코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

요약

우리는 이러한 keratinocytes 및 섬유 아 세포를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 keratinocytes 및 섬유 아 세포 분화 및 3D 피부 organoid, 생성 하는 방법을 보여 주는 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜 humanized 마우스 모델을 생성 하는 추가 단계를 포함 합니다. 여기에 제시 된 기술 피부과 연구를 향상 됩니다.

초록

피부는 신체의 가장 큰 기관 이다 하 고 많은 기능을가지고 있다. 피부 물리적 장벽 및 시체의 수호자로 서 역할을 하며 신체 기능을 조절. Biomimetics 모델, 시스템 및 복잡 한 인간의 문제¹을 해결 하기 위해 자연의 모방 이다. 피부 biomimetics 생체 외에서 질병 연구 그리고 vivo에서 재생 의학에 대 한 유용한 도구입니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 무제한 확산의 특성 있고 3 개의 세균 층을 차별화의 능력. 인간의 Ipsc는 다양 한 기본 세포, 혈액 세포, keratinocytes, 섬유 아 세포 등에서 생성 됩니다. 그 중, 탯 줄 혈액 단 세포 (CBMCs) 수용자 재생 의학의 관점에서 다른 셀 원으로 떠오르고 있다. 셀 뱅킹 시스템에 필수적 이다 인간 백혈구 항 원 (HLA) 입력 하기 때문에 CBMCs는 재생 의학에 유용 합니다. 우리 섬유 아 세포와 keratinocytes CBMC Ipsc의 차별화 및 3D 피부 organoid의 생성을 위한 메서드를 제공합니다. CBMC iPSC 파생 keratinocytes 및 섬유 아 세포 1 차 셀 라인에 유사한 특성이 있다. 3D 피부 organoids는 피부 층에 표 피 레이어 overlaying에 의해 생성 됩니다. 이 3D 피부 organoid, 이식으로 인간 답게 마우스 모델 생성 됩니다. 이 연구는 3 차원 인간의 iPSC 파생 피부 organoid 피부과 연구 생체 외에서 그리고 vivo에서 소설, 대체 도구가 될 수 있습니다 보여줍니다.

서문

피부는 신체의 가장 바깥쪽 표면 커버 하 고 내부 장기를 보호 한다. 피부는 병원 체에 대 한 보호, 흡수, 저장 물 등 다양 한 기능, 체온을 조절 하 고 신체를 검출 낭비². 피부 이식 피부 소스;에 따라 분류 될 수 있다 다른 기증자 로부터 피부를 사용 하 여 이식 이식, 불린다 고 이식 환자 자신의 피부를 사용 하 여 autografts. autograft는 그것의 낮은 거부 위험으로 인해 선호 하는 치료, 피부 생 검은 심한 병 변 가진 환자 또는 피부 세포의 수가 부족에 수행 하기 어렵다. 환자에서 심한 화상, 피부 세포의 수 3 배 큰 부위를 커버 하는 데 필요한 있습니다. 환자의 몸에서 피부 세포의 제한 된 가용성 allogenous 식은 필요한 경우에 발생 합니다. 그것은 일반적으로 약 1 주³후 숙주의 면역 체계에 의해 거부 이후 자가 이식을 수행할 수 있습니다 때까지 일시적으로 이식 사용 됩니다. 환자의 면역 시스템에 의해 거부를 극복 하기 위해 이식 환자⁴같은 면역 정체성과 소스에서와 야 한다.

인간의 Ipsc는 줄기 세포 치료⁵셀의 신흥 소스입니다. 인간의 Ipsc OCT4, SOX2, Klf4, 및 c-Myc⁶등 재활 요소를 사용 하 여 신체 세포에서 생성 됩니다. 인간의 Ipsc를 사용 하 여 배아 줄기 세포 (ESCs)^7,8의 윤리 문제와 면역 극복. 인간의 Ipsc pluripotency 있고 3 개의 세균 층⁹으로 분화 할 수 있다. HLA, 재생 의학에 중요 한 요인의 존재는 면역 반응과 거부¹⁰의 가능성을 결정합니다. 환자 파생 Ipsc 사용 하 여 셀 소스 제한 및 면역 시스템의 문제를 해결합니다. CBMCs는 또한 재생 의학¹¹에 대 한 대체 셀 원본으로 나왔다. 필수 HLA 타이핑, CBMC 은행 중 발생 하는 연구와 이식에 대 한 쉽게 사용할 수 있습니다. 더, homozygous HLA 형 Ipsc 널리 다양 한 환자¹²에 적용할 수 있습니다. CBMC iPSC 은행 소설 및 세포 치료 및 재생 의학 allogenic^12,,1314에 대 한 효율적인 전략 이다. 이 연구에서 우리는 CBMC-Ipsc, keratinocytes 및 섬유 아 세포로 분화를 사용 하 고 층 화 3D 피부 레이어를 생성. 이 연구에서 결과 3D 피부 CBMC iPSC 파생 organoid 생체 외에서 그리고 vivo에서 피부과 연구를 위한 새로운 도구는 것이 좋습니다.

프로토콜

동물 관련 된 모든 절차는 실험실 동물 복지 행위, 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 수행 했다 그리고 기관 동물 관리에서 지침 및 설치류 실험에 대 한 정책을 제공 하 고 한국 가톨릭 대학의 학부의 위원회 (IACUC)를 사용 합니다. 연구 프로토콜은 가톨릭 대학교의 한국 (CUMC-2018-0191-01)의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. Songeui 캠퍼스 2017 및 취득 협회 평가 대 한 식품 및 의약품 안전 청의 한국 우수 동물 실험실 시설 인가 IACUC, 가톨릭 대학교의 실험실 동물 (DOLA)의 부 고 2018 년에서 실험실 동물 케어 인터내셔널 (AAALAC) 국제 전체 인증 인가

1. 피부 세포 분화 유도 만능 줄기 세포에서

1. 중간 준비
   참고: 어두운 환경에서 최대 3 개월까지 4 ° C에서 모든 매체를 저장 합니다. 살 균을 위해 사용 하기 전에 0.22 μ m polyethersulfone 필터 시스템을 사용 하 여 모든 매체를 필터링 합니다. 모든 매체의 500 mL 전체 볼륨에서 사용할 수 있었습니다.
   1. KDM1 준비 (keratinocyte 차별화 매체 1). 혼합 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) / 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 0.3 m m o l/L L-아 스 코르 빈 산, 5 μ g/mL 인슐린, 그리고 24 µ g/mL 아데닌과 F12 매체 (3:1).
   2. KDM2 준비 (keratinocyte 차별화 중간 2). 혼합 정의 keratinocyte 중간 혈 청 무료 ( 재료의 표참조)와 0.3 m m o l/l L-아 스 코르 빈 산, 5 μ g/mL 인슐린, 10 μ g/mL 아데닌.
      참고: 정의 된 keratinocyte 혈 청 자유로운 매체 성장과 keratinocytes의 확장을 지원 하기 위해 최적화 되어 있습니다.
   3. KDM3 준비 (keratinocyte 차별화 매체 3). 혼합 정의 keratinocyte 혈 청 무료 매체 그리고 keratinocyte 혈 청 무료 매체 (1:1) 대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
      참고: Keratinocyte 혈 청 자유로운 매체의 성장 및 keratinocytes의 유지 보수에 대 한 최적화 됩니다.
   4. FDM1 준비 (구와 차별화 매체 1). 5 %FBS, 5 μ g/mL 인슐린, 0.18 m m 아데닌 그리고 10 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF)와 함께 믹스 DMEM/F12 매체 (3:1).
   5. FDM2 준비 (구와 차별화 중간 2). 5%와 1 %FBS 불필요 한 아미노산 믹스 DMEM/F12 매체 (1:1).
   6. EP1 준비 (상피 매체 1). 믹스 DMEM/F12 (3:1)와 4 mM L-글루타민, 40 μ M 아데닌, 10 μ g/mL 올려진다, 10 μ g/mL 인슐린, 0.1 %FBS.
   7. EP2 준비 (상피 중간 2). EP1 1.8 m m 염화 칼슘을 믹스.
   8. E p 3를 준비 (상피 매체 3, cornification 매체). 믹스 F12 매체와 4 mM L-글루타민, 40 μ M 아데닌, 10 μ g/mL 올려진다, 10 μ g/mL 인슐린, 2 %FBS, 1.8 m m 칼슘 염화 물.
2. 배아 바디 생성
   1. CBMC-Ipsc 이전 연구¹²에 표시 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 합니다.
   2. 문화 요리, vitronectin를 사용 하 여 코트. 100 mm 접시 코트 5 mL를 준비 합니다.
      1. 해 동 및 50 μ 0.5 mg/mL vitronectin의 resuspend (최종 농도: 5 µ g/mL) 5 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 함께. 요리에 솔루션을 추가 하 고 1 h. Aspirate 사용 (건조 안) 하기 전에 코팅 소재에 대 한 실 온 (RT)에서 품 어.
   3. CBMC 파생 Ipsc vitronectin 코팅 100 mm 접시 10% CO₂와 37 ° C에서 매일 iPSC 매체 (E8)를 변경 유지.
   4. 미 발달 기관 (EBs) (설명 간단히 다음과 같이) 이전 연구¹⁵ 에 표시 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 합니다. Ipsc 셀 80% 합류에 도달 될 때까지 매체를 변경 하 여 확장 합니다. 80% 합류에 매체를 제거 하 고 PBS로 세척 합니다.
   5. 셀 1 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 1 mL을 처리 합니다. 5% CO₂ 2 분 동안 37 ° C에서 품 어 그리고 E8 매체의 3 mL를 사용 하 여 셀을 수확. 250 x g 2 분 동안에 세포 원심
   6. 상쾌한 발음을 E8 매체의 5 mL는 셀에 적용 됩니다. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 1 x 10⁶ 셀을 전송. 250 x g 2 분 동안에 세포 원심
   7. 10 μ M로 관련 된 키 (바위) 억제제와 EB 대형 매체의 2.5 mL로 전송 된 셀 resuspend 1 x 10⁴ 의 세포 (25 µ L/드롭) 10-100 μ 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 noncoated 문화 접시 뚜껑에 드롭. 1 x 10⁶ 셀 (1 x 10⁴ 셀/1 EB)에서 양식 100 EBs. 접시를 뒤집어 놓고 뚜껑은 방울에 걸어.
      참고: 락 억제제 단계에서 첨부 파일의 유지와 분화 과정에서 필요 합니다. EB 집계 단계에만 록 억제제를 추가 합니다.
   8. 1 일 5% CO₂ 와 37 ° C에서 물방울을 품 어.
   9. 다음 날, 수확 100 EBs 차별화에 대 한 그들을 사용 하 여. IPSC 매체 (E8 매체) 또는 PBS를 가진 접시의 뚜껑을 세척 하 고 그 내용을 50 mL 원뿔 튜브에 수확. 그들을 정착 1 분 RT에 EBs를 유지 합니다. 발음은 상쾌한, E8 매체와 EBs resuspend 고 분화까지 90 mm 페 트리 접시에에서 그들을 유지 합니다.
3. Keratinocytes로 CBMC Ipsc의 차별화
   참고: CBMC Ipsc에서 keratinocyte 차별화의 체계, 그림 1A를 참조 하십시오.
   1. 베스트 100 EBs iPSC 매체 또는 PBS 50 mL 원뿔 튜브를. RT EBs 정착 1 분 동안에 유지 합니다. 그들은 정착 원뿔 튜브의 하단에 다는 것을 확인 하십시오. 발음은 상쾌한 고 E8 매체 1 ng/mL 뼈 morphogenetic 단백질 4 (BMP4)와 EBs를 resuspend. EBs 90 mm 페 트리 접시에 전송 하 고 1 일 5% CO₂ 와 37 ° C에서 그들을 유지 합니다.
   2. 문화 요리, 유형 IV 교원 질을 사용 하 여 코트. 유형 IV 콜라겐 100 mm 접시를 코트의 5 mL을 준비 합니다.
      1. 해 동 및 유형 IV 콜라겐 솔루션 resuspend (최종 농도: 50 µ g/mL) 0.05 N HCl. 요리에 솔루션을 추가 그리고 1 헤에 대 한 RT에서 품 어와 발음 사용 (건조 안) 하기 전에 코팅 소재.
         참고: 격판덮개를 사용 하기 전에 설거지 3 x 어떤 산을 제거 하는 PBS.
   3. EBs (단계 1.3.1) 50 mL 원뿔 튜브를 수확 하 고 그들을 정착 1 분 RT에서 그들을 유지 하는 것. 그들은 원뿔 튜브의 하단에 정착, 상쾌한, 발음 및 10 µ M 바위 억제제와 KDM1의 6 ml에서 EBs resuspend 다는 것을 확인 하십시오. 유형 IV 콜라겐 코팅 100 mm 접시에는 EBs를 전송 합니다.
      참고: EB 첨부 파일 단계에서만 록 억제제를 추가 합니다.
   4. 0-8 일 사이 매체 매일 KDM1 3 µ M retinoic 산 (RA)와 25 ng/mL 각 BMP4와 EGF의 변경. EBs 5% CO₂와 37 ° C에서 유지 합니다.
   5. 9-12 일 사이 변경 매체 매일 20 ng/mL EGF와 3 µ M RA, 25 ng/mL BMP4, KDM2.
   6. 13-30 일 사이 변경 매체 매일 KDM3 10 ng/mL BMP4와 20 ng/mL EGF.
4. 섬유 아 세포에 CBMC iPSC의 차별화
   참고: CBMC Ipsc에서 구와 차별화의 체계에 대 한 그림 2A를 참조 하십시오.
   1. 문화 요리, 지하실 멤브레인 매트릭스를 사용 하 여 코트. 100 mm 접시 코트 5 mL를 준비 합니다.
      1. 지하실 막 매트릭스를 녹여 (최종 농도: 600 ng/mL) DMEM/F12 매체와 그것을 희석. 요리에 솔루션을 추가 하 고 30 분 Aspirate 사용 (건조 안) 하기 전에 코팅 소재에 대 한 37 ° C에서 품 어.
   2. 베스트 100 EBs iPSC 매체 또는 PBS를 피 펫을 사용 하 여 50 mL 원뿔 튜브를. RT EBs 정착 1 분 동안에 유지 합니다. 그들은 정착 원뿔 튜브의 하단에 확인 하십시오. 제거는 상쾌한.
   3. 10 µ M 바위 억제제와 FDM1의 6 mL에 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 EBs resuspend (매체)와 EBs 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 100 mm 접시에 전송 하 고 5% CO₂와 37 ° C에서 품 어. 3 일 동안 매일은 FDM1를 새로 고칩니다.
      참고: EB 첨부 파일 단계에서만 록 억제제를 추가 합니다.
   4. 일 4와 6 사이 FDM1를 0.5 nM 뼈 morphogenetic 단백질 4 (BMP 4)을 추가 합니다.
   5. 7 일에 매체를 변경 FDM2 1 주 동안 매일.
   6. 14 일에 1 mM EDTA의 1 mL을 추가 하 고 2 분 2 분은 상쾌한 제거 하 고 resuspend FDM1의 5 mL에 셀 셀 FDM2 및 250 x g 에서 원심 분리기의 3 mL을 수확을 위해 5% CO₂ 와 37 ° C에서 품 어.
   7. hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수, 2 x 10⁶ 셀 FDM1 매체, resuspend 그리고 noncoated 접시를 셀을 전송. 5% CO₂ 와 37 ° C에서 세포를 유지 하 고 매일 매체를 변경.
   8. 코트 문화 요리를 사용 하 여 나에 게 콜라겐을 입력 합니다. 100 mm 접시 코트 5 mL를 준비 합니다. 희석 유형 I 교원 질 솔루션 (최종 농도: 50 µ g/mL) 0.02 N 초 산에. 요리에 솔루션을 추가 하 고 1 h. Aspirate 사용 (건조 안) 하기 전에 코팅 소재에 대 한 RT에서 품 어.
      참고: 격판덮개를 사용 하기 전에 설거지 3 산 제거에 PBS 가진 x.
   9. 21 일에 1 mM EDTA의 1 mL을 추가 하 고 2 분 2 분은 상쾌한 제거 하 고 resuspend FDM1의 5 mL에 셀 셀 FDM1 및 250 x g 에서 원심 분리기의 3 mL을 수확을 위해 5% CO₂ 와 37 ° C에서 품 어. 수 hemocytometer 및 전송 사용 하 여 셀 2 x 10⁶ 세포 종류에 내가 FDM1 매체와 콜라겐 코팅 100 mm 접시입니다. 5% CO₂ 와 37 ° C에서 세포를 유지 하 고 매일 매체를 변경.
   10. 28 일에 1 mM EDTA의 1 mL을 추가 하 고 2 분 2 분은 상쾌한 제거 하 고 resuspend FDM1의 5 mL에 셀 셀 FDM1 및 250 x g 에서 원심 분리기의 3 mL을 수확을 위해 5% CO₂ 와 37 ° C에서 품 어. hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수와 FDM1 매체와 noncoated 접시 2 x 10⁶ 셀을 전송. 셀 5% CO₂ 와 37 ° C에서 유지 하 고 매일 매체를 변경.
       참고: iPSC 파생 된 섬유 아 세포 증식 주된 fibroblast 세포 선 및 10 구절까지 통로 처럼. 이 연구에서 우리는 추가 분석을 위해 iPSC 파생 2 ~ 5 구절의 섬유 아 세포를 사용.

2. 차별화 된 셀 hiPSC 파생 응용

1. 3D 피부 organoid의 세대
   1. 중화 유형 준비 나 얼음, 콜라겐 제조 업체의 권장 사항에 따라. 최종 농도 3 mg/mL 사용 하 여 유형 I 교원 질에 대 한 (재고 농도의 유형 I 교원 질은 3.47 mg/mL), 혼합물의 최종 볼륨 5 mL 확인. 10 x PBS의 볼륨 계산 (최종 볼륨/10 = 0.5 mL). 계산 볼륨의 유형 I 사용 될 콜라겐 (최종 콜라겐 농도 x 최종 볼륨 / 콜라겐 농도 주가 5 mL x 3 mg/mL = / 3.47 mg/mL = 4.32 mL). 계산 1 N NaOH의 볼륨 (사용 되는 콜라겐의 볼륨 0.023 mL = 0.1 mL x). DH₂O의 볼륨 계산 (10 x PBS-1 N NaOH의 볼륨의 최종 볼륨-콜라겐의 볼륨-볼륨 5-4.32 mL-0.5 mL 0.1 mL = 0.08 mL =). 튜브의 내용을 혼합 하 고 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 그것을 유지.
   2. 단계의 1.4.10 iPSC 파생 fibroblasts에 EDTA의 1 mL을 추가 하 고 2 분 분리 된 세포를 수확, hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 2 x 10⁵ 셀을 전송 5% CO₂ 와 37 ° C에서 품 어. 250 x g 2 분에 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다. Resuspend FDM1의 1.5 ml에서 iPSC 파생 된 섬유 아 세포의 세포와 무력화는 유형 나 콜라겐 솔루션 (1:1).
      참고: 부드럽게 거품을 피하기 위해 해결책 혼합.
   3. 막 삽입 6 잘 microplate에, 삽입, 혼합물을 전송 놓고 30 분 동안 RT에서 품 어.
      참고: 격판덮개를 이동 하지 마십시오.
   4. 겔 화를 확인 한 후 삽입 및 우물의 바닥에 3 mL의 상단 중간의 2 개 mL를 추가 합니다. 5-7 일는 겔 화 완료 될 때까지, 더 이상 계약에 대 한 섬유 아 세포와 콜라겐 5% CO₂ 와 37 ° C에서의 매트릭스를 품 어.
   5. 완전 한 겔 화 후 분리 (단계 1.3.6)에서 iPSC 파생 keratinocytes EDTA를 사용 하 여. EDTA의 1 mL을 추가 하 고 2 분 분리 된 세포를 수확, hemocytometer를 사용 하 여 계산 하 고 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 1 x 10⁶ 셀을 전송 5% CO₂ 와 37 ° C에서 품 어. 2 분 동안 250 x g 에서 원심 분리기.
   6. 상쾌한을 제거 하 고 낮은 칼슘 상피 매체 1 (EP1)의 50-100 µ L에 1 x 10⁶ 셀 resuspend.
   7. 행렬에서 모든 매체를 발음 (단계 2.1.5 참조) 및 1 x 10⁶ 세포 각 구와 레이어에 iPSC 파생 keratinocytes의 씨앗. 5% CO₂ 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.
      참고: 접시를 이동 하지 마십시오 그리고 keratinocyte의 첨부 파일에 대 한 모든 매체를 추가 하지 마십시오.
   8. 삽입의 상단을 우물의 바닥에 EP1의 3 mL EP1의 2 개 mL를 추가 합니다.
   9. 2 일 후 막 삽입 격판덮개에서 모든 매체를 발음 하 고 2 일 동안 정상적인 칼슘 EP2 매체를 변경 합니다.
   10. 2 일 후, 모든 매체를 발음 하 고는 공기 액체 인터페이스 생성 하 하단에만 cornification 매체의 3 mL를 추가 합니다.
   11. 3D 피부 organoid 5% CO₂ 와 37 ° C에서 최대 14 일 동안 유지 하 고 매일 매체를 변경. 3D 피부 organoid 삽입, 가장자리를 절단 하 여 수확 하 고 그것을 사용 하 여 얼룩 및 피부 이식의 추가 연구에 대 한.
2. 피부 이식
   1. 끄 덕/scid 쥐 (남성, 6 주 이전)에 흡입 마 취를 수행, 표준, 제도 승인 된 방법을 사용 하 여. 피부 이식, 각 마우스의 등 쪽 피부 모피를 면도.
   2. 마우스의 피부, 곡선된가 위를 사용 하 여 집게와 1 cm x 2 cm 섹션을 제거 합니다.
   3. CBMC iPSC 파생 3D 피부 organoid를 결함 사이트와 실크 봉합 넥타이 위에 드레싱 메서드를 사용 하 여 봉합에 놓습니다.
   4. 2 주 동안 생쥐를 관찰 하 고 조직학 분석을 위해 그들을 희생. 얼룩 프로토콜은 이전 연구¹⁶에 확인 했다.

결과

피부는 표 피와 진 피, 대부분의 경우, 구성 됩니다. Keratinocytes는 주요 세포 유형의 표 피, 고 섬유 아 세포는 진 피의 주요 셀 형식. Keratinocyte 차별화의 체계는 그림 1에 표시 됩니다. CBMC iPCSc vitronectin 코팅 접시 (그림 1B)에 유지 되었다. 이 연구에서 우리가 EB 형성을 사용 하 여 섬유 아 세포와 keratinocytes CBMC Ipsc 분화. EBs는 교수?...

토론

인간의 Ipsc 맞춤된 재생 의료¹⁷에 대 한 새로운 대안 제안 되어 있다. 맞춤된 Ipsc 환자 파생 질병 모델링, 약물 검사, 및 자가 이식^18,19사용할 수 있는 환자 특성을 반영 합니다. 환자 파생 Ipsc의 사용 또한 1 차 셀, 적절 한 셀 숫자 및 면역 반응^5,,1719의 부족에 관한 문?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sigma	A2786	Component of differentiation medium for fibroblast
AggreWell Medium (EB formation medium)	STEMCELL	05893	EB formation
Anti-Fibronectin antibody	abcam	ab23750	Fibroblast marker
Anti-KRT14 antibody	abcam	ab7800	Keratinocyte marker
Anti-Loricrin antibody	abcam	ab85679	Stratum corneum marker
Anti-p63 antibody	abcam	ab124762	Keratinocyte marker
Anti-Vimentin antibody	Santa cruz	sc-7558	Fibroblast marker
BAND AID FLEXIBLE FABRIC	Johnson & Johnson	-	Bandage
Basement membrane matrix (Matrigel)	BD	354277	Component of differentiation medium for fibroblast
BLACK SILK suture	AILEEE	SK617	Skin graft
CaCl2	Sigma	C5670	Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Collagen type I	BD	354236	3D skin organoid
Collagen type IV	Santa-cruz	sc-29010	Component of differentiation medium for keratinocyte
Defined keratinocyte-Serum Free Medium	Gibco	10744-019	Component of differentiation medium for keratinocyte
DMEM, high glucose	Gibco	11995065	Component of differentiation medium
DMEM/F12 Medium	Gibco	11330-032	Component of differentiation medium
Essential 8 medium	Gibco	A1517001	iPSC medium
FBS, Qualified	Corning	35-015-CV	Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Glutamax Supplement	Gibco	35050061	Component of differentiation medium for fibroblast
Insulin	Invtrogen	12585-014	Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Iris standard curved scissor	Professional	PC-02.10	Surgical instrument
Keratinocyte Serum Free Medium	Gibco	17005-042	Component of differentiation medium for keratinocyte
L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate	Sigma	A8960	Component of differentiation medium for keratinocyte
MEM Non-Essential Amino Acid	Gibco	1140050	Component of differentiation medium for fibroblast
Meriam Forceps Thumb 16 cm	HIROSE	HC 2265-1	Surgical instrument
NOD.CB17-Prkdc SCID/J	The Jackson Laboratory	001303	Mice strain for skin graft
Petri dish 90 mm	Hyundai Micro	H10090	Plastic ware
Recombinant Human BMP-4	R&D	314-BP	Component of differentiation medium for keratinocyte
Recombinant human EGF protein	R&D	236-EG	Component of differentiation medium for keratinocyte
Retinoic acid	Sigma	R2625	Component of differentiation medium for keratinocyte
T/C Petridish 100 mm, 240/bx	TPP	93100	Plastic ware
Transferrin	Sigma	T3705	Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Transwell-COL collagen-coated membrane inserts	Corning	CLS3492	Plastic ware for 3D skin organoid
Vitronectin	Life technologies	A14700	iPSC culture
Y-27632 Dihydrochloride	peprotech	1293823	iPSC culture