду.
    9. Подготовка 100 мл ПБС путем разбавления 10 мл 10 x PBS в 90 мл ультрачистая вода. Охладить его, поместив его на льду.
    10. Подготовка 10 мл 5% PGPE путем разбавления 500 мкл PGPE в 9,5 мл ультрачистая вода. Используйте 1 мл шприц для измерения из PGPE как это вязка. Охладить его, поместив его на льду.
    11. Прохладный следующие пробирок, поместив их на льду: трубы microcentrifuge 1,7 мл, 15 мл пробирок, 50 мл высокоскоростной пробирок и 13 мл ультрацентрифуга трубы.
    12. Прохладный необходимые центрифуги до 4 ° C: в microcentrifuge, высокопроизводительные центрифуги (для 15 мл пробирок), высокоскоростной центрифуги (для 50 мл трубки) и ультрацентрифугирования.
  2. Подготовка тканей
    1. Используйте 1.2.1–1.2.9 шаги для подготовки ткани для гомогенизации.
    2. Добавление 7 мл холодного ткани огневки буфера и гомогенизации на льду, перемещая пестик вверх и вниз 20 x. В течение первых пяти штрихов убедитесь, что толкателем идет к нижней части гомогенизатора.
    3. Гомогенат трутневых передать холодной 15 мл пластиковых пробирок.
    4. Промойте гомогенизатор с 1 мл холодного ткани огневки буфера и перенести его на ранее использовавшихся 15 мл пластиковых пробирок.
    5. Довести объем огневки до 10 мл с буфером огневки ткани.
    6. Центрифугуйте образцы в высокопроизводительные центрифуги на 1000 x g 10 мин при 4 ° C.
    7. Передача 8 мл супернатант 50 мл пластиковых пробирок.
    8. Передачи 100 мкл оставшиеся супернатанта как ПНС образца для чистоты анализа.
  3. Сахароза градиент
    1. Регулировка пластиковых пробирок 50 мл, содержащие 8 мл ПНС под углом 45°. Аккуратно добавьте 6 мл раствора 40%-ая сахароза, гарантируя два этапа оставаться отдельной.
    2. Аналогичным образом медленно добавьте 6 мл 25% раствора сахарозы; Затем добавьте 4 мл 10% раствора сахарозы; Наконец добавьте 8 мл буфера оверлея.
    3. Центрифугуйте образцы в высокоскоростной центрифуги на 30000 x g при 4 ° C за 30 мин.
    4. Перенести верхний слой, содержащий LDs до 1,7 мл microcentrifuge.
    5. Для мытья LD, выполните действия, описанные в разделе 1.4.

Результаты

Мы выступали LD изоляции с ER комплект на приблизительно 30 мышей и сравнили результаты с теми, кто после Протокол изоляции сахарозы на приблизительно 40 мышей. Сообщил результаты типичны для обоих протоколов. Мышей были постились ночь со свободным доступом к воде, чтобы у...

Обсуждение

Печеночная LD биологии все чаще признается как критический регулятор гепатоцеллюлярной физиологии в здоровье и болезни. Как bona fide органеллы LDs являются динамическими, взаимодействуют с другими клеточных структур и содержат в них биологически активных компонентов, вовлеченных в гомеос...

Раскрытие информации

Д-р Карр получает поддержку исследований от перехвата Фармацевтика.

Благодарности

Мы благодарим Абрамсон семьи рака научно-исследовательский институт. Эта работа поддерживается следующие гранты: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Роберта Вуда Джонсона Фонда, Гарольд Амос медицинский факультет премии в области развития, 7158, IDOM ДРК пилот премии Р30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Эта работа была поддержана в части NIH P30-DK050306 и его основной зал (молекулярной патологии и изображений ядра, молекулярной биологии/ген выражение ядра и ядро культуры клеток) и его пилот грантовой программы. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BioExpress Vortex MixerGeneMateS-3200-1Vortex Mixer
Centrifuge 54242 REppendorf54242 RRefrigerated Counter Microcentrifuge
Rotor: FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 +Thermo ScientificRC6+Refrigerated High Speed Centrifuge
Rotor: F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+Thermo ScientificLegend RT+Refrigerated High Capacity Centrifuge
Rotor: 75006445 Bucket: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor CocktailSigma Aldrich04 693 116 001Protease Inhibitor Tablets
Diagenode Bioruptur UCD-200DiagenodeUCD-200Sonication System
Dounce Tissue Grinder (45 mL)Wheaton357546Use Loose pestle
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x)Corning21-031-CM
Endoplasmic Reticulum Isolation KitSigma AldrichER0100For ER kit Extraction:
Contains:
Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL
Hypotonic Extraction Buffer 10 mL
Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL
OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL
Blunt Nosed Needle 1 ea.
External light source for flourescent excitationLeicaLeica EL6000
Hydrochloric acidSigma AldrichH1758Hydrochloric Acid
ImageJImage Analysis Software
Inverted Modulating Contrast MicroscopeLeicaLeica DM IRB
Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured CellsThermo Fisher Scientific89839For Lysosome Isolation
Microscope CameraQimagingQICAM fast 1394
Optima XL-100K UltracentrifugeBeckman-CoulterXL-100KUltracentrifuge
Rotor: SW41Ti
Pasteur PipettesFisher Scientific22-042817
Petri Dish 5 cmFisher ScientificFB0875713A
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
PhosSTOPSigma Aldrich04 906 845 001Phosphatase Inhibior Tablets
Sterile Surgical Blade #10PioneerS2646
SucroseFisher ScientificS5-500Crystalline/Certified ACS
Triglyceride Liquicolor KitStanbio 2200-225Colorimetric Triglyceride kit
Tris BaseFisher ScientificBP152-1For TE buffer
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151-1005%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)Thermo Fisher Scientific15575-038For TE buffer

Ссылки

  1. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
  2. Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
  3. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
  4. Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
  5. Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
  6. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  7. Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
  8. Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
  9. Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
  10. Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
  11. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
  12. Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
  13. Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
  14. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
  15. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
  16. Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

146perilipin 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены