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Resumen

Proponemos un protocolo que muestra cómo distinguir keratinocytes derivados de células madre pluripotentes inducidas y fibroblastos y generar un organoide de piel 3D, usando estos queratinocitos y fibroblastos. Este protocolo contiene un paso adicional de generar un modelo de ratones humanizados. La técnica presentada aquí mejorará la investigación dermatológica.

Resumen

La piel es el órgano más grande del cuerpo y tiene muchas funciones. La piel actúa como barrera física y protector del cuerpo y regula las funciones corporales. Biomimética es la imitación de los modelos, sistemas y elementos de la naturaleza con el fin de resolver problemas humanos complejos1. Biomimética de la piel es una herramienta útil para la medicina regenerativa in vivo y in vitro investigación. Las células madre humanas pluripotentes inducidas (iPSCs) tienen la característica de la proliferación ilimitada y la capacidad de diferenciación de tres capas germinales. IPSCs humanos se generan de varias células primarias, como las células sanguíneas, queratinocitos, fibroblastos y más. Entre ellos, células mononucleares de sangre de cordón (CBMCs) han emergido como una fuente alternativa de la célula desde la perspectiva de la medicina regenerativa allogeneic. CBMCs son útiles en medicina regenerativa porque leucocito humano antígeno (HLA) escribir es esencial para la célula del sistema bancario. Nos proporcionan un método para la diferenciación de CBMC-iPSCs en queratinocitos y los fibroblastos y para la generación de un organoide de piel 3D. Fibroblastos y queratinocitos derivados de iPSC CBMC tienen características similares a una línea celular primaria. Los organoides de la piel 3D se generan superponiendo una capa epidérmica en una capa dérmica. Mediante el trasplante de este organoide 3D de la piel, se genera un modelo de ratones humanizados. Este estudio demuestra que un organoide de piel derivado de iPSC humana 3D puede ser una herramienta novedosa, la alternativa para la investigación dermatológica in vitro e in vivo.

Introducción

La piel cubre la superficie exterior del cuerpo y protege órganos internos. La piel tiene varias funciones, incluyendo la protección contra patógenos, absorber y almacenar agua, regular la temperatura del cuerpo y excretar el cuerpo de residuos2. Injertos de piel se pueden clasificar dependiendo de la fuente de la piel; injertos con piel de otro donante se denominan aloinjertos e injertos utilizando la piel del propio paciente son autoinjertos. Aunque un autoinjerto es el tratamiento preferido debido a su riesgo de rechazo baja, biopsias de la piel son difíciles de realizar en pacientes con lesiones severas o un número insuficiente de células de la piel. En pacientes con quemaduras graves, tres veces el número de células de la piel es necesario para cubrir áreas grandes. La disponibilidad limitada de las células de la piel del cuerpo del paciente los resultados en situaciones donde es necesario allogenous trasplante. Un aloinjerto se utiliza temporalmente hasta que el trasplante autólogo puede realizarse ya que generalmente es rechazado por el sistema de inmune después de aproximadamente 1 semana3. Para superar el rechazo por el sistema inmune del paciente, injertos deben venir de una fuente con la misma identidad inmunológica del paciente4.

IPSCs humanas son una fuente emergente de células para la terapia de la célula de vástago5. IPSCs humanas se generan en las células somáticas, utilizando factores de reprogramación como OCT4, SOX2, Klf4 y c-Myc6. Utilizando iPSCs humana supera los problemas éticos e inmunológicos de las células madre embrionarias (ESCs)7,8. Humanos iPSCs con pluripotencia y puede diferenciarse en tres capas germinales9. La presencia de HLA, un factor crítico en medicina regenerativa, determina la respuesta inmune y la posibilidad de rechazo10. El uso de derivados del paciente iPSCs resuelve los problemas de rechazo de la limitación y el sistema inmune celular-fuente. CBMCs también han surgido como una fuente alternativa de la célula para medicina regenerativa11. Obligatorio HLA mecanografía, que ocurre durante la banca CBMC, se puede utilizar fácilmente para la investigación y trasplante. Además, homocigótica tipo HLA iPSCs puede aplicar ampliamente a varios pacientes12. Un banco de CBMC-iPSC es un novedoso y eficaz estrategia para terapia celular y medicina regenerativa alógeno12,13,14. En este estudio, utilizamos CBMC-iPSCs, diferenciado en queratinocitos y fibroblastos y generar capas 3D estratificado de la piel. Los resultados de este estudio sugieren que un organoide 3D CBMC-iPSC-derivados de la piel es una novedosa herramienta para la investigación dermatológica in vitro e in vivo.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales fueron realizados conforme a la ley de bienestar de animales de laboratorio, la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y las directrices y políticas para la experimentación de roedor proporcionan por el cuidado institucional de Animal y Uso (IACUC) Comité de la escuela de medicina de la Universidad Católica de Corea. El protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Universidad Católica de Corea (CUMC-2018-0191-01). La IACUC y el Departamento de animales laboratorio (DOLA) de la Universidad Católica de Corea, Songeui Campus acreditado la instalación de laboratorio de Corea excelencia Animal de la Korea Food and Drug Administration en 2017 y adquirida la Asociación para la evaluación y Acreditación de la acreditación internacional de completo internacional de cuidado de animales de laboratorio (AAALAC), en el 2018.

1. diferenciación celular de células madre pluripotentes inducidas de la piel

  1. Preparación de medio
    Nota: Guarde todo medio a 4 ° C en un ambiente oscuro durante 3 meses. Todos medio utilizando un sistema de filtro de 0.22 μm polyethersulfone antes de su uso para la esterilización del filtro. Medio de todos estaba disponible en un volumen total de 500 mL.
    1. Preparar KDM1 (medio de la diferenciación del keratinocyte 1). Medium (DMEM modificado Eagle de mezcla Dulbecco) / medio de F12 (3:1) con 2% de suero bovino fetal (FBS), 0,3 mmol/L de ácido L-ascórbico, 5 μg/mL insulina y 24 adenina μg/mL.
    2. Preparar KDM2 (medio de la diferenciación del keratinocyte 2). Mezcla define keratinocyte medio libre de suero (véase la Tabla de materiales) con 0,3 mmol/l de ácido L-ascórbico, 5 de μg/mL insulina y adenina 10 μg/mL.
      Nota: Medio de keratinocyte definido libre de suero está optimizado para apoyar el crecimiento y la expansión de queratinocitos.
    3. Preparar KDM3 (medio de la diferenciación del keratinocyte 3). Mezcla define keratinocyte medio sin suero y queratinocitos medio sin suero (1:1) vea la Tabla de materiales para más detalles.
      Nota: Medio libre de suero de queratinocitos está optimizado para el crecimiento y mantenimiento de los queratinocitos.
    4. Preparar FDM1 (medio de diferenciación de fibroblastos 1). Medio DMEM/F12 Mix (3:1) con 5% FBS, 5 μg/mL insulina, adenina de 0.18 m m y 10 ng/mL factor de crecimiento epidérmico (EGF).
    5. Preparar FDM2 (medio de diferenciación de fibroblastos 2). Medio DMEM/F12 de mezcla (1:1) con 5% FBS y 1% aminoácidos no esenciales.
    6. Preparar EP1 (epitelial medio 1). Mezcla de DMEM/F12 (3:1) con 4 mM L-glutamina, adenina μM 40, transferrina μg/mL, insulina de 10 μg/mL y 10 0,1% FBS.
    7. Preparar EP2 (epitelial medio 2). Mezclar el EP1 y 1,8 mM cloruro de calcio.
    8. Preparar EP3 (medio epitelial 3, medio cornification). Medio de F12 de mezcla con 4 mM L-glutamina, adenina μM 40 10 transferrina μg/mL, insulina de 10 μg/mL, 2% FBS y 1,8 mM cloruro de calcio.
  2. Generación del cuerpo embrionario
    1. Generar CBMC-iPSCs usando el protocolo mostrado en un anterior estudio12.
    2. Platos de cultura de la capa, usando vitronectina. Prepare 5 mL a un plato de 100 mm de la capa.
      1. Descongelar y resuspender en 50 μL de vitronectina de 0.5 mg/mL (concentración final: 5 μg/mL) con 5 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Añadir la solución a los platos e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 1 h. aspirar el material de recubrimiento antes de su uso (no seca).
    3. Mantener las iPSCs CBMC-deriva a la vitronectina cubrió 100 mm plato y cambiar el medio de iPSC (E8) todos los días a 37 ° C con 10% CO2.
    4. Generar cuerpos embrionarios (EBs) utilizando el protocolo mostrado en un anterior estudio15 (descritas brevemente a continuación). Ampliar iPSCs cambiando el medio hasta que las células hayan alcanzado el 80% de confluencia. En el 80% de confluencia, quitarlo del medio y lavar con PBS.
    5. Tratar las células con 1 mL de ácido de 1 mM etilendiaminotetracético (EDTA). Incubar a 37 ° C con 5% CO2 durante 2 min y cosechar las células usando 3 mL de medio de E8. Centrifugar las células a 250 x g durante 2 minutos.
    6. Aspirar el sobrenadante y aplicar 5 mL de medio de E8 a las células. Contar las células usando un hemocitómetro y 1 x 106 células de transferencia a un nuevo tubo cónico de 15 mL. Centrifugar las células a 250 x g durante 2 minutos.
    7. Resuspender las células transferidas con 2,5 mL de medio de formación de EB con inhibidor de la Rho-associated kinase (roca) de 10 μM. 1 x 104 células (25 μl/gota) en la tapa de la placa de cultura noncoated usando una pipeta multicanal de 10 – 100 μL de la gota. Formulario 100 EBs de las células 1 x 106 (1 x 104 células/1 EB). Voltee el plato y colgar en la gota a la tapa.
      Nota: Inhibidor de la roca es necesaria durante la etapa de fijación en el proceso de mantenimiento y diferenciación. Añadir el inhibidor de la roca en la fase de agregación de EB.
    8. Incubar las gotitas a 37 ° C con 5% CO2 para 1 día.
    9. Al día siguiente, la cosecha del 100 EBs y utilizarlos para la diferenciación. Lave la tapa de la placa con medio de iPSC (mediana de E8) o PBS y cosecha su contenido a un tubo cónico de 50 mL. Mantener el EBs en RT para 1 minuto para colocar abajo. Aspirar el sobrenadante, Resuspender el EBs con medio E8 y mantenerlas en una caja de Petri de 90 mm hasta la diferenciación.
  3. Diferenciación de CBMC-iPSCs en queratinocitos
    Nota: Para un esquema de la diferenciación del keratinocyte de CBMC-iPSCs, ver figura 1A.
    1. EBs de cosecha el 100 a un tubo cónico de 50 mL con medio de iPSC o PBS. Mantener a temperatura ambiente durante 1 minuto a la EBs. Asegúrese de que se instalan en la parte inferior del tubo cónico. Aspirar el sobrenadante y resuspender el EBs con medio E8 con 1 ng/mL la proteína morfógena ósea 4 (BMP4). Transferencia de la EBs a un plato de Petri de 90 mm y mantener a 37 ° C con 5% CO2 para 1 día.
    2. Capa de platos de la cultura, con colágeno tipo IV. Preparar 5 mL de tipo colágeno de IV a un plato de 100 mm de la capa.
      1. Descongelar y volver a suspender el tipo solución de colágeno IV (concentración final: 50 μg/mL) con 0,05 N HCl. Añadir la solución a los platos e incube a temperatura ambiente durante 1 h. aspirar el material de recubrimiento antes de su uso (no seca).
        Nota: Antes de usar las planchas, lavar los platos de 3 x con PBS para eliminar cualquier ácido.
    3. El EBs (paso 1.3.1) a un tubo cónico de 50 mL de la cosecha y mantener a temperatura ambiente durante 1 minuto para colocar abajo. Asegúrese de colocar en la parte inferior del tubo cónico, aspirar el sobrenadante y resuspender el EBs en 6 mL de KDM1 con inhibidor de roca de 10 μm. Transferencia de la EBs al plato tipo IV colágeno cubierto de 100 mm.
      Nota: Añadir el inhibidor de la roca sólo en la etapa de fijación de EB.
    4. Entre los días 0 y 8, cambiar el medio día a KDM1 con retinoico de 3 μm (RA) y 25 ng/mL de cada una de BMP4 y EGF. Mantener el EBs a 37 ° C con 5% CO2.
    5. Entre los días 9 – 12, cambiar el medio día a KDM2 con 3 μm RA, 25 ng/mL BMP4 y EGF de 20 ng/mL.
    6. Entre los días 13 y 30, cambiar el medio día a KDM3 con 10 ng/mL BMP4 y EGF de 20 ng/mL.
  4. Diferenciación de CBMC-iPSC en fibroblastos
    Nota: Para un esquema de la diferenciación de fibroblastos de CBMC-iPSCs, ver figura 2A.
    1. Platos de la cultura, utilizando la matriz de la membrana basal de la capa. Prepare 5 mL a un plato de 100 mm de la capa.
      1. Descongele la matriz de la membrana del sótano (concentración final: 600 ng/mL) y diluir con medio DMEM/F12. Añadir la solución a los platos e incubar a 37 ° C por 30 min aspirar el material de recubrimiento antes de su uso (no seca).
    2. EBs de cosecha el 100 a un tubo cónico de 50 mL con una pipeta con medio de iPSC o PBS. Mantener a temperatura ambiente durante 1 minuto a la EBs. Asegúrese de que se instalan en la parte inferior del tubo cónico. Eliminar el sobrenadante.
    3. Resuspender el EBs utilizando una pipeta μL 1.000 en 6 mL de FDM1 con el inhibidor de roca de 10 μm. Transferir el EBs (con medio) a un plato de matriz recubierta 100 mm membrana del sótano e incubar a 37 ° C con 5% CO2. Actualizar el FDM1 diariamente por 3 días.
      Nota: Sólo añadir el inhibidor de la roca en la etapa de fijación de EB.
    4. Añadir 0,5 nM la proteína morfógena ósea 4 (BMP 4) a la FDM1 entre los días 4 y 6.
    5. En el día 7, cambiar el medio para FDM2 cada tercer día durante 1 semana.
    6. En el día 14, añadir 1 mL de 1 mM EDTA e incubar a 37 ° C con 5% CO2 para 2 minutos cosechar las células con 3 mL de FDM2 y centrifugue a 250 x g por 2 minutos quite el sobrenadante y resuspender las células en 5 mL de FDM1.
    7. Contar las células usando un hemocitómetro, suspender 2 x 106 células con medio de FDM1 y transferir las células al noncoated plato. Mantener las células a 37 ° C con 5% CO2 y cambiar el medio cada día.
    8. Platos de cultura de capa, con colágeno tipo I. Prepare 5 mL a un plato de 100 mm de la capa. Diluir la solución de colágeno de tipo I (concentración final: 50 μg/mL) en 0.02 N de ácido acético. Añadir la solución a los platos e incube a temperatura ambiente durante 1 h. aspirar el material de recubrimiento antes de su uso (no seca).
      Nota: Antes de usar las planchas, lavar los platos de 3 x con PBS para eliminar el ácido.
    9. El día 21, añadir 1 mL de 1 mM EDTA e incubar a 37 ° C con 5% CO2 para 2 minutos cosechar las células con 3 mL de FDM1 y centrifugue a 250 x g por 2 minutos quite el sobrenadante y resuspender las células en 5 mL de FDM1. Recuento de las células usando un hemocitómetro y transferencia 2 x 106 células al tipo plato cubierto de colágeno 100 mm con medio FDM1. Mantener las células a 37 ° C con 5% CO2 y cambiar el medio cada día.
    10. En el día 28, añadir 1 mL de 1 mM EDTA e incubar a 37 ° C con 5% CO2 para 2 minutos cosechar las células con 3 mL de FDM1 y centrifugue a 250 x g por 2 minutos quite el sobrenadante y resuspender las células en 5 mL de FDM1. Contar las células usando un hemocitómetro y 2 x 106 células de transferencia a un plato de noncoated con FDM1 medio. Mantener las células a 37 ° C con 5% CO2 y cambiar el medio día.
      Nota: proliferan los fibroblastos derivados de iPSC como una línea de células de fibroblastos primarios y paso hasta 10 pasajes. En este estudio, utilizamos fibroblastos derivados de iPSC de dos a cinco pasos para su posterior análisis.

2. uso de células diferenciadas derivadas de hiPSC

  1. Generación de 3D piel organoide
    1. Preparar neutralizado tipo I colágeno en el hielo, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Como concentración final, uso de 3 mg/mL de colágeno de tipo I (concentración stock de tipo I colágeno es 3,47 mg/mL) y asegúrese de que el volumen final de la mezcla es de 5 mL. Calcular el volumen de PBS x 10 (volumen final/10 = 0.5 mL). Calcular el volumen de colágeno para ser utilizado tipo I (volumen final x concentración final colágeno / concentración de colágeno madre = 5 mL x 3 mg / mL / 3,47 mg / mL = 4,32 mL). Calcular el volumen de 1 N NaOH (volumen de colágeno para utilizar x 0,023 mL = 0,1 mL). Calcular el volumen de dH2O (volumen final - volumen de colágeno - volumen de PBS 10 x - volumen de 1 N NaOH = 5 mL - 4,32 mL-0.5 mL 0.1 mL = 0,08 mL). Mezclar el contenido del tubo y mantenerlo en hielo hasta que esté listo para usar.
    2. Añadir 1 mL de EDTA a los fibroblastos derivados de iPSC de paso 1.4.10 e incubar a 37 ° C con 5% CO2 para 2 minutos las células separadas de la cosecha, contar las células usando un hemocitómetro y 2 x 105 células de transferencia a un nuevo tubo cónico de 15 mL. Centrifugue a 250 x g durante 2 minutos y eliminar el sobrenadante. Resuspender las células de los fibroblastos derivados de iPSC en 1,5 mL de FDM1 y neutralizado el tipo solución de colágeno (1:1).
      Nota: Mezcle la solución suavemente para evitar burbujas.
    3. Coloque la membrana sobre un pozo de 6 microplacas, transferir la mezcla a la inserción e incube a TA por 30 min.
      Nota: No mueva las placas.
    4. Después de confirmar la gelificación, agregar 2 mL del medio a la parte superior de la inserción y 3 mL en el fondo del pozo. Incubar la matriz de fibroblastos y colágeno a 37 ° C con 5% CO2 para 5-7 días, hasta que la gelificación se complete y no contratos.
    5. Después de la gelificación completa, separar los queratinocitos derivados de iPSC (del paso 1.3.6) utilizando EDTA. Añadir 1 mL de EDTA e incubar a 37 ° C con 5% CO2 para 2 minutos las células separadas, contarlos usando un hemocitómetro y cosecha 1 x 106 células de transferencia a un nuevo tubo cónico de 15 mL. Centrifugar a 250 x g durante 2 minutos.
    6. Quite el sobrenadante y resuspender 1 x 106 células en 50-100 μl de medio epitelial de bajo calcio 1 (EP1).
    7. Aspirar todo medio en la matriz (ver paso 2.1.5) y 1 x 106 células de los queratinocitos derivados de iPSC en cada capa de fibroblastos de la semilla. Incubar la placa a 37 ° C con 5% CO2 durante 30 minutos.
      Nota: No mueva la placa y no agregue ningún medio para la fijación del keratinocyte.
    8. Añadir 2 mL de EP1 a la parte superior de la pieza de inserción y 3 mL de EP1 hasta el fondo del pozo.
    9. Después de 2 días, aspirar todo medio en la placa de inserción de la membrana y cambiar el medio normal calcio EP2 por 2 días.
    10. Después de 2 días, Aspire todos mediano y agregar 3 mL del medio cornification sólo a la parte inferior para generar una interfaz de aire líquido.
    11. Mantener el organoide de piel 3D hasta 14 días a 37 ° C con 5% CO2 y cambiar el medio cada día. El organoide de piel 3D por el borde del inserto de corte y cosecha usar un estudio adicional de la coloración y el injerto de piel.
  2. Injerto de piel
    1. Realizar la anestesia de inhalación en ratones NOD/scid (hombres, 6 semanas de edad), usando un método estándar, institucionalmente aprobado. Para injerto de piel, afeitarse el pelo de la piel dorsal de cada ratón.
    2. Eliminar una sección de 1 cm x 2 cm de piel de ratón, usando tijeras curvas con fórceps.
    3. Lugar el organoide 3D CBMC-iPSC-derivados de la piel en el sitio de defecto y usando un método de preparación tie-over con suturas de seda de sutura.
    4. Observar los ratones durante 2 semanas y sacrificarlos para análisis histológico. El protocolo de tinción fue verificado en estudios previos16.

Resultados

Piel se compone, en su mayor parte, de la epidermis y la dermis. Queratinocitos son el tipo principal de célula de la epidermis, y los fibroblastos son el tipo principal de célula de la dermis. En figura 1se muestra el esquema de la diferenciación del keratinocyte. CBMC-iPCSc se mantuvieron en un plato cubierto de vitronectina (figura 1B). En este estudio, hemos diferenciado CBMC-iPSCs en queratinocitos y fibroblastos con for...

Discusión

IPSCs humanas se han sugerido como una nueva alternativa para la medicina regenerativa personalizada17. Derivados del paciente personalizados iPSCs reflejan características de los pacientes que pueden utilizarse para el modelado de enfermedades, detección de drogas y trasplante autólogo18,19. El uso de iPSCs derivados del paciente también puede superar problemas con respecto a células primarias, la falta de un número adecuado de cél...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Corea salud tecnología R & D proyectos, Ministerio de sanidad, bienestar y familia, República de Corea (H16C2177, H18C1178).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AdenineSigmaA2786Component of differentiation medium for fibroblast
AggreWell Medium (EB formation medium)STEMCELL05893EB formation
Anti-Fibronectin antibodyabcamab23750Fibroblast marker
Anti-KRT14 antibodyabcamab7800Keratinocyte marker
Anti-Loricrin antibodyabcamab85679Stratum corneum marker
Anti-p63 antibodyabcamab124762Keratinocyte marker
Anti-Vimentin antibodySanta cruzsc-7558Fibroblast marker
BAND AID FLEXIBLE FABRICJohnson & Johnson-Bandage
Basement membrane matrix (Matrigel)BD354277Component of differentiation medium for fibroblast
BLACK SILK sutureAILEEESK617Skin graft
CaCl2SigmaC5670Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Collagen type IBD3542363D skin organoid
Collagen type IVSanta-cruzsc-29010Component of differentiation medium for keratinocyte
Defined keratinocyte-Serum Free MediumGibco10744-019Component of differentiation medium for keratinocyte
DMEM, high glucoseGibco11995065Component of differentiation medium
DMEM/F12 MediumGibco11330-032Component of differentiation medium
Essential 8 mediumGibcoA1517001iPSC medium
FBS, QualifiedCorning35-015-CVComponent of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Glutamax Supplement Gibco35050061Component of differentiation medium for fibroblast
InsulinInvtrogen12585-014Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Iris standard curved scissorProfessionalPC-02.10Surgical instrument
Keratinocyte Serum Free MediumGibco17005-042Component of differentiation medium for keratinocyte
L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrateSigmaA8960Component of differentiation medium for keratinocyte
MEM Non-Essential Amino AcidGibco1140050Component of differentiation medium for fibroblast
Meriam Forceps Thumb 16 cmHIROSEHC 2265-1Surgical instrument
NOD.CB17-Prkdc SCID/JThe Jackson Laboratory001303Mice strain for skin graft
Petri dish 90 mmHyundai MicroH10090Plastic ware
Recombinant Human BMP-4R&D314-BPComponent of differentiation medium for keratinocyte
Recombinant human EGF proteinR&D236-EGComponent of differentiation medium for keratinocyte
Retinoic acidSigmaR2625Component of differentiation medium for keratinocyte
T/C Petridish 100 mm, 240/bxTPP93100Plastic ware
TransferrinSigmaT3705Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Transwell-COL collagen-coated membrane inserts CorningCLS3492Plastic ware for 3D skin organoid 
VitronectinLife technologiesA14700iPSC culture
Y-27632 Dihydrochloridepeprotech1293823iPSC culture

Referencias

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