JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz İndüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı lenfositi ve fibroblastlar ayırt etmek ve bir 3B cilt organoid oluşturmak gösterilmiştir bir protokol bu lenfositi ve fibroblastlar kullanarak öneriyoruz. Bu iletişim kuralı insanlaşmış fareler model oluşturma ek bir adım içerir. Burada sunulan teknik dermatolojik araştırma artıracaktır.

Özet

Deri vücudun en büyük organıdır ve birçok işlevi vardır. Deri bir fiziksel bariyer ve vücudun koruyucu görev yapan ve bedensel işlevleri düzenleyen. Biyomimetik imitasyon modelleri, sistemleri ve karmaşık insan sorunları1çözme amacıyla doğa unsurları olduğunu. Cilt Biyomimetik tüp bebek Hastalıkları Araştırma ve içinde vivo rejeneratif tıp için yararlı bir araçtır. İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) sınırsız nükleer silahların yayılmasına karşı karakteristik ve üç germ katmanları ayırt etme yeteneği var. İnsan iPSCs kan hücreleri, keratinositler, fibroblastlar ve diğerleri gibi çeşitli Primer hücre oluşturulur. Bunlar arasında kordon kanı mononükleer hücre (CBMCs) allojenik rejeneratif tıp açısından bir alternatif hücre kaynağı olarak ortaya çıkmıştır. Bankacılık sistemi hücre insan lökosit antijeni (HLA) yazarak önemlidir çünkü CBMCs içinde rejeneratif tıp yararlıdır. Biz CBMC-iPSCs farklılaşma lenfositi ve fibroblast ve 3B cilt organoid nesil için bir yöntem sağlar. Lenfositi CBMC IPSC türetilmiş ve fibroblastlar bir birincil hücre satırı ile benzer özelliklere sahip. 3B cilt organoids epidermal bir katman bir dermal tabaka üzerine overlaying tarafından oluşturulur. Bu 3D cilt organoid dikim tarafından insanlaşmış fare modeli oluşturulur. Bu çalışmada bir 3D insan IPSC elde edilen deri organoid tüp bebek ve içinde vivo dermatolojik araştırma için roman, alternatif bir araç olabilir gösterir.

Giriş

Deri vücudun en dış yüzeyi kaplar ve iç organları korur. Cilt patojenlere karşı korumak, emici ve su depolama da dahil olmak üzere çeşitli işlevleri vardır, vücut ısısını düzenleyen ve vücut excreting2atık. Deri nakli cilt kaynağına bağlı olarak sınıflandırılabilir; deri başka bir donörden kullanarak greft allogrefler denir ve hastanın kendi cilt kullanarak greft autografts vardır. Bir otogrefti onun düşük ret riski nedeniyle tercih edilen tedavi olmasına rağmen cilt biyopsileri hastalarda şiddetli lezyonlar veya cilt hücrelerini yetersiz sayıda gerçekleştirmek zordur. Şiddetli yanık hastalarında, cilt hücrelerinin sayısının üç katı geniş alanları kapsayacak şekilde gereklidir. Bir hastanın vücudundan deri hücrelerinin sınırlı yer allogenous nakli gerekli olduğu durumlarda oluşur. Genellikle yaklaşık 1 hafta3sonra ana bilgisayarın bağışıklık sistemi tarafından reddedilir bu yana Otolog transplantasyon zamana bir homogreft geçici olarak kullanılır. Ret hastanın bağışıklık sistemi tarafından üstesinden gelmek için Greftler bir kaynak hasta4aynı bağışıklık kimlik ile gelmelidir.

İnsan iPSCs için kök hücre tedavisi5hücreleri gelişmekte olan bir kaynaktır. İnsan iPSCs somatik hücrelerden OCT4, SOX2, Klf4 ve c-Myc6gibi programlama faktörler kullanılarak oluşturulur. İnsan iPSCs kullanarak embriyonik kök hücreleri (ESCs)7,8etik ve immünolojik sorunları üstesinden gelir. İnsan iPSCs ve pluripotency var üç germ katmanları9içine ayırabilirsiniz. HLA, rejeneratif tıp, kritik bir faktör varlığı bağışıklık yanıtı ve ret10olasılığını belirler. Hasta kaynaklı iPSCs kullanımı hücre kaynaklı sınırlama ve bağışıklık sistemi ret sorunları da çözmektedir. CBMCs aynı zamanda rejeneratif tıp11için bir alternatif hücre kaynağı olarak ortaya çıkmıştır. CBMC bankacılık sırasında oluşan yazarak, zorunlu HLA kolayca araştırma ve nakli için kullanılabilir. Ayrıca, homozigoz HLA tipi iPSCs yaygın olarak çeşitli hastalar12' ye uygulayabilirsiniz. Bir roman ve hücre tedavisi ve allojenik rejeneratif tıp12,13,14için etkin strateji bir CBMC-IPSC bankadır. Bu çalışmada, CBMC-iPSCs, keratinositler ve fibroblastlar, ayrıştırılan kullanın ve tabakalı 3B cilt oluşturma. Bu çalışmada sonuçlarından bir 3B cilt CBMC IPSC türetilmiş organoid tüp bebek ve içinde vivo dermatolojik araştırma için bir roman araç olduğunu göstermektedir.

Protokol

Hayvanları içeren tüm yordamları laboratuvar hayvanları Sosyal Yardım Yasası, bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanım kılavuzu uygun olarak gerçekleştirilen ve kurallar ve ilkeler kemirgen deneme için sağlanan kurumsal hayvan bakım ve Kore Katolik Üniversitesi Tıp Okulu Komitesi (IACUC) kullanın. Çalışma Protokolü Katolik Üniversitesi Kore (CUMC-2018-0191-01) kurumsal inceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. IACUC ve bölümü, laboratuvar hayvanları (DOLA) Kore Katolik Üniversitesi, Songeui kampüs 2017 ve Edinsel Derneği değerlendirmesi için Kore mükemmellik hayvan laboratuvar tesiste Kore gıda ve İlaç İdaresi akredite ve Akreditasyon laboratuvar hayvan bakımı International (AAALAC) Uluslararası tam Akreditasyon 2018.

1. cilt hücre farklılaşması İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden

  1. Orta hazırlık
    Not: tüm Orta 4 ° C'de 3 aya kadar karanlık bir ortamda saklayın. Tüm Orta sterilizasyon için kullanmadan önce 0.22 mikron polyethersulfone filtre sistemi kullanarak filtre. Tüm Orta toplam hacmi 500 mL içinde kullanılabilir.
    1. KDM1 hazırlamak (keratinosit farklılaşma orta 1). Mix Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) / % 2 fetal sığır serum (FBS), 0,3 mmol/L L-askorbik asit, 5 μg/mL insülin ve 24 µg/mL adenin ile F12 orta (3:1).
    2. KDM2 hazırlamak (keratinosit farklılaşma orta 2). Mix tanımlanan keratinosit serum-Alerjik orta ( Tablo reçetesigörmek) 0,3 mmol/l L-askorbik asit, 5 μg/mL insülin ve 10 μg/mL adenin ile.
      Not: Tanımlanmış keratinosit serum-Alerjik orta büyüme ve genişleme lenfositi desteklemek için optimize edilmiştir.
    3. KDM3 hazırlamak (keratinosit farklılaşma orta 3). Mix keratinosit serum-Alerjik orta tanımlanan ve keratinosit serum-Alerjik orta (1:1) Malzemeler tablo Ayrıntılar için bkz:.
      Not: Keratinosit serum-Alerjik orta büyüme ve lenfositi bakımı için optimize edilmiştir.
    4. FDM1 hazırlamak (fibroblast farklılaşma orta 1). %5 FBS, 5 μg/mL insülin, 0,18 mM adenin ve 10 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF) ile Mix DMEM/F12 orta (3:1).
    5. FDM2 hazırlamak (fibroblast farklılaşma orta 2). %5 FBS ve % 1 gerekli olmayan amino asitler ile Mix DMEM/F12 orta (1:1).
    6. EP1 hazırlamak (epitel orta 1). Mix DMEM/F12 (3:1) 4 mM L-glutamin, 40 mikron adenin, 10 μg/mL transferrin, 10 μg/mL insülin ve % 0.1 ile FBS.
    7. EP2 hazırlamak (epitel orta 2). Mix EP1 ve 1.8 mM Kalsiyum klorür.
    8. EP3 hazırlamak (epitel orta 3, anormalligi orta). 4 mM L-glutamin, 40 mikron adenin, 10 μg/mL transferrin, 10 μg/mL insülin, %2 FBS ve 1.8 mM Kalsiyum klorür ile Mix F12 orta.
  2. Embriyonik gövde üretimi
    1. CBMC-iPSCs bir önceki çalışmada12' de gösterilen iletişim kuralını kullanarak oluşturun.
    2. Kat kültür yemekleri, vitronectin kullanarak. 100 mm çanak kat için 5 mL hazırlayın.
      1. Çözülme ve 0,5 mg/mL vitronectin 50 μL resuspend (son konsantrasyonu: 5 µg/mL) ile 5 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS). Yemekler için çözüm ekleyin ve 1 h. aspiratı kaplama malzemesi kullanmadan (kurumaya değil) için (RT) oda sıcaklığında kuluçkaya.
    3. Vitronectin kaplı 100 mm için CBMC elde edilen iPSCs plaka ve IPSC orta (E8) günlük % 10 CO237 ° C'de değiştirin korumak.
    4. Embriyonik organları (EBs) (kısaca aşağıda açıklanan) bir önceki çalışma15 ' te gösterilen iletişim kuralını kullanarak oluşturun. İPSCs hücreleri % 80 izdiham gelinceye orta değiştirerek genişletin. % 80 izdiham, orta kaldırmak ve PBS ile yıkayın.
    5. 1 mL 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) hücrelerle tedavi. 37 ° c % 5 CO2 2 min için kuluçkaya ve E8 orta 3 mL kullanarak hücre hasat. 250 x g 2 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi.
    6. Süpernatant Aspire edin ve 5 mL E8 orta de hücrelere uygulayın. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve 1 x 106 hücre yeni bir 15 mL konik tüp aktarın. 250 x g 2 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi.
    7. EB oluşumu orta 10 mikron Rho ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü ile 2.5 mL transfer edilen hücrelerle resuspend. 1 x 104 hücreleri (25 µL/damla) 10-100 μL çok kanallı pipet kullanarak noncoated kültür plaka kapak bırak. 1 x 106 hücrelerden (1 x 104 hücreleri/1 EB) formu 100 EBs. Çanak üzerinde açmak ve damlacık üzerinde kapak için asmak.
      Not: ROCK önleyici bakım ve farklılaşma süreci içinde belgili tanımlık ek adım sırasında gereklidir. ROCK inhibitörü EB toplama aşamada sadece ekleyin.
    8. Damlacıkları %5 CO2 37 ° C'de 1 gün için kuluçkaya.
    9. Ertesi gün, 100 hasat EBs ve farklılaşma için kullanabilirsiniz. Plaka IPSC orta (E8 orta) veya PBS ile kapağı dışarı yıkama ve içeriğini bir 50 mL konik tüp için hasat. RT 1 dk. için onları sakinleştirmek için EBs korumak. Süpernatant Aspire edin, EBs E8 orta ile resuspend ve bir 90 mm Petri kabına farklılaşma kadar proje.
  3. CBMC-iPSCs farklılaşma keratinositler içine
    Not: CBMC-iPSCs dan keratinosit farklılaşma düzeni için şekil 1Abakın.
    1. Hasat 100 EBs IPSC orta veya PBS ile 50 mL konik tüp için. RT EBs yerleşmek için 1 dakika için korumak. Konik tüp alt kısmında yerleşmek emin olun. Süpernatant Aspire edin ve EBs E8 orta 1 ng/mL kemik morfogenetik protein 4 (BMP4) ile resuspend. EBs bir 90 mm Petri kabına aktarmak ve 1 gün için % 5 CO2 37 ° C'de proje.
    2. Kültür yemekleri, tip IV kollajen kullanılarak ceket. 5 mL türü IV kollajen 100 mm çanak kat için hazırlayın.
      1. Çözülme ve IV kollajen çözüm türü resuspend (son konsantrasyonu: 50 µg/mL) N HCl. çözüm yemekleri ekleyip RT için 1 h. kuluçkaya 0,05 ile kaplama malzemesi kullanmadan (kurumaya değil) Aspire edin.
        Not: tabakları kullanmadan önce 3 bulaşıkları yıkamak x herhangi bir asit kaldırmak için PBS ile.
    3. EBs (Adım 1.3.1) 50 mL konik tüp için hasat ve RT 1 dk. için onları sakinleştirmek için proje. Konik tüp alt kısmında yerleş, süpernatant Aspire edin, EBs KDM1 6 ml 10 µM ROCK inhibitörü ile resuspend emin olun. EBs türü IV 100 mm kolajen kaplı yemek için transfer.
      Not: ROCK inhibitörü EB eki aşamada sadece ekleyin.
    4. 0-8 gün arasında her gün KDM1 için 3 µM retinoik asit (RA) ile orta ve 25 ng/mL her BMP4 ve EGF değiştirin. EBs %5 CO237 ° C'de korumak.
    5. Arasındaki gün 9 – 12, orta KDM2 3 µM RA, 25 ng/mL BMP4 ve 20 ng/mL EGF için her gün değiştirin.
    6. 13-30 gün arasında orta her geçen gün KDM3 için 10 ng/mL BMP4 ve 20 ng/mL EGF ile değiştirin.
  4. CBMC-IPSC farklılaşma fibroblastlar içine
    Not: CBMC-iPSCs dan fibroblast farklılaşma düzeni için Şekil 2Abakın.
    1. Kat kültür yemekleri, membran matrisi kullanarak. 100 mm çanak kat için 5 mL hazırlayın.
      1. Membran matris çözülme (son konsantrasyonu: 600 ng/mL) ve DMEM/F12 orta ile sulandırmak. Yemekler için çözüm ekleyin ve 30 dk. aspiratı kaplama malzemesi kullanmadan (kurumaya değil) 37 ° C'de kuluçkaya.
    2. Hasat 100 EBs IPSC orta veya PBS ile bir pipet kullanarak bir 50 mL konik tüp için. RT EBs yerleşmek için 1 dakika için korumak. Konik tüp alt kısmında razı olun. Süpernatant kaldırın.
    3. FDM1 6 ml 10 µM ROCK inhibitörü ile 1.000 µL pipet kullanarak EBs resuspend. EBs (orta ile) bir membran 100 mm matris kaplı yemek için aktarmak ve % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya. FDM1 3 gün boyunca her gün yenileyin.
      Not: Sadece EB eki aşamada ROCK inhibitörü ekleyin.
    4. FDM1 4-6 gün arasında 0.5 nM kemik morfogenetik protein 4 (BMP 4) ekleyin.
    5. Gün 7, orta FDM2 için 1 hafta boyunca her gün değiştirin.
    6. Gün 14, 1 mL 1 mM EDTA ekleyin ve %5 CO2 ile 37 ° C'de 2 dk. süpernatant kaldırmak ve 5 mL FDM1 de hücrelerde resuspend FDM2 ve santrifüj 250 x g , 3 mL hücrelerle 2 dk. hasat için kuluçkaya.
    7. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak, 2 x 106 hücreler ile FDM1 orta resuspend ve noncoated yemek için hücreleri aktarın. %5 CO2 37 ° C'de hücreleri korumak ve orta her gün değiştirin.
    8. Kat kültür yemekleri kullanarak, tip ı kollajen. 100 mm çanak kat için 5 mL hazırlayın. Seyreltik tip ı kollajen çözüm (son konsantrasyonu: 50 µg/mL) 0,02 N Asetik asit. Yemekler için çözüm ekleyin ve 1 h. aspiratı kaplama malzemesi kullanmadan (kurumaya değil) için RT kuluçkaya.
      Not: tabakları kullanmadan önce 3 bulaşıkları yıkamak x asit kaldırmak için PBS ile.
    9. Gün 21, 1 mL 1 mM EDTA ekleyin ve %5 CO2 ile 37 ° C'de 2 dk. süpernatant kaldırmak ve 5 mL FDM1 de hücrelerde resuspend FDM1 ve santrifüj 250 x g , 3 mL hücrelerle 2 dk. hasat için kuluçkaya. Bir hemasitometre ve transfer kullanarak hücreleri 2 x 106 hücreler türü için ben FDM1 orta ile 100 mm kolajen kaplı yemek sayısı. %5 CO2 37 ° C'de hücreleri korumak ve orta her gün değiştirin.
    10. Gün 28, 1 mL 1 mM EDTA ekleyin ve %5 CO2 ile 37 ° C'de 2 dk. süpernatant kaldırmak ve 5 mL FDM1 de hücrelerde resuspend FDM1 ve santrifüj 250 x g , 3 mL hücrelerle 2 dk. hasat için kuluçkaya. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve 2 x 106 hücreler ile FDM1 orta noncoated bir yemek için transfer. Hücre 37 ° C % 5 CO2 , korumak ve orta her gün değiştirin.
      Not: bir birincil fibroblast hücre kültürünü ve passage kadar 10 geçişleri gibi IPSC kaynaklı fibroblastlar çoğalırlar. Bu çalışmada, daha fazla çözümleme için IPSC kaynaklı fibroblastlar iki ile beş pasajlar kullandık.

2. uygulama farklılaşmış hücre hiPSC elde edilen

  1. 3B cilt organoid nesil
    1. Etkisiz türü hazırlamak ben üreticinin önerilerini takip kollajen buz üzerinde. 3 mg/mL nihai toplama kullanmak için tip ı kollajen (hisse senedi konsantrasyonu tip ı kollajen olduğunu 3,47 mg/mL) ve karışım son hacmi 5 mL olduğundan emin olun. 10 x PBS hacmi hesaplamak (son Cilt/10 = 0.5 mL). Ses düzeyini hesaplamak tip ı kollajen kullanılmak üzere (son kollajen konsantrasyonu x son hacim / stok kollajen konsantrasyonu 5 mL x 3 mg / mL = / 3,47 mg / mL = 4,32 mL). 1 N NaOH hacmi hesaplamak (Cilt kollajen kullanılmak üzere 0.023 mL = 0.1 mL x). DH2O hacmi hesaplamak (10 x PBS - birim 1 N NaOH hacmi son hacim - cilt kollajen - 5 mL - 4,32 mL-0.5 mL-0.1 mL = 0,08 mL =). Tüp içeriğini karıştırmak ve kullanıma hazır kadar buz üzerinde tutun.
    2. 1 mL EDTA IPSC kaynaklı fibroblastlar 1.4.10 adımından ekleyin ve %5 CO2 ile 37 ° C'de 2 dk. müstakil hücre hasat, bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve 2 x 105 hücreleri yeni bir 15 mL konik tüp nakletmek için kuluçkaya. Vasıl 250 x g 2 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. 1.5 ml FDM1 IPSC kaynaklı fibroblast hücreleri resuspend ve türü etkisiz hale ben kollajen çözümü (1:1).
      Not: çözüm yavaşça bubbles kaçınmak için karıştırın.
    3. Membran Ekle bir 6-şey Mikroplaka yerleştirin, karışım Ekle'nin üzerine aktarmak ve RT 30 min için kuluçkaya.
      Not: plakaları hareket ettirmeyin.
    4. Jelleşme onayladıktan sonra orta 2 mL Ekle ve Kuyunun dibine 3 mL ekleyin. Fibroblastlar ve kollajen %5 CO2 37 ° C'de matrisi için 5-7 gün jelleşme tamamlanana kadar ve artık sözleşmeleri kuluçkaya.
    5. Sonra tam jelleşme, IPSC kaynaklı keratinositler (Kimden adım 1.3.6) ayırmak EDTA kullanarak. 1 mL EDTA ekleyin ve %5 CO2 ile 37 ° C'de 2 dk. müstakil hücre hasat, bir hemasitometre kullanarak bunları saymak ve 1 x 106 hücre yeni bir 15 mL konik tüp nakletmek için kuluçkaya. Santrifüj 250 x g de 2 dk için.
    6. Süpernatant kaldırmak ve 50-100 µL düşük kalsiyum epitel orta 1 (EP1) 1 x 106 hücreler resuspend.
    7. Tüm Orta matris Aspire edin (bkz. Adım 2.1.5) ve 1 x 106 hücreler her fibroblast katman üzerine IPSC kaynaklı keratinositler, temel olarak belirler. Plaka %5 CO2 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
      Not: plaka hareket etmez ve herhangi bir ortamda keratinosit ekin eklemeyin.
    8. Üst ekleme ve Kuyunun dibine EP1 3 mL EP1 2 mL ekleyin.
    9. 2 gün sonra tüm Orta membran Ekle plaka Aspire edin ve orta 2 gün boyunca normal kalsiyum EP2 değiştirin.
    10. 2 gün sonra tüm Orta Aspire edin ve anormalligi orta 3 mL hava-sıvı arabirim oluşturmak için sadece en altına ekleyin.
    11. 14 gün %5 CO2 ile 37 ° C'de için 3B cilt organoid korumak ve orta her gün değiştirin. 3B cilt organoid ucun kenar kesim tarafından hasat ve boyama ve deri grefti başka bir çalışma için kullanabilirsiniz.
  2. Deri grefti
    1. İnhalasyon anestezi NOD/scid fareler (erkek, 6 haftalık) üzerinde gerçekleştirmek, standart, kurumsal olarak onaylanmış bir yöntem kullanarak. Deri nakli için her fare dorsal deri kürk tıraş.
    2. Forseps ile eğri makas kullanırken fare Cilt 1 cm x 2 cm bölümünü kaldırın.
    3. 3B cilt CBMC IPSC elde edilen organoid bir kravat-over soyunma yöntemiyle ile ipek Dikiş dikiş ve kusur site üzerine yerleştirin.
    4. Fareler iki haftadır gözlemlemek ve histolojik analiz için onları kurban. Boyama Protokolü önceki çalışmalar16' doğrulandı.

Sonuçlar

Cilt, çoğunlukla, epidermis ve dermis oluşmaktadır. Keratinositler ana hücre tipi epidermis, ve fibroblastlar dermis ana hücre türü vardır. Keratinosit farklılaşma düzeninin şekil 1içindeAgösterilir. CBMC-iPCSc vitronectin kaplı bir tabak (şekil 1B) muhafaza. Bu çalışmada, keratinositler ve EB oluşumu kullanarak fibroblastlar CBMC-iPSCs farklı. EBs asılı kullanarak oluşturulan damla lenfositi ve fibrobla...

Tartışmalar

İnsan iPSCs kişiselleştirilmiş rejeneratif tıp17için yeni bir alternatif olarak önerilmiştir. Kişiselleştirilmiş iPSCs hasta kaynaklı hastalık modelleme, uyuşturucu tarama ve Otolog transplantasyon18,19için kullanılabilir hasta özelliklerini yansıtır. Hasta kaynaklı iPSCs kullanımı da Primer hücre, yeterli hücre sayıları ve bağışıklık tepkileri5,17

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser sağlık, refah ve aile işleri, Kore Cumhuriyeti (H16C2177, H18C1178) için bir hibe Kore sağlık teknoloji R & D proje, Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AdenineSigmaA2786Component of differentiation medium for fibroblast
AggreWell Medium (EB formation medium)STEMCELL05893EB formation
Anti-Fibronectin antibodyabcamab23750Fibroblast marker
Anti-KRT14 antibodyabcamab7800Keratinocyte marker
Anti-Loricrin antibodyabcamab85679Stratum corneum marker
Anti-p63 antibodyabcamab124762Keratinocyte marker
Anti-Vimentin antibodySanta cruzsc-7558Fibroblast marker
BAND AID FLEXIBLE FABRICJohnson & Johnson-Bandage
Basement membrane matrix (Matrigel)BD354277Component of differentiation medium for fibroblast
BLACK SILK sutureAILEEESK617Skin graft
CaCl2SigmaC5670Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Collagen type IBD3542363D skin organoid
Collagen type IVSanta-cruzsc-29010Component of differentiation medium for keratinocyte
Defined keratinocyte-Serum Free MediumGibco10744-019Component of differentiation medium for keratinocyte
DMEM, high glucoseGibco11995065Component of differentiation medium
DMEM/F12 MediumGibco11330-032Component of differentiation medium
Essential 8 mediumGibcoA1517001iPSC medium
FBS, QualifiedCorning35-015-CVComponent of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Glutamax Supplement Gibco35050061Component of differentiation medium for fibroblast
InsulinInvtrogen12585-014Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Iris standard curved scissorProfessionalPC-02.10Surgical instrument
Keratinocyte Serum Free MediumGibco17005-042Component of differentiation medium for keratinocyte
L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrateSigmaA8960Component of differentiation medium for keratinocyte
MEM Non-Essential Amino AcidGibco1140050Component of differentiation medium for fibroblast
Meriam Forceps Thumb 16 cmHIROSEHC 2265-1Surgical instrument
NOD.CB17-Prkdc SCID/JThe Jackson Laboratory001303Mice strain for skin graft
Petri dish 90 mmHyundai MicroH10090Plastic ware
Recombinant Human BMP-4R&D314-BPComponent of differentiation medium for keratinocyte
Recombinant human EGF proteinR&D236-EGComponent of differentiation medium for keratinocyte
Retinoic acidSigmaR2625Component of differentiation medium for keratinocyte
T/C Petridish 100 mm, 240/bxTPP93100Plastic ware
TransferrinSigmaT3705Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Transwell-COL collagen-coated membrane inserts CorningCLS3492Plastic ware for 3D skin organoid 
VitronectinLife technologiesA14700iPSC culture
Y-27632 Dihydrochloridepeprotech1293823iPSC culture

Referanslar

  1. Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
  2. Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'etre" of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
  3. Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
  4. Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
  5. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  6. Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
  7. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
  8. Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
  9. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  10. Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
  11. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  12. Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
  13. Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
  14. Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
  15. Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008)
  16. Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
  17. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
  18. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  19. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  20. Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
  21. Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
  22. Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
  23. Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
  24. Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
  25. Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
  26. Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
  27. Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
  28. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
  29. Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
  30. Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
  31. Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
  32. Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 2 (4), 137 (2014).
  33. Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
  34. Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im biyolojisisay 146Induced pluripotent k k h crekordon kan monon kleer h crefibroblastkeratinosit3B cilt organoidderi greftiinsanla m fare modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır