JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציעים פרוטוקול זה מראה כיצד להבדיל keratinocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה ו fibroblasts וליצור תא צורב של העור תלת-ממד באמצעות אלה keratinocytes ו fibroblasts. פרוטוקול זה מכיל צעד נוסף של יצירת מודל humanized עכברים. הטכניקה המובאת כאן תשפר את המחקר דרמטולוגית.

Abstract

העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף, יש פונקציות רבות. העור משמש מחסום פיסי, מגן על הגוף, מווסת את התפקודים הגופניים. ביומימטיקה היא החיקוי של דגמים, מערכות ורכיבים של הטבע לצורך פתרון בעיות אנושיות מורכבות1. ביומימטיקה העור הוא כלי שימושי עבור רפואה רגנרטיבית ויוו ומחקר במחלה במבחנה. תאי גזע pluripotent המושרה אנושי (iPSCs) יש על מאפייני התפשטות ללא הגבלה את היכולת של בידול שלוש שכבות הנבט. IPSCs האנושי נוצרים מתאי ראשי שונים, כגון תאי דם, keratinocytes, fibroblasts ועוד. ביניהם, כבל תאי תאי דם (CBMCs) הופיעו כמקור חלופי תא מנקודת המבט של רפואה רגנרטיבית allogeneic. CBMCs הם שימושי רפואה רגנרטיבית כי הקלדת אנטיגן (הלע) לויקוציטים אנושיים חיוני לתא מערכת בנקאות. אנו מספקים שיטה את הבידול של CBMC-iPSCs לתוך keratinocytes ו fibroblasts ועל הדור של תא צורב העור תלת-ממד. Keratinocytes CBMC iPSC-נגזר fibroblasts יש מאפיינים דומים לקו התא הראשי. Organoids העור תלת-ממד נוצרות על-ידי השלכת של שיכבת אל שכבת הדרמיס. מאת משתילים תא צורב את העור תלת-ממד, נוצר מודל humanized עכברים. מחקר זה מראה כי תא צורב תלת-ממד עור האדם הנגזרות iPSC עשוי להיות כלי הרומן חלופי למחקר דרמטולוגית במבחנה, ויוו.

Introduction

העור המכסה את פני השטח החיצוני של הגוף ומגנה על האיברים הפנימיים. לעור יש פונקציות שונות, כולל הגנה מפני פתוגנים, קליטת ואחסון מים, לווסת את טמפרטורת הגוף, הגוף מפריש לבזבז2. שתלי העור יכולים להיות מסווגים בהתאם לסוג מקור העור; שתלי באמצעות העור עוד תורם מכונים allografts, שתלי העור של המטופל באמצעות autografts. למרות בשתל הטיפול המועדפת עקב סיכון נמוך הדחייה שלה, ביופסיות עור קשים לביצוע על חולים עם פצעים חמורים או מספר לא מספיק של תאי העור. בחולים עם כוויות חמורות, שלוש פעמים את מספר תאי העור נחוצים לכסות שטחים גדולים. המוגבל של תאי עור מגופו של החולה תוצאות במצבים איפה השתלת allogenous הכרחי. יודע משמש באופן זמני עד עצמיים השתלת יכול להתבצע מאז היא בדרך כלל נדחית על ידי המערכת החיסונית של המחשב המארח לאחר כ שבוע 13. כדי להתגבר על דחייה על ידי המערכת החיסונית של החולה, שתלי חייב לבוא ממקור עם זהות המערכת החיסונית אותו כמו החולה4.

IPSCs האנושי הם מקור המתעוררים של תאים עבור טיפול בתאי גזע5. IPSCs האנושי נוצרים תאים סומטיים, באמצעות גורמים התיכנות כגון OCT4, SOX2, Klf4 ו- c-Myc6. שימוש iPSCs האדם מתגבר על בעיות אתיות ו של תאי גזע עובריים (ESCs)7,8. IPSCs האנושי יש pluripotency, יכולים להתמיין שלוש שכבות הנבט9. הנוכחות של הלע, גורם קריטי רפואה רגנרטיבית, קובע את התגובה החיסונית ועל האפשרות של דחיית10. השימוש של החולה, נגזר iPSCs פותר הבעיות של התא-מקור דחייה הגבלה ואת המערכת החיסונית. CBMCs הופיעו גם כמקור תא חלופי עבור רפואה רגנרטיבית11. הלע חובה להקליד, אשר מתרחש במהלך CBMC בנקאות, יכול לשמש בקלות עבור מחקר והשתלות. IPSCs הלע-סוג נוסף, homozygous נרחב ניתן להחיל על מטופלים שונים12. בנק CBMC-iPSC הוא רומן, אסטרטגיה יעילה עבור טיפול בתאי ו רפואה רגנרטיבית allogenic12,13,14. במחקר זה, אנו משתמשים CBMC-iPSCs, הבדיל keratinocytes ו fibroblasts, וצור שכבות העור 3D מרובדת. תוצאות של מחקר זה מציע כי תא צורב CBMC iPSC-נגזר עור תלת-ממד הוא כלי הרומן למחקר דרמטולוגית במבחנה, ויוו.

Protocol

בכל ההליכים הכרוכים חיות בוצעו על פי חוק רווחת חיות מעבדה, המדריך הטיפול ואת השימוש של חיות מעבדה, וסיפק הנחיות ומדיניות לניסויים מכרסם אכפת חיה מוסדיים ו השתמש הוועד (IACUC) של בית הספר לרפואה של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה. פרוטוקול המחקר אושרה על ידי ועדת הבדיקה המוסדי של האוניברסיטה הקתולית קוריאה (CUMC-2018-0191-01). את IACUC, את המחלקה של מעבדה חיות (מפתיעה אותנו) של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה, Songeui קמפוס מוכר המתקן מעבדה חיה מצוינות קוריאה של מינהל התרופות והמזון קוריאה בשיתוף 2017, רכשה להערכת ו הסמכה של הסמכה מלאה הבינלאומי הבינלאומי אכפת לי חיית מעבדה (AAALAC) ב-2018.

1. עור תאית התמיינות של תאי גזע pluripotent המושרה

  1. הכנה בינונית
    הערה: לאחסן כל בינוני ב 4 ° C בסביבת כהה עד 3 חודשים. לסנן כל מדיום באמצעות מערכת סינון polyethersulfone 0.22 μm לפני השימוש עבור עיקור. כל מדיום היה זמין בהנפח הכולל של 500 מ"ל.
    1. הכנת KDM1 (תקין בידול בינוני 1). בינוני (DMEM ששינה הנשר של תערובת Dulbecco) / F12 בינונית (3:1) עם 2% סרום שור עוברית (FBS), חומצה אסקורבית L mmol/L 0.3, 5 μg/mL אינסולין 24 אדנין µg/mL.
    2. הכנת KDM2 (תקין בידול בינוני 2). מיקס מוגדר תקין ללא סרום בינונית (ראה את הטבלה של חומרים) עם חומצה אסקורבית L mmol/l 0.3, 5 μg/mL אינסולין ו אדנין μg/מ"ל.
      הערה: מוגדר תקין ללא סרום בינוני ממוטבת כדי לתמוך את הצמיחה ואת התפשטות keratinocytes.
    3. הכנת KDM3 (תקין בידול בינוני 3). מיקס מוגדר תקין ללא סרום בינוני ולראות תקין ללא סרום בינוני (1:1) את הטבלה של חומרים לפרטים.
      הערה: תקין ללא סרום בינוני ממוטב את הצמיחה ואת התחזוקה של keratinocytes.
    4. הכנת FDM1 (פיברובלסט בידול בינוני 1). מיקס DMEM/F12 בינונית (3:1) עם 5% FBS 5 μg/mL אינסולין, 0.18 מ מ אדנין, גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) 10 ng/mL.
    5. הכנת FDM2 (פיברובלסט בידול בינוני 2). מיקס DMEM/F12 בינוני (1:1) עם 5% FBS ו- 1% לא חיוניות חומצות אמינו.
    6. להכין EP1 (אפיתל בינוני 1). מיקס DMEM/F12 (3:1) עם 4 מ מגלוטמין, 40 μM אדנין, 10 transferrin μg/mL, אינסולין μg/מ"ל ו 0.1% FBS.
    7. הכנת EP2 (אפיתל בינוני 2). מערבבים EP1 ו- 1.8 מ מ סידן כלורי.
    8. להכין EP3 (אפיתל בינוני 3, התקרנות בינוני). בינוני F12 לערבב עם 4 מ מגלוטמין, אדנין μM 40, 10 transferrin μg/mL, אינסולין μg/מ"ל, 2% FBS ו- 1.8 מ"מ סידן כלורי.
  2. הגוף עובריים דור
    1. צור משתמש בפרוטוקול שמוצג עם המחקר הקודם12CBMC-iPSCs.
    2. המעיל תרבות מנות, באמצעות vitronectin. להכין 5 מ"ל עד מעיל מנה 100 מ מ.
      1. להפשיר, resuspend 50 μL של 0.5 מ"ג/מ"ל vitronectin (ריכוז הסופי: µg 5/mL) עם 5 מ ל תמיסת סטרילית באגירה פוספט (PBS). הוסף את הפתרון לשטוף הכלים, דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור ה 1 לשאוב חומר הציפוי לפני השימוש (לא להתייבש).
    3. לשמור iPSCs CBMC, נגזר מצופים vitronectin 100 מ"מ צלחת ולשנות את המדיום iPSC (E8) מדי יום ב 37 ° C עם 10% CO2.
    4. ליצור גופים עובריים (EBs) משתמש בפרוטוקול שמוצג המחקר הקודם15 (יפורט בקצרה כדלקמן). הרחב iPSCs על-ידי שינוי המדיום עד התאים הגיעו למפגש 80%. 80% הנהרות, להסיר את המדיום, לשטוף עם PBS.
    5. פנקו את התאים עם 1 מ"ל של 1 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA). דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 למשך 2 דקות ולקצור את התאים באמצעות 3 מ"ל של מדיום E8. Centrifuge התאים ב x 250 g למשך 2 דקות.
    6. וארוקן את תגובת שיקוע ולהחיל 5 מיליליטר E8 בינוני על התאים. לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהעביר עונה 1 פרק 106 תאים צינור חרוטי 15 מ"ל. Centrifuge התאים ב x 250 g למשך 2 דקות.
    7. Resuspend תאים שהועברו עם 2.5 מ ל EB היווצרות בינוני עם מעכבי קינאז הקשורים רו (רוק) μM 10. ירידה עונה 1 פרק 104 תאים (µL 25/טיפה) על צלחת תרבות noncoated מכסה בעזרת פיפטה רב-ערוצי μL 10 – 100. טופס 100 EBs מתאי6 עונה 1 פרק 10 (1 x 104 תאים/1 EB). . תהפוך את המנה, לשמור המכסה ה-droplet.
      הערה: רוק מעכב נדרש במהלך השלב מצורף בתהליך תחזוקה ובידול. הוסף את המדכא רוק רק בשלב צבירת EB.
    8. דגירה את טיפות ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור יום אחד.
    9. למחרת, לקצור את 100 EBs להשתמש בהם עבור בידול. לשטוף את המכסה של צלחת עם iPSC בינונית (E8 בינוני) או PBS ולקצור את תוכנו אל צינור חרוטי 50 מ. לשמור את EBs-RT עבור 1 דקות כדי להרגיע אותם. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את EBs E8 בינונית- ולתחזק אותם ב- 90 מ מ פטרי עד הבידול.
  3. הבידול של CBMC-iPSCs לתוך keratinocytes
    הערה: עבור ערכה של בידול תקין של CBMC-iPSCs, ראה איור 1א'.
    1. EBs קציר ה-100 ל צינור חרוטי 50 מ עם iPSC בינוני או PBS. שתשמור על RT במשך 1 דקה להתיישב את EBs. ודא כי הם מיישבים בתחתית הצינורית חרוט. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את EBs E8 בינונית עם 1 ng/mL עצם morphogenetic חלבון 4 (BMP4). להעביר את EBs 90 מ מ פטרי ולתחזק אותם ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור יום אחד.
    2. מעיל מנות תרבות, באמצעות קולגן סוג IV. להכין 5 מ של סוג הקולגן הרביעי כדי המעיל מנה 100 מ מ.
      1. להפשיר, resuspend הסוג הרביעי קולגן פתרון (הריכוז הסופי: µg 50/mL) עם 0.05 HCl N. להוסיף את הפתרון הכלים, תקופת דגירה-RT של ח' 1 וארוקן את חומר הציפוי לפני השימוש (לא להתייבש).
        שים לב: לפני השימוש הלוחות, לרחוץ כלים 3 x עם PBS כדי להסיר כל חומצה.
    3. לקצור את EBs (שלב 1.3.1) לרכבת התחתית חרוט 50 מ ל ולתחזק אותם ב RT עבור 1 דקות כדי להרגיע אותם. ודא כי הם ליישב בחלק התחתון של צינור חרוטי, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את EBs ב 6 מ של KDM1 עם 10 מיקרומטר רוק מעכב. להעביר את EBs המנה מצופים קולגן 100 מ מ מסוג IV.
      הערה: להוסיף את המדכא רוק רק בשלב מצורף EB.
    4. בין 0-8 ימים, לשנות את המדיום בכל יום נוספים כדי KDM1 עם חומצה retinoic מיקרומטר (RA) 3 25 ng/mL כל של BMP4 ו EGF. לשמור את EBs ב 37 ° C עם 5% CO2.
    5. בין ימים 9 – 12, לשנות את המדיום בכל יום KDM2 עם 3 µM RA, 25 ננוגרם למ"ל BMP4 20 ng/mL EGF.
    6. בין ימים 13 – 30, לשנות את המדיום בכל יום KDM3 עם 10 ננוגרם למ"ל BMP4 ו 20 ng/mL EGF.
  4. הבידול של CBMC-iPSC לתוך fibroblasts
    הערה: עבור ערכה של בידול פיברובלסט מ- CBMC-iPSCs, ראה איור 2א.
    1. המעיל תרבות מנות, באמצעות מטריצת קרום המרתף. להכין 5 מ"ל עד מעיל מנה 100 מ מ.
      1. הפשרת קרום המרתף מטריקס (הריכוז הסופי: 600 ng/mL) ו לדלל אותו עם DMEM/F12 בינוני. הוסף את הפתרון לשטוף הכלים, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לשאוב חומר הציפוי לפני השימוש (לא להתייבש).
    2. EBs קציר ה-100 ל צינור חרוטי 50 מ ל באמצעות פיפטה עם iPSC בינוני או PBS. שתשמור על RT במשך 1 דקה להתיישב את EBs. ודא שהם מיישבים בתחתית הצינורית חרוט. הסר את תגובת שיקוע.
    3. Resuspend את EBs באמצעות פיפטה µL 1,000 ב- 6 מ של FDM1 עם 10 מיקרומטר רוק מעכב. להעביר את EBs (עם בינוני) תבשיל מצופים מטריצה 100 מ מ קרום המרתף, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2. לרענן את FDM1 בכל יום אחר במשך 3 ימים.
      הערה: להוסיף רק את המדכא רוק בשלב מצורף EB.
    4. להוסיף 0.5 ננומטר עצם morphogenetic חלבון 4 (BMP 4) FDM1 בין ימים 4 ו- 6.
    5. יום 7, לשנות המדיום FDM2 בכל יום אחר במשך שבוע.
    6. יום 14, להוסיף 1 מ"ל של 1 מ מ EDTA, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור 2 דק לקצור את התאים עם 3 מ"ל של FDM2, צנטריפוגה ב 250 x g 2 דק. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים ב 5 מ של FDM1.
    7. לספור את התאים באמצעות hemocytometer, resuspend 2 x 10 תאים6 FDM1 בינונית, ולהעביר את התאים noncoated למנה. לשמור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולשנות את המדיום בכל יום אחר.
    8. המעיל תרבות מנות, באמצעות שימוש מסוג קולגן. להכין 5 מ"ל עד מעיל מנה 100 מ מ. לדלל מסוג קולגן פתרון (הריכוז הסופי: µg 50/מ"ל) ב- 0.02 נקודות חומצה אצטית N. הוסף את הפתרון לשטוף הכלים, תקופת דגירה-RT של ח' 1 לשאוב חומר הציפוי לפני השימוש (לא להתייבש).
      שים לב: לפני השימוש הלוחות, לרחוץ כלים 3 x עם PBS להסיר את החומצה.
    9. ביום 21, להוסיף 1 מ"ל של 1 מ מ EDTA, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור 2 דק לקצור את התאים עם 3 מ"ל של FDM1, צנטריפוגה ב 250 x g 2 דק. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים ב 5 מ של FDM1. ספירת התאים באמצעות העברת hemocytometer 2 x 106 תאים לסוג אני מאכל מצופה קולגן 100 מ מ FDM1 בינונית. לשמור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולשנות את המדיום בכל יום אחר.
    10. ביום 28, להוסיף 1 מ"ל של 1 מ מ EDTA, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור 2 דק לקצור את התאים עם 3 מ"ל של FDM1, צנטריפוגה ב 250 x g 2 דק. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים ב 5 מ של FDM1. לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהעביר 2 x 106 תאים תבשיל noncoated FDM1 בינונית. לשמור על התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ולשנות את המדיום בכל יום אחר.
      הערה: iPSC נגזר fibroblasts להתרבות כמו שורת התאים פיברובלסט העיקרי מעבר עד 10 קטעים. במחקר זה, השתמשנו iPSC נגזר fibroblasts של שניים עד חמישה מעברים עבור ניתוח נוסף.

2. יישום נגזר hiPSC תאים

  1. דור של העור 3D תא צורב
    1. להכין סוג ינוטרלו אני קולגן בקרח, בעקבות ההמלצות של היצרן. כמו ריכוז סופי, להשתמש 3 מ"ג/מ"ל עבור סוג הקולגן (ריכוז מניות מסוג קולגן הוא 3.47 מ"ג/מ"ל), ודא שאמצעי האחסון הסופי של התערובת 5 מ ל. חישוב הנפח של 10 x PBS (נפח סופי/10 = 0.5 מ"ל). חישוב הנפח של מסוג קולגן כדי לשמש (נפח סופי x ריכוז קולגן הסופי / מלאי הקולגן ריכוז = 5 מ ל x 3 מ"ג / מ"ל / 3.47 מ"ג / מ"ל = 4.32 מ"ל). חישוב הנפח של 1 N NaOH (נפח של קולגן כדי לשמש x 0.023 מ"ל = 0.1 מ"ל). חישוב הנפח של dH2O (נפח סופי - נפח של קולגן - נפח של 10 x PBS - נפח של 1 N NaOH = 5 מ ל- mL 4.32-0.5 מ ל- 0.1 מ"ל = 0.08 mL). לערבב את תכולת השפופרת ולשמור אותו בקרח עד מוכן לשימוש.
    2. להוסיף 1 מ"ל של EDTA iPSC נגזר fibroblasts מהשלב 1.4.10, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור 2 דק לקצור את התאים מנותקת, לספור את התאים באמצעות hemocytometer ו 2 x 105 תאים להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה ב x 250 g למשך 2 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע. Resuspend התאים iPSC נגזר fibroblasts ב- 1.5 מ של FDM1, שהמשרד את הסוג אני קולגן פתרון (1:1).
      הערה: מערבבים את הפתרון בעדינות כדי להימנע בועות.
    3. למקם את תותב ממברנה microplate 6-ובכן, להעביר את התערובת הכנס, דגירה-RT למשך 30 דקות.
      שים לב: אל תזיז את הצלחות.
    4. לאחר שאישרת את gelation, להוסיף 2 מ"ל של מדיום העליון של הוספה ו- 3 מ"ל בתחתית הבאר. תקופת דגירה המטריצה של fibroblasts וקולגן ב 37 ° C עם 5% CO2 של 5-7 ימים, עד gelation השלמת, עוד חוזים.
    5. לאחר gelation השלם, לנתק את keratinocytes נגזר iPSC (מתוך שלב 1.3.6) באמצעות EDTA. להוסיף 1 מ"ל של EDTA, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 כי 2 דק לקצור את התאים מנותקת, לספור אותם באמצעות hemocytometer להעביר עונה 1 פרק 106 תאים צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 250 x g למשך 2 דקות.
    6. הסר את תגובת שיקוע, resuspend עונה 1 פרק 106 תאים ב- 50-100 µL של סידן נמוכה בינונית האפיתל 1 (EP1).
    7. האחות בינוני כל המטריצה (ראה שלב 2.1.5) ואת הזרעים עונה 1 פרק 106 תאים של keratinocytes iPSC, נגזר על כל שכבה פיברובלסט. דגירה את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO2 למשך 30 דקות.
      שים לב: אל תזיז את הצלחת, אל תוסיף בכל מדיום עבור ההחזקה של תקין.
    8. להוסיף 2 מיליליטר EP1 העליון של הקדמי של 3 מ"ל של EP1 בתחתית הבאר.
    9. לאחר יומיים, תשאף בינוני כל בצלחת הוספה ממברנה ושנה המדיום נורמלי סידן EP2 במשך יומיים.
    10. לאחר יומיים, תשאף בינוני כל ולהוסיף 3 מ"ל של המדיום התקרנות רק לתחתית כדי ליצור ממשק אוויר נוזלי.
    11. לשמור על תא צורב את העור 3D עד 14 ימים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולשנות את המדיום בכל יום אחר. הקציר תא צורב את העור תלת-ממדי על ידי חיתוך קצה תותב, ולהשתמש בו מחקר נוסף של צביעת ואת השתלת עור.
  2. השתלת עור
    1. לבצע אינהלציה הרדמה על הנד/scid עכברים (זכר, בן 6 שבועות), באמצעות שיטה סטנדרטית, שאושר כמוסד. על השתלים, לגלח את הפרווה של העור הגבי של העכבר בכל.
    2. להסיר מקטע 1 ס"מ x 2 ס"מ של העור של העכבר, באמצעות מספריים מעוגלים עם מלקחיים.
    3. מקם את תא צורב CBMC iPSC-נגזר העור 3D פגם באתר ועל התפר באמצעות שיטה העניבה מעל רוטב עם התפרים משי.
    4. להתבונן העכברים 2 שבועות, להקריב אותם לבדיקה היסטולוגית. פרוטוקול מכתימים אומתה מחקרים קודמים16.

תוצאות

העור מורכב, ברוב המקרים, ושל האפידרמיס הדרמיס. Keratinocytes הן סוג התא העיקרי של האפידרמיס, fibroblasts הם סוג התא העיקרי של הדרמיס. התכנית של בידול תקין מוצג איור 1א'. CBMC-iPCSc היו מתוחזקים מאכל מצופה vitronectin (איור 1B). במחקר זה, אנחנו הבדיל CBMC-iPSCs לתוך keratinocyt...

Discussion

IPSCs האנושי שהוצעו אלטרנטיבה חדשה עבור רפואה רגנרטיבית אישית17. החולה נגזר iPSCs אישית משקפים את מאפייני המטופל יכול לשמש עבור מידול המחלה, והתרופות הקרנה עצמיים השתלת18,19. השימוש iPSCs נגזר החולה יכול גם להתגבר על בעיות לגבי ראשי תאים, חוסר מספרי הטלפ?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של קוריאה בריאות טכנולוגיית R & D הפרוייקט, משרד הבריאות, הרווחה, ענייני משפחה, הרפובליקה של קוריאה (H16C2177, H18C1178).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AdenineSigmaA2786Component of differentiation medium for fibroblast
AggreWell Medium (EB formation medium)STEMCELL05893EB formation
Anti-Fibronectin antibodyabcamab23750Fibroblast marker
Anti-KRT14 antibodyabcamab7800Keratinocyte marker
Anti-Loricrin antibodyabcamab85679Stratum corneum marker
Anti-p63 antibodyabcamab124762Keratinocyte marker
Anti-Vimentin antibodySanta cruzsc-7558Fibroblast marker
BAND AID FLEXIBLE FABRICJohnson & Johnson-Bandage
Basement membrane matrix (Matrigel)BD354277Component of differentiation medium for fibroblast
BLACK SILK sutureAILEEESK617Skin graft
CaCl2SigmaC5670Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Collagen type IBD3542363D skin organoid
Collagen type IVSanta-cruzsc-29010Component of differentiation medium for keratinocyte
Defined keratinocyte-Serum Free MediumGibco10744-019Component of differentiation medium for keratinocyte
DMEM, high glucoseGibco11995065Component of differentiation medium
DMEM/F12 MediumGibco11330-032Component of differentiation medium
Essential 8 mediumGibcoA1517001iPSC medium
FBS, QualifiedCorning35-015-CVComponent of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Glutamax Supplement Gibco35050061Component of differentiation medium for fibroblast
InsulinInvtrogen12585-014Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Iris standard curved scissorProfessionalPC-02.10Surgical instrument
Keratinocyte Serum Free MediumGibco17005-042Component of differentiation medium for keratinocyte
L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrateSigmaA8960Component of differentiation medium for keratinocyte
MEM Non-Essential Amino AcidGibco1140050Component of differentiation medium for fibroblast
Meriam Forceps Thumb 16 cmHIROSEHC 2265-1Surgical instrument
NOD.CB17-Prkdc SCID/JThe Jackson Laboratory001303Mice strain for skin graft
Petri dish 90 mmHyundai MicroH10090Plastic ware
Recombinant Human BMP-4R&D314-BPComponent of differentiation medium for keratinocyte
Recombinant human EGF proteinR&D236-EGComponent of differentiation medium for keratinocyte
Retinoic acidSigmaR2625Component of differentiation medium for keratinocyte
T/C Petridish 100 mm, 240/bxTPP93100Plastic ware
TransferrinSigmaT3705Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Transwell-COL collagen-coated membrane inserts CorningCLS3492Plastic ware for 3D skin organoid 
VitronectinLife technologiesA14700iPSC culture
Y-27632 Dihydrochloridepeprotech1293823iPSC culture

References

  1. Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
  2. Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'etre" of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
  3. Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
  4. Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
  5. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  6. Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
  7. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
  8. Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
  9. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  10. Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
  11. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  12. Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
  13. Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
  14. Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
  15. Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008)
  16. Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
  17. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
  18. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  19. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  20. Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
  21. Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
  22. Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
  23. Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
  24. Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
  25. Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
  26. Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
  27. Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
  28. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
  29. Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
  30. Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
  31. Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
  32. Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 2 (4), 137 (2014).
  33. Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
  34. Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

146pluripotenthumanized

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved