Rasche Lipid Droplet Isolation Protokoll verwendet eine gut etablierte Organell-Isolierungskit

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine neuartige Methode der Lipid Droplet Isolation und Reinigung von Maus Lebern, mit einem etablierten endoplasmatische Retikulum Isolierung-Kit.

Zusammenfassung

Lipid-Tröpfchen (LDs) sind bioaktive Organellen innerhalb der Zellflüssigkeit der meisten eukaryotischen und einige prokaryotischen Zellen gefunden. Kirche Jesu Christi bestehen aus neutralen Lipiden, umhüllt von einer Monoschicht von Phospholipiden und Proteinen. Hepatische LD Lipide, wie Ceramide und Proteine sind in mehrere Krankheiten verwickelt, die hepatische Steatose verursachen. Obwohl die bisherige Methoden für LD isoliert aufgestellt wurden, sie erfordern eine aufwändige Vorbereitung der Reagenzien und eignen sich nicht für die Isolierung von mehreren subzelluläre Kompartimente. Wir wollten ein neues Protokoll zu ermöglichen, die Isolation der LDs, endoplasmatische Retikulum (ER) und Lysosomen aus einem einzigen Mausklick Leber zu etablieren.

Weitere, alle Reagenzien im hier vorgestellten Protokoll sind im Handel erhältlich und erfordern minimale Reagenz Vorbereitung ohne Einbußen bei der LD Reinheit. Hier stellen wir Vergleiche dieses neue Protokoll zu einem standard Saccharose-gradient-Protokoll zeigen vergleichbare Reinheit, Morphologie und Ertrag. Darüber hinaus können wir ER Lysosomen mit der gleichen Probe isolieren und detaillierte Einblicke in die Entstehung und intrazellulären Flux von Lipiden und ihre assoziierten Proteinen.

Einleitung

Kirche Jesu Christi sind bioaktive Organellen in der Zellflüssigkeit der meisten eukaryotischen Zellen und einige prokaryotische Zellen^1,2,3gefunden. Der LD-Kern besteht aus neutralen Lipiden wie Triglyceride (TG) und Cholesterin-Ester. Sie enthalten auch Ceramide, bioaktiver Lipide zellulären Signal-Wege^4,5beteiligt. LDs sind umgeben von einem Phospholipid Monolage und beschichtet mit Proteinen, einschließlich der Perilipin Proteine Perilipin 2 (PLIN2) und 3 (PLIN3)^1,5,6. Anwesend sind auch Lipogenic Enzyme Lipasen und Menschenhandel Membranproteine, die mehrere hepatischen steatotic Krankheiten, einschließlich Nichtalkoholische Fettleber, alkoholische Leberkrankheit und Hepatitis C^{3,5 verbunden ,6,7,8,9,10}.

Hlt werden gedacht, um von der äußeren Membran von der Notaufnahme bilden und enthalten neugebildete TG von freien Fettsäuren ER abgeleitet¹¹bezogen. Es bleibt jedoch unbekannt, ob die gepoolten Lipide Knospe, verbunden bleiben, oder werden herausgeschnitten, aus der ER^6,11, so dass die Isolierung des LDs befreit ER technisch anspruchsvoll. Freie Fettsäuren können durch die Wirkung der Oberfläche Lipasen vorzusehen, Energieerzeugung oder Membran-Synthese von LDs befreit werden. Darüber hinaus können LDs über Lipophagy als Regelmechanismus und freie Fettsäuren¹²produzieren abgebaut werden.

Neben der ER und Lysosomen, gibt es andere Organellen – z. B. Endosomen, Mitochondrien, Peroxisomen und die Plasmamembran – in enger Zusammenarbeit von LDs¹¹enthalten sind. Diese engen Polygamie macht es schwierig, eine reine LD-Extraktion durchführen. Jedoch kann neutrale Lipide angeborenen geringer Dichte durch Zentrifugation⁵genutzt werden.

Traditionell wurden LDs isoliert mit einer Saccharose Dichte Gradienten^1,5,13. Jedoch wurden diese Methoden nicht so andere Organellen zu isolieren. Darüber hinaus benötigen sie die zeitraubende Vorbereitung der Reagenzien. Dieses Protokoll passt eine handelsübliche ER Isolation kit (siehe die Tabelle der Materialien), um LD Isolierung zu ermöglichen. Wir verwenden die Extraktionspuffer zur Verfügung gestellt durch das Kit einen LD Isolierung Schritt hinzugefügt. Darüber hinaus kann das Protokoll auch für ER und lysosomale Isolation unter Verwendung der gleichen Proben, damit ein umfassenderes Bild des Lebenszyklus von LDs verwendet werden. Um diese neue Methode zu überprüfen, überprüfen wir LD Ertrag, Morphologie, Größe und Reinheit. Wir vergleichen die Ergebnisse, die hier zu denen, die mit einem weit verbreiteten Protokoll unter Verwendung einer Saccharose Steigung für LD-Isolierung.

Wir verwendeten eine 10 bis 12-Wochen alten, 20 g weiblichen C57BL/6 Maus fastete für 16 h (Essen Entfernung um 17:00 09:00 LD Isolierung Zeit) mit freiem Zugang zu Wasser. Die typische Ausbeute für TG beträgt 0,6 mg/g Leber, und es ist für LD Protein, 0,25 mg/g Leber. Dies bietet genügend Material für ~ 10 Immunoblots von SDS-PAGE. Das Protokoll unten Details der verwendeten Reagenzien und ein Protokoll für eine einzelne 1 g Leber geeignet. Die Saccharose gradient Isolierung Protokoll ist Sato¹⁴ und Wu¹⁵angepasst.

Protokoll

Alle Experimente wurden auf einem Labortisch mit persönlicher Schutzausrüstung geeignet für Biosafety Niveau 1, einschließlich einen Kittel, Handschuhe und Schutzbrille. Versuche wurden nach der Genehmigung durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Pennsylvania Protokollen durchgeführt. Wurden alle Anstrengungen unternommen, um tierische Beschwerden zu minimieren, und die Tiere wurden humane pfleglich behandelt.

(1) LD-Isolierung mit einer ER-Isolierungskit

1. Vorbereitung
   Hinweis: Die aufgeführten Beträge eignen sich für eine einzelne 1 g-Maus-Leber.
   1. Bereiten Sie 10 mL 1 X isotonische Extraktionspuffer (IE Puffer, aus dem ER Isolierungskit vor) durch Verdünnung 2 mL 5 X IE Puffer mit 8 mL Reinstwasser. Kühlen Sie den Puffer ab, indem es auf Eis.
   2. Bereiten Sie 100 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS vor) durch Verdünnung 10 mL 10 X PBS in 90 mL Reinstwasser. Indem es auf Eis abkühlen.
   3. 10 mL 5 %-Polyethylenglykol- p--(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-Phenyl-Äther (PGPE) durch Verdünnung 500 µL PGPE in 9,5 mL Reinstwasser vorbereiten. Verwenden Sie eine 1 mL Spritze, um PGPE zu messen, wie es dickflüssig ist. Indem es auf Eis abkühlen.
   4. Cool alle Röhren auf Eis gelegt: 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen, 15 mL Zentrifuge Rohre, 50 mL High-Speed-Zentrifuge Röhren und 13 mL Ultrazentrifugen Röhren.
   5. Cool alle benötigten Zentrifugen auf 4 ° C: ein Microcentrifuge eine Hochleistungs-Zentrifuge für 15 mL Tuben, eine High-Speed-Zentrifuge für 50 mL Röhrchen und einer Ultrazentrifuge.
   6. Zange und Dissektion Schere durch Autoklavieren zu sterilisieren.
2. Gewebe-Vorbereitung
   1. Einschläfern der Maus, indem man sie in eine Kammer gefüllt mit 100 % CO₂ für 10 min. bestätigen Euthanasie durch zervikale Dislokation durchführen.
   2. Verwendung von sterilen Pinzette und Dissektion Schere, schneiden Sie die Haut und Muskel Schichten des Bauches auf der vorderen/hinteren Achse, die Leber verfügbar zu machen.
   3. Schneiden Sie die Bänder verbinden die Leber mit dem Zwerchfell und Darm. Verwenden Sie Zange um den Darm Weg von der Leber, in Richtung der hinteren Bänder verfügbar machen zu ziehen.
   4. Zwischen der Leber und der dorsalen Rippen geschnitten, ist befreit von anterior Posterior bewegen, bis die Leber.
   5. Übertragen Sie die Leber auf einem kalten 5 cm Petrischale mit 10 mL kalten 1 X PBS.
   6. Waschen Sie die Leber 2 X auf einer rockigen Plattform in 10 mL kalten 1 X PBS für 5 min bei 4 ° C in den 5 cm Petrischale. 1 X PBS nach dem letzten Waschen abgießen.
   7. Eine Größe-10 sterile chirurgische Messer verwenden (siehe Tabelle der Materialien), um die Leber in 3 – 5 mm Stücke in den 5 cm Petrischale (Abbildung 1A) Würfeln.
   8. Waschen Sie die gewürfelte Leber 2 X mit 10 mL kalten 1 X PBS für 5 min bei 4 ° C in den 5 cm Petrischale.
      Hinweis: Für Lysosomen Isolierung, 0,5 g Leber auf eine saubere 45 mL Homogenisator übertragen und folgen Sie den Anweisungen geliefert durch den Lysosomen Extraktion kit (siehe die Tabelle der Materialien).
   9. Dekantieren Sie 1 X PBS und übertragen Sie die gewürfelte Leber Stücke auf der kalten 45 mL Dounce-Homogenisator. Stellen Sie sicher, dass alle Teile am unteren Rand der Homogenisator gehen.
   10. 7 mL kalten 1 X IE Puffer (aus dem ER Isolierungskit) hinzugeben und auf Eis durch Verschieben der Stößel nach oben und unten 20 X homogenisieren. Sicherstellen Sie, dass der Stößel am unteren Rand der Homogenisator bei jedem Schlag geht.
   11. Übertragen Sie das Homogenat (Abbildung 1 b) auf eine kalte 15 mL Zentrifugenröhrchen.
   12. Spülen Sie den Homogenisator mit 1 mL kalten 1 x IE Puffer (aus dem ER Isolierungskit) und fügen Sie diese mit dem Rest der Homogenat.
3. LD-Isolierung
   1. Entfernen Sie Kerne durch Zentrifugieren das Homogenat in einer Hochleistungs-Zentrifuge bei 1.000 X g für 10 min bei 4 ° C (Abbildung 1).
   2. Übertragen Sie die postnukleare überstand (PNS) auf eine neue, kalte 50 mL Zentrifugenröhrchen. Um LD Verlust zu vermeiden, sicherstellen Sie, dass Lipid versammelten sich am oberen Rand der 15 mL Tube Nukleinsäuretablette ist, vor der Übertragung der PNS.
   3. Nehmen Sie 100 µL aliquoten der PNS für Reinheitsanalyse und legen Sie sie in einen kalten 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch. Legen Sie es beiseite auf Eis.
   4. Entfernen Sie Mitochondrien, Zentrifugieren der PNS Probe, nicht den Aliquoten in einer gekühlten High-Speed-Zentrifuge bei 12.000 X g für 15 min bei 4 ° C.
      1. Optional: für Rohöl LD (CLD) Isolate (mit Zellflüssigkeit und Zellmembran Kontamination), die obere Lipidschicht mit einer Glaspipette zu sammeln und zu einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen werden. 1.4 Abschnitt weiter.
   5. Übertragen Sie den postmitochondrial überstand (PMS) auf einer Ultrazentrifuge Rohr. Um LD Verlust zu vermeiden, sicherstellen Sie, dass Lipid versammelten sich am oberen Nukleinsäuretablette ist, vor der Übertragung der PMS.
   6. Nehmen Sie 100 µL aliquoten von PMS für Reinheitsanalyse und legen Sie sie in einen kalten 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch. Legen Sie es beiseite auf Eis.
   7. Kälte 1 x IE Puffer gegen das Rohr zusammenbricht während Ultrazentrifugation füllen Sie einer Ultrazentrifuge Rohr bis zum Rand ein.
   8. Balancieren Sie die Proben zu und Zentrifugieren sie in einer Ultrazentrifuge bei 100.000 X g für 60 min bei 4 ° C (Abbildung 1).
   9. Um die LD-Schicht entfernen, kippen Sie das Rohr in einem Winkel von 45° und mit einer Glaspipette Aspirieren. Übertragen Sie das Pellet auf einen kalten 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch.
      Hinweis: Die Tablette enthält isolierte ER. Verwenden Sie diese Fraktion flussabwärts ER isoliert.
   10. Sammeln Sie 100 µL des Überstands Post-ER (PER) unter die Lipidschicht für Reinheitsanalyse.
4. LD-waschen
   1. Die LD-Fraktion gesammelt in einem 1,7 Microcentrifuge Schlauch auf ein Gesamtvolumen von 1,3 mL fügen Sie 1 X PBS hinzu.
   2. Wirbel der Probe.
   3. Zentrifuge in einem Microcentrifuge Höchstgeschwindigkeit für 5 min bei 4 ° C zu jeder Zellenrückstand Pellets. Erwärmen Sie das Rohr sanft mit den Händen zu helfen, die LD-Schicht aufzuwirbeln. Übertragen Sie den Überstand, einschließlich die Lipidschicht, zu einem neuen 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1–1.4.3 2 X, x-3, bis die Kugel nicht mehr sichtbar ist.
   5. Die Pellet-freie LD überstand zu einem Endvolumen von 1,5 mL 1 X PBS hinzufügen. Waschen Sie die Lipid-Anteil durch Zentrifugieren in einem Microcentrifuge Höchstgeschwindigkeit für 5 min bei 4 ° C.
   6. Entfernen Sie 1 mL 1 X PBS (unterhalb der Lipidschicht) mit einer Glaspipette ohne Störung der Lipidschicht.
   7. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.5 und 1.4.6 x-5 4-Fach, bis 1 X PBS mit keine Trübung visuell transparent ist.
   8. Entfernen Sie alle 1 X PBS unterhalb der Lipidschicht mit einer Glaspipette (Abb. 1E).
   9. Verwenden Sie das Ergebnis, eine reine LD Bruchteil für nachgelagerte Analyse.
5. LD Protein Quantifizierung von Bicinchoninic Acid Test
   Hinweis: Verwenden Sie eine Bicinchoninic Säure-Assay (BCA) nicht, wenn LD Morphologie soll beurteilt werden.
   1. Die LD in 500 μl 5 % PGPE aufzuwirbeln.
   2. Kochen Sie die Proben 5 min bei 95 ° C, Wirbel, und inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 5 min abkühlen lassen.
   3. Wiederholen Sie Schritt 1.5.2 eine zusätzliche 2 X.
   4. Beschallen Sie die Proben 5 min mit einem 30 s ein-/aus-Zyklus, bei mittlerer Intensität.
   5. Normalisieren Sie die Proben durch die Messung der Konzentration des Proteins in aller Reinheit Analyse Proben und in der LD-Fraktion von BCA-Assay.

(2) LD-Isolierung mit Saccharose Dichtegradient

1. Vorbereitung
   1. 200 mL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8.0]) zu machen. Indem es auf Eis abkühlen.
   2. Machen Sie 100 mL 60 % (w/V) Saccharoselösung in TE-Puffer durch Auflösen von 60 g Saccharose in TE-Puffer, bringen das Endvolumen bis 100 mL. Indem es auf Eis abkühlen.
   3. 6 mL Zuckerlösung 40 % (w/V) durch Zugabe von 4 mL 60 % Saccharose, 2 mL TE-Puffer zu machen. Indem es auf Eis abkühlen.
   4. 6 mL Zuckerlösung 25 % (w/V) durch Zugabe von 2,5 mL 60 % Saccharose zu 3,5 mL TE-Puffer zu machen. Indem es auf Eis abkühlen.
   5. 4 mL 10 % (w/V) Saccharose-Lösung durch Zugabe von 60 % Saccharose 0,7 mL bis 3,3 mL von TE-Puffer zu machen. Indem es auf Eis abkühlen.
   6. Machen Sie 10 mL Protease und Phosphatase-Inhibitor-Lösung, indem Sie eine Tablette von Protease und Phosphatase-Inhibitoren, 10 mL von TE-Puffer.
   7. Bereiten Sie Gewebe Homogenat Puffer, indem Sie 50 mL 60 % Saccharose Stammlösung 4 mL Protease und Phosphatase-Inhibitor-Lösung hinzufügen. Indem es auf Eis abkühlen.
   8. Bereiten Sie Overlay Puffer durch Zugabe von 2 mL der Protease und Phosphatase-Inhibitor-Lösung, 50 mL von TE-Puffer. Indem es auf Eis abkühlen.
   9. Bereiten Sie 100 mL 1 X PBS verdünnen 10 mL 10 X PBS in 90 mL Reinstwasser vor. Indem es auf Eis abkühlen.
   10. Vorbereitung 10 mL 5 % PGPE durch Verdünnung 500 µL PGPE in 9,5 mL Reinstwasser. Verwenden Sie eine 1 mL Spritze, um PGPE zu messen, wie es dickflüssig ist. Indem es auf Eis abkühlen.
   11. Die folgenden Zentrifuge Rohre, indem sie auf Eis abkühlen: 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen, 15 mL Zentrifuge Rohre, 50 mL High-Speed-Zentrifuge Röhren und 13 mL Ultrazentrifugen Röhren.
   12. Cool die benötigten Zentrifugen auf 4 ° C: a Microcentrifuge, eine Hochleistungs-Zentrifuge (für 15 mL Röhrchen), eine High-Speed-Zentrifuge (für 50 mL Röhrchen) und einer Ultrazentrifuge.
2. Gewebe-Vorbereitung
   1. Verwenden Sie Schritte 1.2.1–1.2.9 zur Homogenisierung des Gewebes Vorbereitung.
   2. 7 mL kalte Gewebe Homogenat Puffer hinzugeben und durch Verschieben der Stößel nach oben und unten 20 X auf dem Eis zu homogenisieren. Während die ersten fünf Striche sicherzustellen Sie, dass die Stößel am unteren Rand der Homogenisator geht.
   3. Übertragen Sie das Homogenat auf eine kalte 15 mL Zentrifugenröhrchen.
   4. Spülen Sie den Homogenisator mit 1 mL kalte Gewebe Homogenat Puffer und überträgt es auf die bisher verwendeten 15 mL Zentrifugenröhrchen.
   5. Bringen Sie das Volumen der Homogenat bis zu 10 mL mit Gewebe Homogenat Puffer.
   6. Zentrifugieren Sie die Probe in einer Hochleistungs-Zentrifuge bei 1.000 X g für 10 min bei 4 ° C.
   7. Übertragen Sie 8 mL Überstand auf eine 50 mL Zentrifugenröhrchen.
   8. Übertragen Sie 100 µL der restlichen Überstand als PNS Probe zur Reinheitsanalyse.
3. Saccharose Farbverlauf
   1. Kippen Sie die 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 8 mL PNS in einem Winkel von 45°. Hinzugeben Sie 6 mL 40 % Saccharoselösung, sicherzustellen, dass die beiden Phasen getrennt bleiben vorsichtig.
   2. Fügen Sie in ähnlicher Weise langsam 6 mL 25 % Saccharose-Lösung hinzu; Fügen Sie 4 mL 10 % Saccharose-Lösung; Schließlich fügen Sie 8 mL Overlay-Puffer.
   3. Zentrifugieren Sie die Probe in einer High-Speed-Zentrifuge bei 30.000 X g bei 4 ° C für 30 min.
   4. Übertragen Sie die oberste Schicht mit der Kirche Jesu Christi zu einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch.
   5. Führen Sie für LD waschen die Schritte in Abschnitt 1.4.

Ergebnisse

Wir haben die LD-Isolierung mit dem ER Kit auf ca. 30 Mäusen durchgeführt und verglichen die Ergebnisse mit denen nach der Saccharose-Isolierung-Protokolls auf ca. 40 Mäuse. Die berichteten Ergebnisse sind typisch für beide Protokolle. Mäusen wurden über Nacht mit freiem Zugang zu Wasser, zu den LD-Ertrag steigern gefastet. LD-Isolierung mit einem Farbverlauf von Saccharose lief parallel mit dem ER Kit LD Isolierung Protokoll. Proben von PNS, PMS, v., Markierungen und LDs während E...

Diskussion

Hepatische LD Biologie werden zunehmend als kritische Regulator des hepatozellulären Physiologie in Gesundheit und Krankheit erkannt. Als bona fide Organellen LDs sind dynamisch, interagieren mit anderen Zellstrukturen und enthalten innerhalb Sie bioaktive Komponenten Lipid- und Glukose Homöostase beteiligt. Die Saccharose Steigung wird routinemäßig für LD Isolierung eingesetzt und ermöglicht Ermittler LD Struktur untersuchen, aber es zwingt sie zu zahlreichen Puffer zu machen. Wir haben gezeigt, dass die Verwendun...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioExpress Vortex Mixer	GeneMate	S-3200-1	Vortex Mixer
Centrifuge 54242 R	Eppendorf	54242 R	Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 +	Thermo Scientific	RC6+	Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+	Thermo Scientific	Legend RT+	Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	04 693 116 001	Protease Inhibitor Tablets
Diagenode Bioruptur UCD-200	Diagenode	UCD-200	Sonication System
Dounce Tissue Grinder (45 mL)	Wheaton	357546	Use Loose pestle
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x)	Corning	21-031-CM
Endoplasmic Reticulum Isolation Kit	Sigma Aldrich	ER0100	For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea.
External light source for flourescent excitation	Leica	Leica EL6000
Hydrochloric acid	Sigma Aldrich	H1758	Hydrochloric Acid
ImageJ			Image Analysis Software
Inverted Modulating Contrast Microscope	Leica	Leica DM IRB
Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells	Thermo Fisher Scientific	89839	For Lysosome Isolation
Microscope Camera	Qimaging	QICAM fast 1394
Optima XL-100K Ultracentrifuge	Beckman-Coulter	XL-100K	Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	22-042817
Petri Dish 5 cm	Fisher Scientific	FB0875713A
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
PhosSTOP	Sigma Aldrich	04 906 845 001	Phosphatase Inhibior Tablets
Sterile Surgical Blade #10	Pioneer	S2646
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500	Crystalline/Certified ACS
Triglyceride Liquicolor Kit	Stanbio	2200-225	Colorimetric Triglyceride kit
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	For TE buffer
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151-100	5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)	Thermo Fisher Scientific	15575-038	For TE buffer