从脐带血源性多能干细胞中提取三维皮肤有机细胞

摘要

我们提出了一个协议, 说明如何区分诱导多能干细胞衍生角质形成细胞和成纤维细胞, 并产生三维皮肤有机体, 使用这些角质形成细胞和成纤维细胞。该协议包含生成人性化小鼠模型的附加步骤。这里介绍的技术将改进皮肤科的研究。

摘要

皮肤是人体最大的器官, 有许多功能。皮肤作为身体的屏障和保护者, 调节身体功能。仿性主义是模仿自然的模型、系统和元素, 目的是解决复杂的人类问题¹。皮肤仿生学是体外疾病研究和体内再生医学的有用工具。人体诱导多能干细胞具有无限增殖和分化为三种生殖层的能力。人类 Ipsc 是由各种原代细胞产生的, 如血细胞、角质形成细胞、成纤维细胞等。其中, 脐带血单个核细胞 (Cbmc) 已从同种异体再生医学的角度成为替代细胞来源。Cbmc 在再生医学中很有用, 因为人类白细胞抗原 (HLA) 分型对细胞银行系统至关重要。我们提供了一种方法, 分化为角质形成细胞和成纤维细胞, 并产生三维皮肤有机体。Cbmc-ipscc 衍生角质形成细胞和成纤维细胞具有类似于原代细胞系的特征。3D 皮肤有机体是通过将表皮层覆盖在真皮层而产生的。通过移植这种3D 皮肤有机体, 生成了一个人性化的小鼠模型。本研究表明, 三维人体 ipsc 衍生皮肤有机体可能是一种新的, 替代工具的皮肤科研究在体外和体内。

引言

皮肤覆盖身体最外层, 保护内脏。皮肤具有多种功能, 包括预防病原体、吸收和储存水、调节体温和排泄^{身体废物 2}。皮肤移植可以根据皮肤来源进行分类;使用另一个捐献者皮肤的移植被称为同种异体移植, 使用患者自己的皮肤的移植是自体移植。虽然自体移植是首选的治疗方法, 因为它的低排斥风险, 皮肤活检是很难执行严重病变或皮肤细胞数量不足的患者。在严重烧伤的患者中, 覆盖大面积所需的皮肤细胞数量是其三倍。患者体内皮肤细胞的有限可用性导致需要同种异体移植的情况。同种异体移植被暂时使用, 直到可以进行自体移植, 因为它通常在大约 1周3后被宿主的免疫系统拒绝.为了克服患者免疫系统的排斥, 移植必须来自与患者⁴具有相同免疫身份的来源。

人的 Ipsc 是干细胞治疗的新兴细胞来源⁵。人类的 Ipsc 是由体细胞产生的, 使用的是 OCT4、SOX2、Klf4 和 c-Myc^{6 等}重新编程因子。使用人的 ipsc 克服了胚胎干细胞 (esc) 的伦理和免疫学问题 7,^8.人的 Ipsc 具有多能性, 可分为三个细菌层⁹。HLA 是再生医学中的一个关键因素, hla 的存在决定了免疫反应和排斥的可能性¹⁰。使用患者衍生的 Ipsc 解决了细胞源限制和免疫系统排斥的问题。Cbmc 也已成为再生医学^的替代细胞来源11。强制 HLA 分型, 发生在 CBMC 银行业务, 可以很容易地用于研究和移植。此外, 纯合 hla 型 Ipsc 可广泛应用于各种患者¹²。Cbmc-ipsc 库是一种新的、有效的细胞治疗和同种异体再生医学^12、13、14的策略。在这项研究中, 我们使用 Cbmc-ipsc, 分化为角质形成细胞和成纤维细胞, 并产生分层的三维皮肤层。这项研究的结果表明, Cbmcc-ipscc 衍生的3D 皮肤有机体是一种新的工具, 用于体外和体内皮肤科的研究。

研究方案

所有涉及动物的程序都是根据《实验动物福利法》、《实验动物护理和使用指南》以及机构动物护理机构提供的啮7号动物实验指南和政策进行的。韩国天主教大学医学院使用委员会 (IACUC)。研究议定书得到韩国天主教大学机构审查委员会的批准 (CUMC-2018-0191-01)。IACUC 和韩国天主教大学实验动物系 (DOLA) 松井校区于2017年认可了韩国食品药品监督管理局的韩国卓越动物实验室设施, 并获得了评估和动物研究协会。2018年获得国际实验动物护理 (AAALAC) 国际认证。

1. 皮肤细胞分化与诱导多能干细胞的分化

1. 中等制备
   注: 将所有介质在4°C 的黑暗环境中存放长达3个月。在使用灭菌前, 使用0.22μm 聚醚磺酸过滤系统对所有介质进行过滤。所有介质的总体积均为500毫升。
   1. 制备 KDM1 (角质形成细胞分化培养基 1)。将 Dulbecco 的改性鹰培养基 (DMEM)/F12 培养基 (3:1) 与2% 的胎牛血清 (FBS)、0.3 Mmol/L l l-抗坏血酸、5μgml 胰岛素和24μgml 腺嘌呤混合。
   2. 准备 KDM2 (角质形成细胞分化培养基 2)。将定义的角质形成细胞无血清培养基 (见材料表) 与 0.3 mmol l-抗坏血酸、5μgml 胰岛素和10μgl 腺嘌呤混合。
      注: 定义的角质形成细胞无血清学培养基得到优化, 以支持角质形成细胞的生长和扩张。
   3. 准备 KDM3 (角质形成细胞分化培养基 3)。混合定义的角质形成细胞无血清培养基和角质形成细胞无血清培养基 (1:1), 详见材料表。
      注: 角质形成细胞无血清培养物的培养基优化了角质形成细胞的生长和维持。
   4. 制备 FDM1 (成纤维细胞分化培养基 1)。将 DMEM/f12 培养基 (3: 1) 与 5% FBS、5μgml 胰岛素、0.18 mm 腺嘌呤和 10 ngml 表皮生长因子 (EGF) 混合。
   5. 制备 FDM2 (成纤维细胞分化培养基 2)。将 DMEMM\ f12 培养基 (1:1) 与5% 的 FBS 和1% 的非必需氨基酸混合。
   6. 准备 EP1 (上皮介质 1)。将 DMEM/f12 (3:1) 与 4 mM l-谷氨酰胺、40μm 腺嘌呤、10μg/ml 转铁蛋白、10μgml 胰岛素和 0.1% FBS 混合。
   7. 准备 EP2 (上皮介质 2)。混合 EP1 和 1.8 mM 氯化钙。
   8. 准备 EP3 (上皮介质 3, 角化介质)。将 F12 培养基与 4 mM l-谷氨酰胺、40μm 腺嘌呤、10μgml 转铁蛋白、10μgml 胰岛素、2% FBS 和 1.8 mM 氯化钙混合。
2. 胚胎体的生成
   1. 使用以前的研究12中显示的协议^生成cbmcc-ipsc。
   2. 外套培养菜肴, 使用黄酮素。准备5毫升, 以覆盖100毫米的菜。
      1. 解冻和再悬浮 50μl 0.5 mgml vitronectin (最终浓度: 5μg/ml), 不育磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 为5ml。将溶液加入到盘子中, 在室温 (RT) 下孵育 1小时. 使用前将涂层材料吸干 (不要干燥)。
   3. 将 cbmc 衍生的 Ipsc 保持在100毫米的玻璃体检测板上, 并在37°c 下每天更换 iPSC 介质 (E8), 使用10% 的co2。
   4. 使用先前研究15中显示的协议^生成胚胎体 (eb) (简要描述如下)。通过改变培养基来扩展 Ipsc, 直到细胞达到80% 的融合。在80% 的汇合点处, 取出培养基, 用 PBS 清洗。
   5. 用 1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) 治疗细胞。在37°c 与 5% co2 中培养 2分钟,并使用 E8 培养基3毫升的 ml 收获细胞。以 250 x g离心细胞2分钟。
   6. 吸入上清液, 并将 E8 培养基5毫升应用于细胞。使用血细胞仪计数细胞, 并将 1 x 10⁶细胞转移到一个新的15毫升锥形管。以 250 x g离心细胞2分钟。
   7. 用 5μm RO 相关激酶 (ROCK) 抑制剂, 用 2.5 Ml 的 eb 形成培养基对转移细胞进行再利用。使用10–100μl 多^通道移液器将 1 x 10 4 细胞 (25μl/滴) 滴在非涂层培养板盖上。从 1 x 10^6个细胞形成 100 eb (1 x^{10 4} cells"eb)。把盘子翻过来, 挂在水滴上的盖子上。
      注: 在维护和分化过程中的连接步骤中, 需要使用岩石抑制剂。仅在 EB 聚集阶段添加 ROCK 抑制剂。
   8. 用 5% CO2 在37°c 下将液滴产下 1天 。
   9. 第二天, 收获 100个 Eb, 并使用它们进行分化。用 iPSC 介质 (E8 介质) 或 PBS 清洗板盖, 将其内容物收集到50毫升锥形管中。将在 RT 的 Eb 保持 1分钟, 以解决它们。吸起上清液, 用 E8 培养基重新悬浮 Eb, 并将其保持在90毫米培养皿中, 直到分化。
3. Cbmcc-ipsc 分化为角质形成细胞
   注: 关于从 Cbmcc-ipsc 分化角质形成细胞的方案, 见图 1a。
   1. 用 iPSC 介质或 PBS 将 100 eb 收获到50毫升的锥形管中。在 RT 保持 1分钟, 以解决 Eb。确保它们在锥形管的底部沉淀。用 E8 培养基用 1 ngml 骨形态发生蛋白 4 (BMP4) 吸吸上清液并重新悬浮 Eb。将 Eb 转移到90毫米培养皿中, 并将其保持在 37°c, 并将其保持在 5% co2 1天。
   2. 涂衣菜肴, 使用 IV 型胶原蛋白。准备5毫升的 IV 型胶原蛋白, 以覆盖100毫米的盘子。
      1. 用 0.05 n HCl 解冻并重新悬浮类型的 IV 型胶原蛋白溶液 (最终浓度: 50μg ml). 将溶液加入盘中, 在 RT 孵育 1小时. 在使用前对涂层材料进行吸气 (不要干燥)。
         注: 在使用盘子之前, 用 PBS 清洗盘子 3倍, 以去除任何酸。
   3. 将 Eb (步骤 1.3.1) 收集到50毫升的锥形管, 并将其保持在 RT 1分钟, 以使其安顿下来。确保它们沉淀在锥形管的底部, 吸气上清液, 并用 10μm rock 抑制剂在 KDM1 的6毫升中重新悬浮 Eb。将 Eb 转移到 IV 型胶原蛋白涂层100毫米盘。
      注: 仅在 EB 连接阶段添加岩石抑制剂。
   4. 在第0-8天之间, 每隔一天将培养基改为 KDM1, 每天使用3μm 维甲酸 (RA) 和 25 ngml 分别使用 BMP4 和 EGF。使用5% 的 CO2 将 eb 保持在 37°c.
   5. 在第9-12 天之间, 每隔一天将介质改为 KDM2, 使用 3μm ra、25 ngml BMP4 和 20 ngml EGF。
   6. 在13–30天之间, 每隔一天将介质更换到 KDM3, 使用 10 ngml BMP4 和 20 ngml EGF。
4. CBMC-iPSC 分化为成纤维细胞
   注: 关于与 Cbmcc-ipscs 分化成纤维细胞的方案, 见图 2a。
   1. 涂布培养菜肴, 采用基底膜基质。准备5毫升, 以覆盖100毫米的菜。
      1. 解冻基底膜基质 (最终浓度: 600 ngml), 并用 dmm任何 f12 介质稀释。将溶液加入到盘子中, 在37°c 孵育 30分钟, 在使用前对涂层材料进行吸气 (不要干燥)。
   2. 使用带有 iPSC 介质或 PBS 的移液器将 100 Eb 收获到50毫升的锥形管中。在 RT 保持 1分钟, 以解决 Eb。确保它们在锥形管的底部沉淀。取出上清液。
   3. 使用 1, 000Μl 移液器在 FDM1 的6毫升中使用 10μm rock 抑制剂重新使用 eb。将 Eb (含介质) 转移到基底膜基质包覆100毫米盘, 并在37°c 孵育, 采用 5% co 2.每隔3天刷新 FDM1 3天。
      注: 仅在 EB 连接阶段添加岩石抑制剂。
   4. 在第4天至第6天内, 在 FDM1 中加入 0.5 nM 骨形态发生蛋白 4 (BMP 4)。
   5. 第7天, 在一周内, 每隔一天将介质更改为 FDM2 2。
   6. 第14天, 加入1毫升 EDTA 1 毫升, 在37°c 孵育, 5% CO2 孵育 2分钟, 以 FDM2 的3毫升和 250 x g 的离心机孵育细胞 2分钟, 取出上清液, 重新悬浮 Fdm1 5 毫升的细胞。
   7. 使用血细胞计计数细胞, 用 FDM1 培养基重新悬浮 2 x^{10 6 细胞}, 并将细胞转移到非涂层盘。使用5% 的 CO2 将电池保持在 37°c , 并每隔一天更换一次介质。
   8. 涂衣菜肴, 使用 I 型胶原蛋白。准备5毫升, 以覆盖100毫米的菜。稀释 i 型胶原蛋白溶液 (最终浓度: 50Μg/ml) 在 0.02 N 醋酸中。将溶液加入到盘子中, 在 RT 孵育 1小时. 使用前对涂层材料进行吸气 (不要干燥)。
      注: 在使用盘子之前, 用 PBS 清洗盘子 3倍, 以去除酸。
   9. 第21天, 加入1毫升 EDTA 1 毫升, 在37°c 孵育, 5% CO2 孵育 2分钟, 以 FDM1 3 毫升的速度采集细胞, 在 250 x g 处收集细胞 2分钟, 取出上清液, 重新悬浮 Fdm1 5 毫升中的细胞。使用血细胞计计数细胞, 并将 2 x 10⁶细胞转移到 i 型胶原蛋白涂层100毫米盘与 FDM1 介质。使用5% 的 CO2 将电池保持在 37°c , 并每隔一天更换一次介质。
   10. 第28天, 加入1毫升 EDTA 1 毫升, 在37°c 孵育, 5% CO2 孵育 2分钟, 以 FDM1 3 毫升的速度采集细胞, 在 250 x g 处收集细胞 2分钟, 取出上清液, 重新悬浮 Fdm1 5 毫升中的细胞。使用血细胞计计数细胞, 并将 2 x 10^{6 细胞}转移到非涂层盘中, 并使用 FDM1 培养基。使用5% 的 CO2 将电池保持在 37°c , 并每隔一天更换一次介质。
       注: ipscc 衍生的成纤维细胞像原生成纤维细胞系一样增殖, 通道长达10个通道。在这项研究中, 我们使用 ipscc 衍生的2至5个通道的成纤维细胞进行进一步分析。

2. hipscs 衍生分化细胞的应用

1. 3D 皮肤有机体的生成
   1. 按照制造商的建议, 在冰上准备中和 I 型胶原蛋白。作为最终浓度, 使用 3 mgml 为 I 型胶原蛋白 (I 型胶原蛋白的库存浓度为 3.47 Mg/ml), 并确保混合物的最终体积为5毫升。计算 10倍 PBS 的体积 (最终体积 = 0.5 mL)。计算要使用的 I 型胶原蛋白的体积 (最终体积 x 最终胶原蛋白浓度/库存胶原蛋白浓度 = 5 毫升 x 3 Mgml/3.47 Mg/ml = 4.32 mL)。计算 1 N NaOH 的体积 (使用的胶原蛋白体积 x 0.023 ml = 0.1 mL)。计算 dH_{2o 的}体积 (最终体积-胶原蛋白体积-10倍 pbs-体积为 1 n naoh = 5 ml-4.32 ml-0.5 ml-0.1 ml = 0.08 ml)。混合管的内容物, 并保持在冰上, 直到准备使用。
   2. 在 ipsc 衍生成纤维细胞1.4.10 中加入1毫升 edta, 在37°c 孵育, 用 5% co2 孵育 2分钟, 收获分离细胞, 使用血细胞计计数细胞, 并将 2 x 5 细胞转移到新的 15 ml 锥形管中。以 250 x g 离心 2分钟 , 并去除上清液。在 FDM1 1.5 mL 中重新移植 ipscc 衍生成纤维细胞的细胞, 并中和 i 型胶原蛋白溶液 (1:1)。
      注: 轻轻混合溶液, 以避免气泡。
   3. 将膜插入物放在6孔微板上, 将混合物转移到插入物上, 并在 RT 孵育30分钟。
      注: 不要移动板。
   4. 确认凝胶后, 在刀片顶部加入2毫升的介质, 在井底添加3毫升。用 5% CO2 在37°c 下将成纤维细胞和胶原蛋白基质生也就是 5-7, 直到凝胶状化完成, 不再收缩。
   5. 完全凝胶化后, 使用 EDTA 分离 ipsc 衍生的角质形成细胞 (从步骤 1.3.6)。加入1毫升的 EDTA, 在37°c 孵育 5% co2, 以 5分钟的时间, 收集分离细胞, 用血细胞计对其进行计数, 并将 1 x 10^{6 细胞}转移到新的 15 ml 锥形管中。以 250 x g 离心 2分钟 。
   6. 去除上清液, 在低钙上皮培养基 1 (ep1) 的50-100Μl 中重新悬浮 1 x 10 6 细胞。
   7. 将基质中的所有培养基 (参见步骤 2.1.5) 和 ipsc 衍生角质形成细胞的 1 x 10 6 细胞种子到每个成纤维细胞层。用 5% CO2 在37°c 下将板材加氢 30分钟 。
      注: 不要移动板, 也不要添加任何介质来连接角质形成细胞。
   8. 在插入物顶部添加2毫升 EP1, 在井底添加3毫升 EP1。
   9. 2天后, 在膜插入板中吸气所有培养基, 并将培养基改为正常钙 EP2 2天。
   10. 2天后, 吸气所有培养基, 只在底部加入3毫升的玉米化介质, 以产生空气-液体界面。
   11. 在37°c 下使用5% 的 CO2 保持3D 皮肤有机体长达 14天, 并每隔一天更换一次介质。通过切割刀片边缘收获3D 皮肤有机体, 并将其用于染色和植皮的进一步研究。
2. 皮肤移植
   1. 使用标准的、经制度认可的方法, 对 Nod/scid 小鼠 (男性, 6周大) 进行吸入麻醉。对于植皮, 剃光每个老鼠的背部皮肤的皮毛。
   2. 使用带有钳子的弯曲剪刀, 取出老鼠皮肤的1厘米 x 2 厘米部分。
   3. 将 Cbmc-ipscc 衍生的3D 皮肤有机体放置在缺陷部位, 并使用带丝缝线的扎针敷料方法进行缝合。
   4. 观察小鼠 2周, 并牺牲它们进行组织学分析。染色协议在以前的研究¹⁶中得到了验证。

结果

皮肤在很大程度上是由表皮和真皮组成的。角质形成细胞是表皮的主要细胞类型, 成纤维细胞是真皮的主要细胞类型。角质形成细胞分化的方案如图 1a 所示。Cbmcc-ipcsc 保存在一个玻璃体涂膜盘中 (图 1b)。在这项研究中, 我们区分 Cbmc-ipsc 到角质形成细胞和成纤维细胞使用 EB 形成。我们使用悬挂下降法生成了 Eb, 以确保角质形成?...

讨论

人类 Ipsc 被认为是个性化再生医学的新选择.患者派生的个性化 ipsc 反映了可用于疾病建模、药物筛选和自体移植^18、19的患者特征。使用患者衍生的 ipsc 还可以克服原代细胞、缺乏足够的细胞数量和免疫反应^{5、17、19 的}问题。然而, 由于时间、成本和劳动力限制, 生?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sigma	A2786	Component of differentiation medium for fibroblast
AggreWell Medium (EB formation medium)	STEMCELL	05893	EB formation
Anti-Fibronectin antibody	abcam	ab23750	Fibroblast marker
Anti-KRT14 antibody	abcam	ab7800	Keratinocyte marker
Anti-Loricrin antibody	abcam	ab85679	Stratum corneum marker
Anti-p63 antibody	abcam	ab124762	Keratinocyte marker
Anti-Vimentin antibody	Santa cruz	sc-7558	Fibroblast marker
BAND AID FLEXIBLE FABRIC	Johnson & Johnson	-	Bandage
Basement membrane matrix (Matrigel)	BD	354277	Component of differentiation medium for fibroblast
BLACK SILK suture	AILEEE	SK617	Skin graft
CaCl2	Sigma	C5670	Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Collagen type I	BD	354236	3D skin organoid
Collagen type IV	Santa-cruz	sc-29010	Component of differentiation medium for keratinocyte
Defined keratinocyte-Serum Free Medium	Gibco	10744-019	Component of differentiation medium for keratinocyte
DMEM, high glucose	Gibco	11995065	Component of differentiation medium
DMEM/F12 Medium	Gibco	11330-032	Component of differentiation medium
Essential 8 medium	Gibco	A1517001	iPSC medium
FBS, Qualified	Corning	35-015-CV	Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Glutamax Supplement	Gibco	35050061	Component of differentiation medium for fibroblast
Insulin	Invtrogen	12585-014	Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Iris standard curved scissor	Professional	PC-02.10	Surgical instrument
Keratinocyte Serum Free Medium	Gibco	17005-042	Component of differentiation medium for keratinocyte
L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate	Sigma	A8960	Component of differentiation medium for keratinocyte
MEM Non-Essential Amino Acid	Gibco	1140050	Component of differentiation medium for fibroblast
Meriam Forceps Thumb 16 cm	HIROSE	HC 2265-1	Surgical instrument
NOD.CB17-Prkdc SCID/J	The Jackson Laboratory	001303	Mice strain for skin graft
Petri dish 90 mm	Hyundai Micro	H10090	Plastic ware
Recombinant Human BMP-4	R&D	314-BP	Component of differentiation medium for keratinocyte
Recombinant human EGF protein	R&D	236-EG	Component of differentiation medium for keratinocyte
Retinoic acid	Sigma	R2625	Component of differentiation medium for keratinocyte
T/C Petridish 100 mm, 240/bx	TPP	93100	Plastic ware
Transferrin	Sigma	T3705	Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Transwell-COL collagen-coated membrane inserts	Corning	CLS3492	Plastic ware for 3D skin organoid
Vitronectin	Life technologies	A14700	iPSC culture
Y-27632 Dihydrochloride	peprotech	1293823	iPSC culture